BAB I

PENDAHULUAN

Sepsis neonatarum adalah sepsis yang terjadi pada bayi dalam satu bulan pertama

kehidupan. Sepsis neonatorum merupakan salah satu penyebab utama morbiditas

dan mortalitas, meskipun sudah terdapat kemajuan dalam higienitas, penggunaan

alat diagnostik tercanggih serta anti mikroba yang terbaru dan potensial.1

World Health Organization (WHO) memperkirakan setiap tahunnya

terjadi lima juta kematian neonatus dan 98% terjadi di negara berkembang. Angka

kematian neonatal akibat sepsis neonatal di negara berkembang adalah 34 per

1000 kelahiran hidup, terutama terjadi pada minggu pertama kehidupan,

sedangkan di negara maju angka kejadian sepsis neonatal hanya 5 per 1000

kelahiran hidup.2

Di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo (RSCM) dalam periode Januari-

September 2005, angka kejadian sepsis neonatal 13,68% dari seluruh kelahiran

hidup dengan tingkat kematian 14,8%.2 Berdasarkan data rekam medis

RS.dr.M.Djamil Padang tahun 2010, angka kejadian sepsis neonatorum yang

dirawat di bagian perinatologi dan NICU sebanyak

Sepsis neonatorum merupakan komplikasi serius dan menakutkan

terutama pada bayi berat badan lahir sangat rendah dan bayi prematur.4 Sepsis

neonatorum ditatalaksana dengan pemberian antibiotik. Resistensi antibiotik

global yang timbul dan ketidakmatangan sistem imunitas pada neonatus

mengharuskan untuk penggunaan imunomodulator untuk meningkatkan imunitas

host dan dapat digunakan untuk mengatasi sepsis pada neonatus bersamaan

dengan antibiotik. 5,6,7,8

1

Laktoferin adalah protein berikatan besi, yang merupakan bagian dari

kelompok protein transferrin, dan berfungsi untuk membawa besi di dalam darah.

Laktoferin diproduksi oleh sel epitel mukosa berbagai spesies mamalia, termasuk

manusia. Laktoferin juga ditemukan dalam granul neutrophil sekunder. Laktoferin

memiliki afinitas pengikatan besi yang kuat dan merupakan bagian dari sistem

imunitas bawaan.1

Laktoferin bersifat memiliki peranan penting pada beberapa fungsi

patofisiologis, seperti: regulasi absorpsi besi di dalam usus,imunomodulator,

antioksidan, dan antiinflamasi, serta proteksi terhadap infeksi mikroba, yang

merupakan fungsi terbanyak dipelajari hingga saat ini. Aktivitas antimikroba

laktoferin berlangsung terutama melalui dua mekanisme, pengikatan besi di lokasi

infeksi dan interaksi langsung dengan agen infeksiushemostasis zat besi,

morfogenesis organ, pertahanan tubuh terhadap infeksi, inflamasi dan kanker.10.

Aktivitas biologis dan fungsi laktoferin tersebut penting dalam pencegahan dan

tatalaksana sepsis neonatorum.10,11

Sari pustaka ini akan membahas peran dan fungsi laktoferin pada sepsis

neonatorum.

BAB II

2

SEPSIS NEONATORUM

2.1 Definisi

Sepsis neonatorum adalah merupakan sindroma klinis dari penyakit sistemik

akibat infeksi selama satu bulan pertama kehidupan.1 Bakteri, virus, jamur, dan

protozoa dapat menyebabkan sepsis bayi baru lahir.13

Definisi SIRS (Systemic inflammatory response syndrome) dan sepsis

pada anak telah dijabarkan pada International Concensus Conference on

Pediatric Sepsis tahun 2002, namun definisi ini tidak digunakan pada literatur

neonatus. Pada tahun 2004 diajukan usulan kriteria diagnosis sepsis pada

neonatus seperti tertera pada tabel 2.1 14

Tabel 2.1. Kriteria diagnosis sepsis pada neonatus 14

Variabel klinis Suhu tubuh tidak stabil Laju nadi > 180 kali/menit, < 100 kali/menit Laju nafas > 60 kali/menit, dengan retraksi atau desaturasi oksigen Letargi Intoleransi glukosa ( plasma glukosa > 10 mmol/L ) Intoleransi minum

Variabel hemodinamik TD < 2 SD menurut usia bayi TD sistolik < 50 mmHg ( bayi usia 1 hari ) TD sistolik < 65 mmHg ( bayi usia < 1 bulan )

Variabel perfusi jaringan Pengisian kembali kapiler > 3 detik Asam laktat plasma > 3 mmol/L

Variabel inflamasi Leukositosis ( > 34.000/ml) Leukopenia ( < 5.000/ml) Neutrofil muda > 10% Neutrofil muda/total neutrofil ( I/T ratio ) > 0,2 Trombositopenia <100000/ml C Reactive Protein > 10 mg/dL atau > 2 SD dari nilai normal Procalcitonin > 8,1 mg/dL atau > 2 SD dari nilai normal IL-6 atau IL-8 >70 pg/mL 16 S rRNA gen PCR : positif

2.2. Klasifikasi dan Etiologi

3

Berdasarkan waktu terjadinya, sepsis neonatorum dapat diklasifikasikan

menjadi dua bentuk yaitu sepsis neonatorum awitan dini (SAD) dan sepsis

neonatorum awitan lambat (SAL).1

Sepsis awitan dini merupakan infeksi perinatal yang terjadi segera

dalam periode postnatal (kurang dari 72 jam) dan biasanya diperoleh pada

saat proses kelahiran atau in utero. Kuman penyebab tersering yang

ditemukan pada kasus SAD di negara maju adalah Streptokokus Grup B (SGB)

(>40%kasus), Escherichia coli, Haemophilus influenza, dan Listeria

monocytogenes, sedangkan di negara berkembang termasuk Indonesia,

mikroorganisme penyebabnya adalah batang Gram negatif.15

Sepsis awitan lambat merupakan infeksi postnatal (lebih dari 72 jam)

yang diperoleh dari lingkungan sekitar atau rumah sakit (infeksi

nosokomial).1 Proses infeksi ini disebut juga infeksi dengan transmisi

horizontal.15Coagulase-negative Staphilococci (CoNS) dan Candida albicans

merupakan penyebab utama SAL, sedangkan di negara berkembang

didominasi oleh mikroorganisme batang Gram negatif (E. coli, Klebsiella,

dan Pseudomonas aeruginosa.15. Patogenesis, gejala klinis dan tatalaksana dari

kedua bentuk sepsis tersebut tidak banyak berbeda. 16

2.3. Perjalanan penyakit infeksi pada neonatus

Selama dalam kandungan, janin relatif aman terhadap kontaminasi kuman

karena terlindung oleh berbagai organ tubuh seperti plasenta, selaput

amnion, korion, dan beberapa faktor anti infeksi pada cairan amnion.

