LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

TRANSFORMASI GEN ke DALAM Escherichia coli (E.coli) dan ISOLASI

PLASMID REKOMBINAN

Disusun oleh :

NAMA : EKA SAPUTRA

STAMBUK : F1C1 10 069

KELOMPOK : II (DUA)

ASISTEN : WAODE FITRIA SAKINAH

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALUOLEO

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya

adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein

histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak

berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.

Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon

dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki

protein histon.

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan

pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan

bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari

materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.

DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu

sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh

polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan

flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses

destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman

memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit

dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat

menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi

dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.

Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk

memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul

DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung

yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang

begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.

1.2 Tujuan

1. Dapat melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman

2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi

DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Isolasi DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling

penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung

informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya

(Suryo 2004: 57).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom

meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel

organisme. DNA genom meliputi gen danintergen(Campbell dkk.2004:221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk.

Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme

eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti

sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf 2001:7).

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis

Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang

dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick

menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix).

Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai

memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke

3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung

yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH.

Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan

kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220).

B. DNA REKOMBINAN

Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan

fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan

dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector

untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang

digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes

(YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan

Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase.

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang

telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert

(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian

pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.

Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli,

diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E.

coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase

yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi

mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan

nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua

enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah

ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

C. SEL KOMPETEN

D.

E.

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim

ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah

dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert

(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian

pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.

Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya

T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah

terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan

oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis

pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu

dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya

terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada

E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase.

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang

telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert

(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian

pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.

Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya

T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah

terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan

oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis

pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu

dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya

terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada

E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang

mempunyai ujung tidak rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan

ujung rata (blunt end). Enzim ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan

kovalen antara gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan,

yang menghendaki satu nukleotida mempunyai ujung 5’ phosphate bebas

dan nukleotida yang berdekatan mempunyai ujung 3’gugus hidroksil.

Enzim ligase tidak membedakan DNA‐DNA dari organisme yang berbeda.

Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun

dapat digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian menjadi

satu molekul DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA

rekombinan ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan

memperbanyaknya di dalam sel inang. Proses ini disebut sebagai

transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005).

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen.

Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang

kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu

purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan

guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava

dkk.2004:219).

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut

dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk

hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah:

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup

(Sadava dkk.2004:220).

2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan

molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu

fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).

DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan

pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan

sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan

bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis

(Raven & Johnson 2002: 94). DNA juga dijumpai pada organisme prokariotik.

DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid.

Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan

bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam

lokasi hidupnya.

Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu

pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga

mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai

dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi (Pierce2005:203).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya

ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk

memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang

mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul

ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah,

yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk.

2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan

suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).

Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan

DNA. Prosedur ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya

≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu

spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-deoksiribosa akan dikonversi ke

w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk

menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan

mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan

membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur

intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm

digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260

dan 280 nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm,

sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari

kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan protein

akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi,

menjalankannya pada gel agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda

yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA

konsentrasi dikenal.

Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa

lebih lanjut menggunakan analisis PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan

diferensiasi diulang dalam urutan genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan

forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan analisis.

Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA

dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel,

pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA

dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian

tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya

senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat

menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah,

maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang

berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam

ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane

sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein

dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen

kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki

ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat

membentuk suatu ikatan kimia. KIRSMAN83.2010.isolasi DNA

Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan

listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel

yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan

listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika

molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian

dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka

molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. [2] Kecepatan

gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan

gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan

kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E

adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai

fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah

ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi

sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada

muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,

konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam

untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan

medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih

besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan

menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

1.3 Metode Kerja

Isolasi DNA Tanaman

Alat :

mikrovivet berbagai ukuran

tabung 1,5 ml

tips mikropipet berbagai ukuran

saringan

gelas kimia

sendok

penangas

vorteks

mini sentrifuga

blender / lumping

Bahan :

buffer ekstraksi (100 mM tris- HCl, Ph 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl,

CTAB 2%)

Potasium asetat 5 M

SDS 20%

Kloroform : Isoamil alcohol (24:1)

Alkohol 100% (pa)

TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8)

Buah strowberi

CTAB 2%

Elektoforesis DNA

Range pemisahan molekul DNA dengan agarose gel

Agarose % Seaparsi optimal dari

molekul DNA (Kb)

0,3 5,0-60

0,6 1,0-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7,0

1,2 0,4-6,0

1,5 0,2-4,0

2,0 0,1-3,0

Bahan kimia :

Buffer TAE 10 X (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA Ph 8 )

Eidium bromida

Loading buffer

DNA Marker

Agarose

Alat dan bahan :

Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray)

Power suply

Mikropipet digital

Transilluminator UV

BAB II

HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Hasil Pengamatan Isolasi DNAFoto Hasil Pengamatan Keterangan

Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit.

