Format Laporan Biotek Isolasi Dna (1)

24
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “Materi Isolasi DNA“ Nama : Aninda Dwi Yanuar NIM : 135040200111146 Kelompok : H1 Asisten : Nur Syafa’ah PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014

description

format laporan

Transcript of Format Laporan Biotek Isolasi Dna (1)

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGIMateri Isolasi DNA

Nama : Aninda Dwi YanuarNIM : 135040200111146Kelompok : H1Asisten : Nur Syafaah

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDNA merupakan hal yang penting dalam kehidupan. DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Karena pentingnya isolasi DNA ini, maka dilakukan praktikum tentang isolasi DNA ini agar dapat lebih memahami tentang hal ini. 1.2 Tujuana. Untuk memahami pengertian isolasi DNAb. Memahami macam-macam metode Isolasi DNAc. Mengetahui Tahap Isolasi DNAd. Untuk mengetahui Manfaat Isolasi DNA

1.3 ManfaatBerdasarkan latar belakang diatas, praktikum ini memiliki manfaat agar dapat memahami lebih dalam tentang isolasi DNA

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian isolasi DNAIsolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih. (Aditia, 2010)DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive. (Listanto,1996)Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama

2.2 Macam metode Isolasi DNAMetode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair.a) Metode I.Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat). Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi denganmolecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair.b) Metode II.Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan denganincubator shakerpada suhu 65C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk prosescooling.Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 Lmolecular waterdan disimpan pada suhu -20C.

Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).c) Metode III.Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 L dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan 100 L buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 L kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4oC. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 L etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4oC. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 L Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 Lmolecular waterdan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 Lmolecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20oC.Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda. (Utami, 2012)2.3 Tahap Isolasi DNAPada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote.Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong molekul DNA di bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim.Selain dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA yang ujungnya tidak beraturan.(Yuwono,2006)

2.4 Manfaat Isolasi DNA (khususnya bagi pertanian)

BAB III METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan Fungsi 3.1.1 AlatMortar: Untuk melembutkan bahan praktikumPastle: Untuk melembutkan bahan praktikumErlenmayer : Wadah aquadesCawan : Sebagai wadah detergen.Saringan : Untuk menyaring bahan yang di ek- straksiSpatula : Untuk mengaduk dan mengambil bahan praktikumPisau : Untuk memotong bahan agar lebih kecil agar mempermudah dalam menghalus- kannya.Timbangan : Untuk menimbang bahan praktikumTabung Reaksi: Untuk meletakkan bahan yang sudah di haluskan dan untuk mereaksikan bahan.Gelas ukur : untuk wadah pasta

3.1.2Bahan

Jagung : sebagai bahan praktikun yang akan di amatiKacang tanah: sebagai bahan praktikun yang akan di amatiAquades: untuk melarutkan detergen dan garam untuKarbon: menjaga agar sel tidak rusak pada saat penggerusanNitrogen: menjaga agar sel tidak rusak pada saat penggerusanMercaptoethanol: untuk menghilangkan flafonoid dan browningPVP: untuk menghilangkan fenol (alkohol)Buffer TE: untuk melarutkan DNABuffer Pencuci: untuk menghindari kontaminasiCHISAM: untuk menghilangkan flafonoid dan browning

3.2 Langkah Kerja + dokumentasiCampurkan Buffer ektraksi 1ml + Karbon+ Mercoptoethanol 4 L.

Timbang 0.1 g daun

Gerus dengan Mortar dan tambah nitrogen cair + PVP

Masukkan ke dalam tube 1.5 ml

Vortex tube di inkubasi dalam oven 650C (10 Menit) dinginkan sebentar

Sentrifuge,kecepatan 10.000 rpm (5 menit)

Ambil Supernata pindahkan ke tube (2ml) baru

Tambahkan 500 l chisam dan di vortex (5 detik) 2 x ulangan

Sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm (5 menit) 2 x ulanganPindahkan supernatant ditambah 300 l isopropanol dingin

Bolak balik tube secara perlahan dan diinkubasi dalam frezer selama 15 menit

Sentrifuge 8000 rpm (5 menit)

Buang Supernatan + buffer pencuci 500 l dan d vortex

Sentrifuge, 9000 rpm (5 menit)

Buang Supernatan dan keringkan selama 10 menit tambahkan buffer TE sebanyak 50 l

Larutkan Pellet DNA dan mengetube perlahan

3.3 Analisis PerlakuanMencampurkan Buffer eksitasi sebanyak 1 ml kemudahan ditambah karbon ditambah mercaptoethanol 4 l. Timbang daun seberat 0,1 g dan menggerusnya dengan mortar dan menambahkannya dengan nitrogen cair+PVP. Setelah itu memasukkannya ke dalam tube 1,5 ml. kemudian vortex tube untuk mencampur larutan. Setelah itu inkubasi dalam oven 650C selama 10 menit dan didinginkan sebentar. Inkubasi berfungsi untuk optimalisasi buffer ekstarksi. Setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Setelah selesai ambil supernatant dan pindahkan kedalam tube baru sebanyak 2 ml. Tambahkan 500l chisam dan di vortex selama 5detik serta kemudian masukkan dalam sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. Lakukan kedua perlakuan tadi sebanyak 2 kali. Setelah selesai pindahkan supernatant dan tambahkan dengan isopropanol dingin 30 Setelah itu bolak balik tube secara perlahan dan inkubasikan dalam freezer selama kurang lebih 15 menit. Kemudian setrifuge kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Dan buang supernatant yang kemudian di tambah buffer pencuci 500 l serta di vortex. Buffer pencuci ini untuk menghindari kontaminasi. Kemudian sentrifuge kembali dengan 9000 rpm (5 menit). Setelah itu buang supernatan dan keringkan selama 10 menit. Ditambahkan Buffer TE sebanyak 50 l. Buffer TE untuk melarutkan DNA. Langkah terakhir adalah melarutkan pellet DNA dan menget tube perlahan.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Dapat di lihat pada gambar di atas, DNA tidak terlihat.

4.2 Pembahasan

BAB V PENUTUP5.1 Kesimpulan5.2 Kritik dan Saran5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten

DAFTAR PUSTAKA Minimal 2 buku dan 1 jurnal

Note: Cover laporan berwarna biru Laporan di print dengan kertas ukuran a5 Arial 11 spasi 1,15 Margin 3,2,2,2 Sertakan 1 jurnal pendukung (print A5 mewakili isi laporan) Cover warna biru