Walaupun demikian kemungkinan kontaminasi kuman dapat timbul melalui

berbagai jalan yaitu: 17

4

1. Infeksi kuman, parasit atau virus yang diderita ibu dapat mencapai janin

melalui aliran darah menembus barier plasenta dan masuk sirkulasi janin.

2. Prosedur obstetri yang kurang memperhatikan faktor asepsis dan antisepsis.

Paparan kuman pada cairan amnion saat prosedur dilakukan, akan

menimbulkan amnionitis dan pada akhirnya terjadi kontaminasi kuman pada

janin.

3. Pada saat ketuban pecah, paparan kuman yang berasal dari vagina akan lebih

berperan dalam infeksi janin. Pada keadaan ini kuman vagina masuk ke dalam

rongga uterus dan neonatus dapat terkontaminasi kuman melalui saluran

pernafasan ataupun saluran cerna. Kejadian kontaminasi kuman pada neonatus

yang belum lahir akan meningkat apabila ketuban telah pecah lebih dari 18-24

jam.

Kontaminasi kuman setelah lahir, terjadi dari lingkungan neonatus baik karena

infeksi silang ataupun karena alat-alat yang digunakan contohnya neonatus

yang mendapat prosedur neonatal invasif seperti kateterisasi umbilikal, neonatus

dalam ventilator yang kurang memperhatikan tindakan asepsis, rawat inap

yang terlalu lama dan hunian terlalu padat.17

Infeksi bukan merupakan keadaan yang statis, terdapatnya pathogen dalam

darah (bakterimia, viremia) dapat menimbulkan keadaan yang berkelanjutan dari

infeksi ke sepsis, sepsis berat, syok septik, kegagalan multi organ dan akhirnya

kematian. (lihat table 2.2)14

Tabel 2.2 : Perjalanan infeksi pada neonatus14

5

Bila ditemukan dua atau lebih keadaan:

Laju nafas >60x/m dengan/tanpa

retraksi dan desaturasi O2

Suhu tubuh tidak stabil (<36ºC atau

>37.5ºC)

Waktu pengisian kapiler > 3 detik

Hitung leukosit <4000x109/L atau

>34000x109/L

CRP >10mg/dl

IL-6 atau IL-8 >70pg/ml

16 S rRNA gene PCR : Positif

SIRS/FIRS

Terdapat satu atau lebih kriteria FIRS

disertai dengan gejala klinis infeksi

Sepsis

Sepsis disertai hipotensi dan disfungsi

organ tunggal

Sepsis berat

Sepsis berat disertai hipotensi dan

kebutuhan resusitasi cairan dan obat-obat

inotropic

Syok septik

KEMATIAN

2.4. Patogenesis Sepsis Neonatorum

Neonatus terutama preterm relatif bersifat immunocompromised karena

immaturitas dari sistem imun. Penelitian yang membandingkan fungsi imunitas

bawaan antara dewasa dan neonatus menunjukkan bahwa neonatus memiliki

kemampuan yang rendah memproduksi sitokin inflamasi, terutama Tumor

necrosis factor (TNF) dan interleukin 6 (IL-6), selain itu produksi IL-10

meningkat, yang menghambat sintesis sitokin pro-inflamasi dengan sendirinya.

Fungsi netrofil dan sel dendritik juga rendah, menunjukkan rendahnya aktivitas

adhesi molekul dan rendahnya respon terhadap faktor kemotaksis. Sel dendritik

6

memiliki kapasitas yang rendah dalam produksi IL-12 dan interferon gamma.

Rendahnya produksi sitokin pada neonatus menyebabkan penurunan aktivitas sel

natural killer (NK-cell). Ketidakseimbangan sistem imun bawaan pada neonatus

menyebabkan peningkatan kemungkinan infeksi pada populasi ini.18,19,20

Respon sistem imun didapat pada neonatus lebih lambat terhadap paparan

antigen, saat neonatus pindah dari lingkungan steril ke lingkungan

mikroorganisme berkoloni. Kadar imunoglobulin G (IgG) maternal tranplasental

pada neonatus berbeda sesuai dengan usia kehamilan, dan memiliki keterbatasan

kemampuan respon terhadap pathogen. Imunoglobulin G maternal ditranspor ke

janin paling sedikit pada trimester pertama kehamilan, 10 % pada minggu 17-22

dan 50% pada minggu 28-32 kehamilan, sehingga neonatus preterm memiliki

imunitas humoral yang kurang adekuat dalam perlindungan terhadap infeksi.

Kadar komplemen pada neonatus hanya 50% dibandingkan kadar komplemen

dewasa, sehingga menyebabkan gangguan keseimbangan dan opsonisasi dalam

melawan infeksi.19,20

Sepsis terjadi akibat interaksi yang kompleks antara patogen dengan pejamu,

meskipun memiliki gejala klinis yang sama, proses molekular dan selular

yang memicu respon sepsis berbeda tergantung dari mikroorganisme

penyebab, sedangkan tahapannya sama dan tidak bergantung pada organisme

penyebab.17 Patogenesis sepsis terdiri dari aktivasi inflamasi, aktivasi koagulasi,

dan gangguan fibrinolisis, hal ini mengganggu homeostasis antara mekanisme

prokoagulasi dan antikoagulasi.18,21

7

Gambar 2.1: Gangguan homeostasis pada sepsis21

Respon sepsis terhadap bakteri Gram negatif dimulai dengan pelepasan

lipopolisakarida (LPS), yaitu endotoksin dari dinding sel bakteri.

Lipopolisakarida merupakan komponen penting pada membran luar bakteri Gram

negatif dan memiliki peranan penting dalam menginduksi sepsis.