Warna merah muda

Sampel di homogenkan dengan cara dibolak-balik sebanyak 50x

Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit

Larutan Bening

DNA

Tabel 2. Pengamatan Hasil Elektroforensis DNAFoto Hasil Pengamatan Keterangan

Tambahkan loading dye kedalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian Loading dye.

Sampel dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel, alat siap dipasang dan disambungkan ke sumber listrik( elektroforesis pada daya 100 volt selama 30 menit )

Fragmen DNA yg sempurna, karena tidak terurai Kontrol fragmen-fragmen DNA

Fragmen DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna

PERTANYAAN DAN JAWABAN

Isolasi DNA

1. Hitung jumlah senyawa yang dimasukka pada tahapan kerja nomer 5, 14

dan 18!

Buffer ekstraksi sebanyak 4 kali volume total sampel = 4 x

Kloroform Isoamil Alkohol sebanyak ½ x volume total sampel = ½ x

Alkohol sebanyak 2 x volume total sampel = 2 x

2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam isolasi DNA !

Buffer ekstraksi berperan dalam proses destruksi jaringan tanaman sehingga

terjadi degradasi pada DNA.

SDS berfungsi sebagai detergen yang dapat melisis dinding sel dan

mendenaturasi protein.

Kloroform Isoamil Alkohol membantu proses denaturasi protein yang masih

menempel pada kromosom.

Alkohol digunakan untuk mempresipitasi asam nukleat.

Elektroforesis DNA

1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis

anda !

2. Mengapa DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV ? Jelaskan !

DNA berukuran sangat kecil dan sulit untuk diamati, oleh karena itu untuk

memudahkan pengamatan DNA diwarnai menggunakan Etidium bromida.

Etidium bromida ini akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru

akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.3. Apakah

Etidium Bromide ? Bagaimana cara kerja Etidium bromida dalam proses

pewarnaan DNA ?Etidium bromida seperti telah disebutkan di atas adalah

pewarna yang digunakan untuk mempermudah pengamatan DNA dalam gel.

Etidium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan

tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.BAB

IIIPEMBAHASANIsolasi DNAPada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi

terhadap tanaman strawberry. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap.

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan

dengan mengambil beberapa bagian dagiang buah strawberry yang dihancurkan

didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel

dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi.Untuk

mengisolasi jaringan buah strawberry, maka jaringan tanaman tersebut yang

masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan

lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung

diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas

yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan

terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine

tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam,

seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut

juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga

mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya. Untuk

melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi tadi,

diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk

merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses

destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan

adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang

mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa

CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan

mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor

yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel tersebut

dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan warna

larutan berubah menjadi merah.Sampel yang telah homogen kemudian

diinkubasikan, setelah itu diberi larutan Potassium asetat dan dihomogenkan,

setelah homogeny sampel disimpan dalam wadah berisi es. Potassium asetat

adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga

membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-potassium aesta-protein- debris sel.

Setelah itu sampel disentrifuga pada kecepatan 14.000 rpm selam 10

menit.Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan

ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang

berwarna merah. Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap

selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan

untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya.Kemudian, pada tahap

berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1) yang berperan untuk

mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk

mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 100%. Pemberian alkohol

bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. DNA dalam

alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut,

tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir,

disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein

histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan

dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut

dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung.