Lipopolisakarida mengikat protein spesifik dalam plasma yaitu lipoprotein

binding protein (LPB), selanjutnya kompleks LPS-LPB ini berikatan dengan

CD14, yaitu reseptor pada membran makrofag. CD14 akan mempresentasikan

LPS kepada Toll-like receptor 4 (TLR4) yaitu reseptor untuk transduksi sinyal

sehingga terjadi aktivasi makrofag.18,21

Bakteri Gram positif, jamur dan virus dapat menimbulkan infeksi

melalui dua mekanisme, yakni dengan menghasilkan eksotoksin yang bekerja

sebagai superantigen dan melepaskan fragmen dinding sel yang merangsang

sel imun.18,21 Semua organisme diatas, memicu kaskade sepsis yang dimulai

dengan pelepasan mediator inflamasi sepsis. Mediator inflamasi primer

dilepaskan dari sel-sel akibat aktivasi makrofag. Pelepasan mediator ini akan

mengaktivasi sistem koagulasi dan komplemen.18,21

8

Gambar. 2.2. Kaskade sepsis 21

Infeksi akan dilawan oleh tubuh, baik melalui sistem imunitas selular yang

meliputi monosit, makrofag, dan netrofil serta melalui sistem imunitas

humoral dengan membentuk antibodi dan mengaktifkan jalur komplemen.

Pengenalan patogen oleh CD14 dan TLR-2 serta TLR-4 di membran monosit

dan makrofag akan memicu pelepasan sitokin untuk mengaktifkan sistem

imunitas selular. Pengaktifan ini menyebabkan sel T akan berdiferensiasi

menjadi sel T helper-1(Th1) dan sel T helper-2 (Th2). Sel Th1 mensekresikan

sitokin proinflamasi seperti tumor necrosis factor (TNF), interferon γ (IFN- γ),

interleukin 1-β (IL-1β), IL-2, IL-6 dan IL-12 . Sel Th2 mensekresikan sitokin

antiinflamasi seperti IL-4, -10, dan -13. Pembentukan sitokin proinflamasi

dan anti inflamasi diatur melalui mekanisme umpan balik yang kompleks. 17,18,21

9

Sitokin proinflamasi terutama berperan menghasilkan sistem imun untuk

melawan kuman penyebab, namun demikian pembentukan sitokin proinflamasi

yang berlebihan dapat membahayakan dan dapat menyebabkan syok,

kegagalan multi organ serta kematian. Sitokin anti inflamasi berperan penting

untuk mengatasi proses inflamasi yang berlebihan dan mempertahankan

keseimbangan agar fungsi organ vital dapat berjalan dengan baik.36 Sitokin

proinflamasi juga dapat mempengaruhi fungsi organ secara langsung atau secara

tidak langsung melalui mediator sekunder (nitric oxide, tromboksan, leukotrien,

platelet activating factor (PAF), prostaglandin), dan komplemen. Kerusakan

utama akibat aktivasi makrofag terjadi pada endotel dan selanjutnya akan

menimbulkan migrasi leukosit serta pembentukan mikrotrombi sehingga

menyebabkan kerusakan organ.17,21

Efek kumulatif kaskade sepsis adalah keadaan tanpa keseimbangan.

inflamasi dominan terhadap anti inflamasi dan koagulasi dominan terhadap

fibrinolisis sehingga terjadi thrombosis mikrovaskuler, hipoperfusi, iskemia,dan

kerusakan jaringan. Sepsis berat, syok septik, kegagalan multi organ dapat terjadi

dan akhirnya kematian.17

2.5. Faktor Risiko dan Gambaran klinis

Sepsis neonatorum dipengaruhi oleh faktor risiko dari ibu, bayi dan daya

virulensi atau infeksius organisme pada sepsis awitan dini dan lanjut.1,3

Tabel.2.3. Faktor resiko sepsis neonatorum1

10

Sumber Faktor resiko

Sepsis awitan dini Kolonisasi bakteri maternalKhorioamnionitisKetuban pecah diniPecah ketuban lebih dari 18 jamInfeksi saluran kemih ibuKehamilan gandaPersalinan preterm(<37 minggu)

Sepsis awitan lanjut Perlukaan pada berrier alami tubuh (kulit dan mukosa)Penggunaan kateter pembuluh darah yang lamaProsedur invasiveNECPenggunaan antibiotic lama

Neonatal PrematuritasPenurunan pasase immunoglobulin dan antibody spesifik maternalFungsi sistem imun yang immature

Gambaran klinis pasien sepsis neonatus tidak spesifik. Gejala sepsis klasik

yang ditemukan pada anak jarang ditemukan pada neonatus, namun keterlambatan

dalam menegakkan diagnosis dapat berakibat fatal bagi kehidupan neonatus.

Gejala klinis yang terlihat sangat berhubungan dengan karakteristik kuman

penyebab dan respon tubuh terhadap masuknya kuman. 1,2,3

Janin yang terkena infeksi akan menderita takikardia, lahir dengan

asfiksia dan memerlukan resusitasi karena nilai Apgar rendah, setelah lahir

neonatus tampak lemah dan tampak gambaran klinis sepsis seperti

hipo/hipertermia, hipoglikemia dan kadang-kadang hiperglikemia, selanjutnya

akan terlihat berbagai kelainan dan gangguan fungsi organ tubuh. Gambaran

klinis susunan saraf pusat (letargi, refleks hisap buruk, menangis lemah

kadang-kadang terdengar high pitch cry, bayi menjadi iritabel dan dapat

disertai kejang), kelainan kardiovaskular (hipotensi, pucat, sianosis, dingin dan

11

clummy skin). Neonatus dapat pula memperlihatkan kelainan hematologik,

gastrointestinal ataupun gangguan respirasi (perdarahan, ikterus, muntah,

diare, distensi abdomen, intoleransi minum, waktu pengosongan lambung

yang memanjang, takipnea, apnea, merintih dan retraksi).1,2

Pemeriksaan biakan darah merupakan baku emas dalam menentukan

diagnosis sepsis. Pemeriksaan ini mempunyai kelemahan karena hasil biakan

baru akan diketahui dalam waktu minimal 3-5 hari, oleh sebab itu dalam

perkembangan penelitian didapatkan berbagai petanda sepsis dengan spesifisitas

dan sensitivitas yang berbeda-beda.22,23 Studi kepustakaan yang dilakukan Ng

et.al berbagai petanda sepsis tersebut dan mengemukakan sejumlah petanda

infeksi yang sering dipakai sebagai penunjang diagnosis sepsis pada neonatus

dan bayi prematur (tabel 2.4).24

Tabel 2.4. Pemeriksaan petanda infeksi untuk neonatus dan neonatus prematur24

Hematologic testTotal white blood cell countTotal neutrophil countImmature neutrophil countImmature/total neutrophil ratioNeutrophil morphology: vacuolisation, toxic granulations, Do¨hlebodies, intracellular bacteriaPlatelet count

12

Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)D-dimerFibrinogenThrombin-antithrombin III complex (TAT)Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)Plasminogen tissue activator (tPA)

Acute phase proteins and other proteinsa1 AntitrypsinC Reactive protein (CRP)FibronectinHaptoglobinLactoferrinNeopterinOrosomucoidProcalcitonin (PCT)Components of the complement systemC3a-desArgC3bBbPsC5b-9

Chemokines, cytokines and adhesion moleculesInterleukin (IL)1b, IL1ra, IL2, sIL2R, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10Tumour necrosis factor a (TNFa), 11sTNFR-p55, 12sTNFR-p75Interferon c (IFNc)E-selectinL-selectinSoluble intracellular adhesion moleucule-1 (sICAM-1)Vascular celladhesion molecule-1 (VCAM-1)

Cell surface markersNeutrophil Lymphocyte MonocyteCD11b CD3 HLA-DRCD11c CD19CD13 CD25CD15 CD26CD33 CD45ROCD64 CD69CD66b CD71

Others

LactateMicro-erythrocyte sedimentationSuperoxide anion (respiratory burst)

BAB III

LAKTOFERIN

Laktoferin adalah protein non heme yang berikatan dengan zat besi, yang

merupakan bagian dari kelompok keluarga transferrin, bersamaan dengan serum

13

transferrin, ovotransferin, melanotransferrin dan Carbonic anhydrase inhibitors .

25,26

3.1. Susunan dan struktur laktoferin

.Laktoferin adalah glikoprotein dengan berat molekul ± 80 kDa disertai afinitas

yang tinggi terhadap zat besi. Struktur molekul dan asam amino laktoferin dari

manusia ditemukan pada tahun 1960.27

Gambar 3.1. Struktur Laktoferin 25

Laktoferin terdiri dari rantai polipeptida tunggal mengandung 703 asam amino

yang terlipat menjadi dua lobus bulat. Lobus ini disebut daerah terminal C

(karboksi) dan N (amino), yang terhubung dengan heliks α. Setiap lobus terdiri

dari dua domain, yaitu C1, C2, N1, dan N2. Domain mempunyai satu tempat

pengikatan besi di setiap lobus. Laktoferin mengandung sejumlah tempat untuk

glikosilasi potensial, terutama pada permukaan molekul. Sakarida yang paling

banyak adalah manosa, sekitar 3% adalah heksosa, dan 1 % heksosamin. Tingkat

glikosilasi bervariasi dan menentukan tingkat resistansin terhadap enzim protease

atau pH yang sangat rendah.27

14

Kemampuan laktoferin untuk mengikat besi dua kali lebih kuat dari

transferin. Dua ion ferri dapat diikat oleh satu molekul laktoferin, satu ion

karbonat selalu terikat dengan laktoferin bersama dengan setiap ion besi. Terdapat

tiga bentuk laktoferin menurut tingkat kejenuhan besi diantaranya apolaktoferin

(besi bebas), monoferin (satu ion ferri), dan hololaktoferin (mengikat dua ion

Fe3+). Terdapat empat residu asam amino untuk mengikat besi (histidin, dua

tirosin, dan asam aspartat) dan rantai arginin untuk mengikat ion karbonat.11,25,28

Laktoferin juga bisa berikatan dengan besi yang dilepaskan dari transferin.

Kemampuan untuk menjaga besi tetap terikat bahkan pada pH rendah sangatlah

penting, terutama di lokasi infeksi dan peradangan, karena akibat metabolisme

bakteri, pH bisa menurun di bawah.9,11 Laktoferin memiliki resistensi luar biasa

terhadap degradasi proteolitik oleh tripsin dan enzim serupa tripsin.27

Laktoferin mampu mengikat sejumlah senyawa dan zat lain seperti

lipopolisakarida, heparin, glikosaminoglikan, DNA, atau ion logam seperti Al3+,

GA3+, Mn3+, CO3+, Cu2+, dan Zn2+ dengan afinitasnya jauh lebih rendah, selain

CO2-, laktoferin dapat mengikat berbagai anion seperti oksalat, karboksilat, dan

lainnya. Laktoferin bisa mempengaruhi metabolisme dan distribusi berbagai

zat.9.11,25,27

3.2. Sumber dan Sintesis Laktoferin

Laktoferin diproduksi oleh sel epitel mukosa berbagai spesies mamalia termasuk

manusia (human lactoferin), sapi (bovine lactoferin), kambing, kuda, dan

beberapa rodentia. Penelitian terbaru menggunakan teknik molekular biologis

menyatakan bahwa laktoferin juga diproduksi oleh ikan. Talactoferrin adalah

15

rekombinan human lactoferin diproduksi secara komersial menggunakan

Aspergillus. Laktoferin sintetik ini digunakan untuk terapi kanker, tapi secara

invitro menunjukkan aktivitas melawan candida dan Staphylococcus.9,11,25

Suplementasi laktoferin telah cukup banyak diteliti. Suplementasi

laktoferin tersedia dalam bentuk pemberian per oral. Suplementasi laktoferin

diberikan sebagai fortifikasi pada susu formula dan penelitian terbaru

menunjukkan efek suplementasi bovine laktoferin pada neonatus preterm untuk

pencegahan infeksi serta laktoferin digunakan sebagai adjuvant pada vaksin

BCG.9.11

Laktoferin ditemukan di permukaan mukosa, kolostrum (7g/l) dan ASI

matur (1g/l), air mata (3.8 g/l), saliva (20mg/l) dan granul sekunder neutrophil.