Pembahasan Elektroforesis \Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan

gel agarose karena dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun

cukup sederhana, mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose

mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70

pb (pasangan basa) sampai 800.000pb. Selainitu penggunaan gel agarose

juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati

secara insitu dengan menggunakan Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium

bromide nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan

memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV. Hasil penyinaran

dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita DNA, yang

mempunyai fragmen-fragmen.Gambar pada hasil pengamatan kami ditemukan

salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang

sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA

bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.BAB

IVKESIMPULANDNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada

tumbuhan. Pada praktikum isolasi DNA dari tanaman digunakan jaringan tanaman

yang mengandung sedikit kontaminan, yaitu menggunakan daging buah. Prinsip-

prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan

membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Dari

hasil pengamatan dapat dilihat hasil dari tahap-tahap yang telah dilakukan. Isolasi

DNA telah berhasil dilakukan. Hal tersebut dilihat dengan adanya benang-benang

DNA yang terbentuk. Terbentuknya benang-benang tersebuut juga merupakan

hasil dari proses tahapan-tahapan yang dilakukan dengan menggunakan larutan

senyawa-senya tertentu. DAFTAR PUSTAKAAchmmad, Wendy., 2010.

Isolasi DNA. Jusuf., 2010. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika DNA

Rekombinan, Labortorium Bioteknologi. ITB.Wulan Sri, M., 2006.

Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman Untuk

Meningkatkan Kesejahteraan Hidup Manusia. Laboratorium Biologi

Reproduksi, Jurusan Biologi, FMIPA – UNAIR

http://www.macnature.com/2013/02/isolasi-dna-referensi-terpercaya.htmlhttp://

kirsman83.weeb..com/2/post/2013/01/isolasi-dna

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis (diakses pada tanggal 10 Mei 2013)

Lampiran Gambar

Proses Penuangan larutan ke dalam sampel dengan menggunakan mikropipet

Sentrifuge

Pipet UkurPemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut

transformasi apabila vector yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut

transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan

plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan

ekspresi gen maka dibawa oleh plasmid tersebut. Proses transformasi merupakan

proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang

berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode

untuk membedakan antara sel transfoman dan sel non transforman. Sel

transforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman

umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid.

Marka seleksi merupakan gen yang member karakterisitik baru pada sel

transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Penelitian ini

bermaksud untuk mentransformasi gen ke dalam sel inang Escherichia coli

(E.coli) dan plasmid rekombinan, serta dianalisis dengan elektroforesis.C. SEL

KOMPETENTransformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten.  Sel

kompeten  merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari

luar. Praktikum  ini menggunakan sel E. coli sebagai sel kompeten. Sel tersebut

kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel

tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut transforman (Lodish et al.).  Hasil

yang diperoleh dari praktikum transformasi ini adalah koloni E. coli dalam

cawan.Koloni  E. coli  tumbuh dalam  cawan dengan membentuk koloni berwarna

putih. Sel transforman dikultur  pada media dengan ampisilin. Hal ini sesuai

dengan teori yang ada. Sel tersebut mampu tumbuh pada media dengan ampisilin

karena di dalam selnya  terdapat plasmid (Lodish et al.). Keberadaan  plasmid di

dalam sel E. coli membuat sel tersebut resisten terhadap antibiotik ampisilin

(http:// transformasi-dengan-sel-kompeten.html).D. TRANSFORMASI GEN

ke DALAM SEL INANGProses transformasi merupakan proses yang tidak

efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap

DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan

antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang

berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang

tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan

adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen

yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel

bukan transforman.Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan

dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk

merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel.

Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari

bakteri transforman saja (http:// pembuatan-sel-kompeten-dan-

transformasi.html).ELEKTROFORESIS

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan

pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang

basa (pb).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui

ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromide

(http://elektroforesis)

BAB III

METODELOGI PRAKTIKUM

A. Waktu Dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 4-28 maret 2013 dan

bertempat di Laboratorium Bioteknologi Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Haluoleo Kendari.

B. Alat Dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung

eppendorf, shaker, water bath, vortex, sentrifuga, gelas kimia, batang

pengaduk, es, Erlenmeyer, pipet mikro, tabung biru, tabung kuning,

aluminium foil, cawan petri, sarung tangan, neraca analitik,

elektroforesis, kawat ose, Bunsen, hot plate, oven, autoklaf dan korek

api.

2. Bahan

Bahan yang digunakan adalah media LB, campuran ligase (Vektor

+ DNA Ligase + gen sisipan), biakan bakteri E. coli ampisilin,

aquabides, es batu, etanol dingin, etanol 70%, larutan lisis I, II, dan III,

alcohol, buffer TAE, I x etidium bromide, CaCl2 75 mM, kloroform,

agarosa, loading dye.