Kadar pada serum manusia adalah 0.4-2 mg/l dan bisa meningkat sampai 200

mg/l. Konsentrasi laktoferin tertinggi adalah di dalam ASI dan kolostrum

dibandingkan cairan biologis lain.25,26,27,28Air Susu Ibu dari ibu yang melahirkan

preterm mengandung kadar laktoferin yang kurang dibandingkan dengan yang

melahirkan aterm. Kadar konsentrasi laktoferin dalam ASI ibu neonatus preterm

dan keterbatasan kemampuan menyusu menyebabkan neonatus preterm relatif

lebih sedikit menerima asupan laktoferin pada minggu pertama kehidupannya,

dimana merupakan waktu paling berisiko terkena infeksi. 9,6

Sel utama yang terlibat dalam sintesis laktoferin adalah sel dari seri mieloid dan

sel epitel sekretoris. Ekspresi laktoferin pertama dapat dideteksi dalam dua dan

empat sel embrio selama perkembangan embrio, yaitu tahap blastokista sampai

implantasi dan bukan saat implantasi sampai pertengahan kehamilan. Regulasi

sintesis laktoferin tergantung pada jenis sel yang memproduksinya. Kelenjar

16

eksokrin terus menerus memproduksi dan mengeluarkan laktoferin. Laktoferin

disintesis dalam netrofil selama diferensiasi (ketika promielosit berkembang

menjadi mielosit) dan kemudian disimpan di dalam granul. Laktoferin sebagian

besar disimpan di dalam granul tertentu (sekunder). Konsentrasi laktoferin yang

lebih rendah juga dapat ditemukan di dalam butiran tersier.9,11,25,26,27

Faktor-faktor yang dapat menyebabkan kenaikan laktoferin yaitu

leukositosis yang berhubungan dengan kehamilan, peningkatan selektif laktoferin

di dalam granul neutrofil, atau organ lain seperti endometrium, desidua, dan

kelenjar susu. Konsentrasi laktoferin pada darah juga dapat meningkat selama

infeksi, inflamasi, asupan besi yang berlebihan, atau pertumbuhan tumor. 9,11,25,26,27

3.3. Metabolisme Laktoferin

Ada dua cara menghilangkan laktoferin, yaitu endositosis sel fagosit melalui

reseptor (makrofag, monosit, dan sel lainnya dalam sistem retikuloendotelial)

dengan transfer besi atau pengambilan langsung melalui hati. Ginjal terlibat dalam

hilangnya laktoferin karena laktoferin dan fragmennya ditemukan dalam urin

neonatus yang diberi ASI. 25,26,27

Lactofericin adalah sebuah kationik peptida yang dihasilkan oleh

metabolisme pepsin dari laktoferin, memiliki aktivitas bakterisidal lebih kuat

daripada protein asli.28,29,30

3.4. Fungsi laktoferin

Seiring dengan banyaknya penelitian telah yang dilakukan terhadap laktoferin,

didapatkan banyak manfaat dari laktoferin. Laktoferin dengan struktur, cara

kerjanya di tubuh bisa berfungsi sebagai absorbsi besi, faktor transkripsi sel, peran

17

pertahanan sistem imun, prokoagulan, anti bakterial, anti fungal, anti inflamasi,

anti viral dan sebagainya. 9,11,25,26,27

Gambar 3.2. Fungsi laktoferin29

BAB IV

LAKTOFERIN PADA SEPSIS NEONATORUM

4.1. Laktoferin dan regulasi imunologi

Neonatus memiliki sistem pertahanan tubuh yang masih belum berkembang dan

memiliki resiko tinggi untuk terjadinya infeksi. Laktoferin memiliki banyak

fungsi dan merupakan kunci penting pada beberapa proses imun. Laktoferin

seperti banyak imunomodulator lain, memainkan peran yang komplek dalam

kaskade sistem imun. Laktoferin ditemukan memiliki aksi modulasi pada sistem

18

imun. Laktoferin meransang maturasi precursor sel T menjadi sel helper

imunokompeten dan meransang diferrensiasi sel B imatur menjadi antigen

presenting cell (APC) efisien.26,27,31

Gambar 4.1. Laktoferin dalam reaksi imunitas bawaan dan didapat 26

Laktoferin meransang regulasi antigen leucocyte function associated-1 (LFA-1)

pada limfosit darah perifer manusia, selain itu laktoferin menambah respon

hipersensitivitas tipe lambat pada antigen spesifik dan mampu menginduksi cell

imediated imunity (CMI) pada hewan coba, sehingga laktoferin merupakan bagian

yang integral dalam cytokine induce cascade selama proses infeksi yang

menyebabkan gangguan metabolisme.32

19

.

Gambar 4.2: Efek modulasi laktoferin pada inflamasi akut32

Suatu keadaan berupa infeksi mediator toksik atau trauma menyebabkan aktivasi

monosit dan sistem makrofag serta meransang produksi IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-

CSF dan NO, yang dapat menyebabkan aktivasi netrofil dalam sirkulasi dan

meransang produksi netrofil baru dan makrofag dari sumsum tulang. Netrofil

yang teraktivasi mengalami degranulasi pada lokasi inflamasi dan melepaskan

sejumlah besar mediator skunder termasuk laktoferin.12,32

Laktoferin adalah komponen penting sistem pertahanan non spesifik

menyerang berbagai organisme pathogen. Konsentrasinya dalam plasma dalam

keadaan normal rendah (0,2-0,6 µg/ml) dan meningkat transien pada keadaan

yang menginduksi aktivasi netrofil. Sehingga kadar tinggi laktoferin di plasma

dapat dijadikan indicator prediktor sepsis yang berhubungan dengan morbiditas

dan mortalitas.12,32

Laktoferin dapat mencegah peradangan dan kerusakan jaringan lebih

lanjut akibat pelepasan sitokin pro-inflamasi dan oksigen reaktif. Efek

20

perlindungan laktoferin terlihat dalam penurunan produksi beberapa sitokin pro-

inflamasi seperti tumor necrosis factor (TNFa) atau interleukin IL-1β dan IL-6.

Sejumlah peningkatan interleukin IL-10 juga telah dilaporkan.31

4.2. Laktoferin dan metabolisme besi

Konsentrasi laktoferin yang lebih tinggi dan avaibilitas besi di ASI daripada susu

sapi memperkuat hipotesis bahwa laktoferin membantu absorpsi besi pada bayi

yang mendapatkan ASI. Ini dikaitkan dengan penyerapan besi yang lebih baik

pada neonatus yang medapatkan ASI dibandingkan yang mendapatkan susu

formula.27 Peranan laktoferin dalam meningkatkan penyerapan besi masih

kontroversi, hal ini dapat disebabkan oleh mekanisme sebagai berikut: 11

1. Kemampuan enterosit mengekstraksi besi dari laktoferin

2. Ambilan laktoferin yang tinggi oleh enterosit

3. Korelasi dari ekskresi besi melalui urin neonatus dengan kandungan ASI

juga dengan ambilan ASI.

4. Transport besi melewati batas brush border usus oleh laktoferin

5. Akumulasi besi dari laktoferin di vesikel membrane brush border.

Laktoferin bisa mempengaruhi mekanisme seluler melalui pengaruhnya dalam

avaibilitas besi. Reseptor spesifik (SI-LfR) pada enterosit memediasi pengikatan

laktoferin, setelah laktoferin terikat pada enterosit, 90% di antaranya dirusak dan

ion Fe3+ dilepaskan, 10% yang tersisa utuh kemudian diangkut melalui membran

sel. Kurangnya zat besi intrasel bisa meningkatan ekspresi reseptor spesifik pada

permukaan enterosit, kemudian meningkatkan penyerapan laktoferin terikat besi.11

Kemampuan laktoferin dalam mengikat ion Fe3+ cukup berperan dalam

sifat biologis lainnya. Besi mempengaruhi sejumlah fungsi sel, seperti DNA,

21

sintesis RNA dan protein, ekspresi marker permukaan limfosit, sekresi

immunoglobulin, dan ekspresi reseptor interleukin-2 sehingga laktoferin secara

tidak langsung mempengaruhi berbagai aktivitas fisiologis.11

Sifat laktoferin yang mengikat besi bebas adalah mekanisme utama

aktivitas bakteriostatik laktoferin. Afinitasnya yang tinggi terhadap besi bebas di

tubuh menyebabkan besi dalam lingkungan pertumbuhan bakteri menjadi terbatas,

sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri.27,28,29

Bukti menunjukkan bahwa pada SIRS dan sepsis terjadi produksi sitokin

proinflamasi, molekul adhesi, mediator vasoaktif dan reactive oxygen species

(ROS).14 Laktoferin dapat mengontrol keseimbangan produksi ROS dan tingkat

eliminasinya melalui pengikatan besi, sehingga melindungi sel dari kerusakan.

Stres oksidatif telah diimplikasikan pada banyak proses patologis dan kronis

degeneratif seperti kanker, atherosclerosis, inflamasi, penuaan, gangguan

neurodegeneratif dan pertahanan menyerang infeksi. 12,32

Gambar 4.3.Peran laktoferin pada produksi ROS32

22

Laktoferin berperan dalam mengkoordinasi produksi Fe3+ dan di transport ke

makrofag dari sistem retikuloendotelial, dimana Fe3+ dapat disimpan dalam

bentuk ferritin. Laktoferin mengurangi produksi reactive oksigen spesies (ROS)

seperti ion oksigen dan peroksida. Proses tersebut membutuhkan besi bebas untuk

sintesis, sehingga pengikatan besi dengan apolaktoferin mengurangi produksi

ROS tersebut. Produksi dan kontrol dari oksidan reaktif adalah proses kehidupan

integral yang penting untuk pertahanan spesies. Jika proses neutralisasi ROS tidak

efisien, dapat menyebabkan berkembangnya stress oksidatif.32

4.3. Proteksi laktoferin terhadap agen penyebab sepsis neonatorum

Laktoferin yang berada di permukaan mukosa salah satu sistem pertahanan

pertama terhadap agen mikroba yang menyerang jaringan mukosa. Laktoferin

mempengaruhi pertumbuhan dan proliferasi dari berbagai agen infeksi termasuk

bakteri baik Gram positif dan negatif, virus, protozoa, atau jamur.6,9,10,34

Menurut Roseanu, mekanisme antibakteri laktoferin masih kompleks dan

selain pengikatan besi, mekanisme ini juga melalui aksi langsung terhadap bakteri

dan/atau aktivasi sistem imun.9,31 Laktoferisin dan peptida lain derivat dari

laktoferin adalah agen antibakteri yang poten, dengan adanya interaksi dan

penetrasi ke membran bakteri, sehingga laktoferin dan peptida derivatnya adalah

komponen yang mampu melindungi inang dari infeksi bakteri yang berbahaya.9,28

Fungsi bakteriostatik laktoferin didasarkan pada kemampuannya untuk

mengambil ion Fe3+, membatasi penggunaan ion ini untuk bakteri di lokasi

infeksi, dan menghambat pertumbuhan organisme beserta ekspresi faktor

virulensinya. Fungsi bakterisidal laktoferin berkaitan dengan interaksi

langsungnya dengan permukaan bakteri. Laktoferin merusak membran luar

23

bakteri gram negatif melalui interaksi dengan LPS, menetralkan kemampuan LPS

untuk berinteraksi dengan TLR.11,27,29

Aktivitas bakterisidal terhadap bakteri Gram-positif dimediasi oleh

interaksi elektrostatik antara lapisan lipid yang bermuatan negatif dengan

permukaan laktoferin yangbermuatan positif, sehingga terjadi perubahan

permeabilitas membran. Mekanismenya adalah berdasarkan ikatan muatan positif

dengan molekul anion di permukaan bakteri, seperti asam lipoteikoat,

menyebabkan reduksi muatan negatif pada dinding sel dan kemudian membantu

kontak antara lisozim dan peptidoglikan yang memiliki efek enzimatis.29

Gambar 4.4. Mekanisme antibakteri laktoferin pada bakteri Gram positif (A) dan

bakteri Gram negatif (B)1

Laktoferin merusak membran luar bakteri gram negatif melalui interaksi dengan

LPS.Bagian terminal-N laktoferin bermuatan positif mencegah interaksi antara

LPS dengan kation bakteri (Ca2+ dan Mg2+), menyebabkan pelepasan LPS dari

dinding sel, meningkatan permeabilitas membran, dan merusak bakteri. Interaksi

laktoferin dengan LPS juga memperkuat antibakteri alamiah seperti lisozim, yang

disekresikan dari mukosa dalam konsentrasi yang meningkat bersama laktoferin.

24

Aktivitas laktoferin mengikat kalsium juga meransang pelepasan LPS, sehingga

LPS dapat dilepaskan bahkan tanpa kontak langsung dari laktoferin di permukaan

sel.27,29,33

Gambar 4.5.Mekanisme interaksi antara peptida antimikroba kationik dengan

dinding sel bakteri Gram negatif.29

Secara in vitro laktoferin mampu mencegah pembentukan biofilm Pseudomonas

aeruginosa. Kurangnya zat besi akan memaksa bakteri untuk berpindah sehingga

tidak akan menempel, selain itu aktivitas laktoferin memodifikasi motilitas

organisme melalui pengikatan komponen glikolisasi laktoferin yang dapat

mencegah penempelan bakteri dengan sel host. Aktivitas proteolitik laktoferin

menghambat pertumbuhan beberapa bakteri seperti Shigella flexneri atau E.coli

enteropatogenik melalui degradasi protein yang diperlukan untuk kolonisasi.27,33

Laktoferin berikatan dengan reseptor bakteri atau mikroorganisme lain

pada sel host melalui ikatan glikosaminoglicans. Melalui mekanisme inhibisi

kompetitif ini, laktoferin dapat mengurangi endositosis mikro organisme pada sel

25

host. Mekanisme ini terjadi pada beberapa strain E. coli yang bersifat entero

invasif dan Staphylococcus aureus.28,33

Aktivitas antifungal laktoferin pada Candida spp telah banyak diteliti. Hal

ini dikaitkan dengan kemampuan laktoferin dalam mengikat Fe 3+. Penelitian lain

menyatakan laktoferin bisa membunuh Candida albicans dan Candida krusei

dengan menggangu permeabilitas permukaan sel, seperti pada bakteri. Laktoferin

memiliki efek fungistatik melalui aktivitas N terminal asam amino peptide dari

laktoferin (laktofericin). Laktofericin memiliki aktivitas candidasidal yang poten

melalui stimulasi dari peningkatan potensial dan permeabilitas mitokondria

menyebabkan sintesis dan sekresi adenosine triphosphate reactive oxygen

oksidase dan menyebabkan kematian sel candida.34 Pengikatan Fe3+ oleh

apolaktoferin netrofil berkaitan dengan pertahanan terhadap Aspergillus

fumigatus.6,10

4.4. Proteksi Laktoferin pada mukosa saluran cerna

Translokasi bakteri dari saluran cerna adalah jalur yang penting dalam memulai

sepsis onset lambat dan enterokolitis nektrotikans (NEC) pada neonatus berat

badan lahir sangat rendah (BBLSR), bertambahnya mikrobiota intestinal,

gangguan epitel intestinal, masalah imunitas, dan nutrisi yang kurang optimal

(kurang mendapat ASI) berperan dalam memfasilitasi translokasi bakteri.6,19,35

Laktoferin berkontribusi dalam proliferasi dan differensiasi sel intestinal

yang meningkatkan fungsi barrier saluran cerna. Penelitian secara in vitro

terhadap mencit yang di induksi lipopolisakarida menunjukkan laktoferin menjaga

jaringan terhadap kerusakan selama terjadinya endotoksemia, sehingga laktoferin

berperan penting dalam pertahanan pada sepsis.9,32,34

26

Kemampuan untuk mengikat besi bebas merupakan efek bakteriostatik

dari laktoferin.28 Kurangnya zat besi akan menghambat pertumbuhan bakteri yang

tergantung besi seperti E. coli. Sebaliknya, laktoferin dapat berfungsi sebagai

donor besi, sehingga mendukung pertumbuhan beberapa bakteri yang

memerlukan zat besi lebih rendah di saluran pencernaan seperti Lactobacillus sp.

atau Bifidobacterium sp, yang berperan menjaga saluran cerna dari bakteri

berbahaya.9,29,31

laktoferin memiliki kontribusi yang luas dalam fungsi penting saluran

cerna sebagai immunomodulation melalui asosiasi usus dan jaringan limfoid

saluran cerna, menginduksi toleransi bakteri komensal dan menjaga keutuhan

endothelial tight junction. 9

27

BAB V

KESIMPULAN

Sepsis neonatorum masih merupakan salah satu penyebab utama morbiditas dan

mortalitas baik di negara berkembang maupun negara maju. Sepsis neonatorum

terdiri dari sepsis awitan dini dan sepsis awitan lambat. Faktor resiko sepsis

neonatorum berasal dari faktor ibu, bayi dan lingkungan. Sepsis neonatorum

dimulai dari tanda-tanda SIRS hingga berlanjut menjadi kerusakan multi organ

dan kematian.

Laktoferin adalah protein mayor pada ASI, selain itu juga disekresikan

dari kelenjar mukosa dan netrofil pada mamalia. Laktoferin merupakan bagian

dalam sistem imun bawaan, kadar dalam tubuh meningkat dalam keadaan infeksi.

Sehingga pengukuran laktoferin dapat dijadikan penanda infeksi pada tubuh.

Laktoferin berperan dalam metabolisme dan pengikatan besi, terlibat

dalam sistem imun memiliki sifat anti mikroba, anti fungal dan memiliki aktivitas

imunomodulasi serta berperan dalam meransang kematangan dan menjaga

pertahanan saluran cerna, sehingga laktoferin dari ASI maupun pemberian

suplementasi laktoferin pada neonatus dapat berperan mencegah dan penggunaan

bersama antibiotik membantu dalam pengobatan sepsis .

28

DAFTAR PUSTAKA

1. Gonzalez A, Spearman, Stoll B. Neonatal infectious disease: Evaluation of

neonatal sepsis. Pediatr Clin N Am. 2013.

2. Rohsiswatmo R. Kontroversi diagnosis sepsis neonatorum. Dalam:

Penyuting Hegar.B, Trihono P, Ifran EB. Update in neonatal infection.

Departemen Ilmu kesehatan Anak FKUI RSCM ,Jakarta desember 2005.

Hal 32 -43.

3. Roeslani D R, Amir I, Nasrulloh H, Suryani. Penelitian awal: Faktor

risiko pada sepsis neonatorum awitan dini. Sari Pediatri, Vol. 14, No. 6,

April 2013.

4. Leal Y , Álvarez-Nemegyei J , Velázquez J , Rosado-Quiab , Diego-

Rodríguez N , Paz-Baeza E, et.al. Risk factors and prognosis for neonatal

sepsis in southeaster mexico: analysis of a four year historic cohort follow

up. BMC Pregnancy and Childbirth 2012, 12 :48.

http://www.biomedcentral.com/1471-2393/12/48

5. Qazi A S, Stoll B. Neonatal Sepsis : Major Global Public Health

Challenge. The Pediatric Infectious Disease Journal . Volume 28, Number

1, January 2009

6. Manzoni P, Rinaldi M, Cattani S, Pugni L, Romeo G, Messner H, et.al.

Bovine Lactoferrin supplementation for prevention of late onset sepsis in

very low birth wight neonates: a randomized trial. JAMA, October 7,2009-

volume 302, No.13. diakses dari

http:jama.jamanetwork.com/on09/17/2013

7. Freitas R, Leão R, Gomes, Batista R. Nutrition therapy and neonatal

sepsis. Rev Bras Ter Intensiva. 2011; 23(4):492-498.

29

8. Cohen-Wolkowiez M, Benjamin DK, Capparelli E. Immunotherapy in

neonatal sepsis: advances in treatment and prophylaxis. Curr Opin Pediatr.

2009 ; 21(2) : 177–81.

9. Embleton, Berrington J, McGuire W, Stewart M, Cummings S.

Lactoferrin: Antimicrobial activity and therapeutic potential. Seminars in

Fetal & Neonatal Medicine xxx (2013) 1-7.

10. Venkatesh MP, Rong L. Human recombinant lactoferrin acts

synergistically with antimicrobials commonly used in neonatal practice

against coagulase-negative staphylococci and Candida albicans causing

neonatal sepsis. Journal of Medical Microbiology 2008 ; 57 : 1113–2

11. Levay PF, Viljoen M. Lactoferrin: a general review. Haematologica 1995 ;

80 : 252-67.

12. Yunanto A, Andayani, Triyawanti P, Suhartono E, Widodo A. Neutrophil

Phagocytosis Activity Compared To Myeloperoxidase, Hydrogen

Peroxidase And Lactoferrin Levels In Saliva Of Newborn Baby With

Sepsis Risk Factors To Detect Early-Onset Neonatal Sepsis. International

Journal of Pharmaceutical Science Invention ISSN (Online): 2319 – 6718,

ISSN (Print): 2319 – 670X .. Volume 2 Issue 1 ‖ January 2013 ‖PP.18-22,

diakses dari ww.ijpsi.org

13. Jiang Z, Ye.G. 1:4 matched case-controlstudy on influential factor of early

onset neonatal sepsis. European Review for Medical and Pharmacological

Sciences. 2013; 17: 2460-2466.

14. Haque KN. Definitions of Bloodstream Infection in the

Newborn.Pediatr Crit Care Med 2005; 6: S45-9

15. Rodrigo I. Changing patterns of neonatal sepsis. Sri Lanka J Child

Health 2002; 31: 3-8.

16. Aminullah A. Masalah terkini sepsis neonatorum. Dalam: Penyuting

Hegar.B, Trihono P, Ifran EB. Update in neonatal infection. Departemen

Ilmu kesehatan Anak FKUI RSCM ,Jakarta desember 2005. Hal 1-15

17. Amir I, Rundjan L. Patofisiologi sepsis Neonatorum : Systemic

Inflamatory response syndrome (SIRS). Dalam: Hegar.B, Trihono P, Ifran

30

EB,Penyuting. Update in neonatal infection. Departemen Ilmu kesehatan

Anak FKUI RSCM ,Jakarta desember 2005. Hal 17-31

18. Cinel Ismail, Steven M. Opal. Molecular biology of inflammation and

sepsis: A primer. Crit Care Med 2009 Vol. 37, No. 1

19. Levy O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical

correlates. Nature Review . Immunology. Volume 7, M ay 2010.

20. Chirico G. Development of the Immune System in Neonates. J Arab

Neonatal Forum 2005; 2: 5-11.

21. Short MA. Linking The Sepsis Triad of Inflammation, Coagulation and

Suppressed Fibrinolysis to Infants. Adv Neonat Care 2004 ; 5:258-73.

22. Pierrakos . Charalampo, Louis Vincent. Jean. Sepsis biomarkers: a review.

Pierrakos and Vincent Critical Care 2010, 14:R15.

http://ccforum.com/content/14/1/R15

23. Shapiro Philipp Schuetz , Yano K, Sorasaki M, Parikh S, Jones Ella, et

al. The association of endothelial cell signaling severity of illness, and

organ dysfunction in sepsis . Critical Care 2010, 14:R182 .

http://ccforum.com/content/14/5/R182

24. Ng PC. Diagnostic markers of infection in neonates. Arch Dis Child Fetal

Neonatal Ed 2004; 89: F229-F235. doi: 10. 1136/adc.2002.023838.

25. González-Chávez SA, Arévalo-Gallegos S, Rascón-Cruz Q. Lactoferrin:

structure, function and applications. International Journal of Antimicrobial

Agents 2009 ; 33 : 301.e1 - 8.

26. Conneely O. Review: Antiinflammatory Activities of Lactoferrin. Journal

of the American College of Nutrition, Vol. 20, No. 5, 389S–395S (2001)

27. Adlerova L, Bartoskova A, Faldyna M. Lactoferrin: a review. Veterinarni

Medicina, 2008 ; 53 (9): 457–68.

28. Roşeanu A, Damian M, Evans RW. Mechanisms of the antibacterial

activity of lactoferrin and lactoferrin-derived peptides. Rom. J. Biochem.

2010 ; 47 (2) : 203–9.

29. Farnaud S, Evans RW. Lactoferrin - a multifunctional protein with

antimicrobial properties. Molecular Immunology 2003 ; 40 : 395 – 405.

31

30. Conneely O. Review: Antiinflammatory Activities of Lactoferrin. Journal

of the American College of Nutrition, Vol. 20, No. 5, 389S–395S (2001)

31. Kaufman D, Lactoferrin Supplementation to Prevention Nosocomial

Infections in Preterm Infants AMA, October 7, 2009—Vol 302, No. 13.

http://jama.jamanetwork.com/ on 07/12/2012

32. Kruzel M, Zimecki M. Lactoferrin and Immunologic Dissonance: Clinical

Implications. Archivum Immunologiae et Therapies Experimentalis. 2002,

50, 399–410

33. Jenssen, R.E.W. Hancock. Antimicrobial propertie s of lactoferrin.

Biochimie 91 (2009) 19-29.

34. Romeo, Bollani L, Rinaldi M, Gallo E, Quercia M, Manzoni M, et.al.

Lactoferrin Prevents Invasive Fungal Infections in Very Low Birth Weight

Infants: A Randomized Controlled Trial. Pediatrics, Volume 129, Number

1, January 2012.

35. Stewart C J, Nelson A, Scribbins D, Marrs E, Lanyon C, Embleton N,

et.al. Bacterial and fungal viability in the preterm gut: NEC and sepsis.

Arch dis child fetal neonatal ed 2013 page 1-6

32