LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“ ISOLASI DNA KASAR ”

Disusun Oleh:

Nama : Muhammad Guruh Arif Zulfahmi

NIM : 105040201111091

Kelompok : Senin, 06.00

Asisten : Khoirun Enisa

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

FAKULTAS PERTANIAN

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

MALANG

2012

I. PENDAHULUAN

I.1 Latar BelakangDNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula

deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Materi genetik yang terdapat di dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti tangga. Bukan tangga yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh anak tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak tangga, yaitu anak tangga yang dibentuk oleh pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa Guanin-Citosin (G-C). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.

I.2 Tujuan Untuk pengetahui pengertian isolasi DNA Untuk mengetahui macam-macam metode isolasi DNA Untuk mengetahui tahapan-tahapan isolasi DNA Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA

I.3 ManfaatPraktikum isolasi DNA dilakukan, bermanfaat untuk

mengetahui pengaruh macam buah dan jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi.

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Definisi Isolasi DNA isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya

strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih.

(Aditia, 2010) DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for

subsequent molecular or forensic analysis.(Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya)

(Doyle, 1987)

2.2 Macam Metode Isolasi DNAIsolasi DNA menggunakanmetodeisolasiKarsinahet al.

(2002) yang telahdimodifikasidenganlangkahkerjasebagaiberikut : 1. Tabungeppendorfdiisidengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB

(CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M danTris-HCl 0,1M) dan 5 μlmercaptoethanol.

2. DaunBawangmerahdisterilisasidenganalkoholdanditimbang 0,5 gram.

3. 0,5 gram daunbawangmerahdigerusdalam mortar denganbantuan nitrogen cairdanditambah PVP 10 mg, kemudiandimasukkankedalameppendorf yang sudahberisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 μlmercaptoethanol. Setelahituekstrakdaundivortexhinggahomogen.

4. Ekstrakdaundiinkubasidalamsuhu 65oC selama 30 menitsambildibolak-baliktiap 10 menit. Kemudianditambahkan 700 μlChloroform :Isoamylalcohol/CHISAM (24:1). Setelahituekstrakdaundivortexhinggahomogen.

5. Ekstrakdaunkemudiandisentrifugasiselama 10 menitdengankecepatan 6000 rpm. Supernatandimasukkantabungbarudanditambahkan 700 μl CHISAM.

6. Larutansupernatandan CHISAM disentrifugasiselama 10 menitdengankecepatan 6000 rpm.

Faseatasdimasukkantabungbaruditambah isopropanol dingin. Larutantersebutdibolak-balikperlahanhinggatampakbenang-benangputihdalamlarutan. Larutandiinkubasidalam freezer selama 30 menit.

7. Setelahdiinkubasi, larutandisentrifugasiselama 10 menitdengankecepatan 6000 rpm setelahitusupernatandibuangdenganhati-hati agar endapan DNA pellet tidakikutterbuang.

8. Endapan DNA pellet dicucidengan buffer pencucidengancaramenambahkan 200 μl buffer pencucikedalam tube, kemudiancairan di buang. Pencucianinidilakukan 2 kali. Setelahituendapan DNA pellet dikeringanginkan.

9. Endapan DNA kemudiandiresuspensidengan 500 μl buffer TE laluditambah 1 μlRNAse.

10. Larutan DNA yang sudahditambahRNAsediinkubasiselama 30 menitpadaSuhu 37ºC.

11. Setelahlarutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1 ml ethanol absolute dingindandibolak-balikperlahan.

12. Larutan DNA laludiinkubasipada freezer selama 30 menit. 13. Setelahinkubasiselesaikemudiandisentrifugasiselama 10

menitpadakecepatan 6000 rpm. Peletkemudiandikeringanginkan.

14. Peletdiresuspensidengan 100 μl buffer TE dandisimpandalamlemaries.

(Zubaidah, 2004)

2.3 Tahap Isolasi DNAa. Perusakandindingsel    Penggunaan nitrogen cair

b. Lisismembransel    Penggunaandetergenkationik (CTAB)

c. PemurnianBeberapakontaminansepertisenyawasekunder (fenol) polisakarida, RNA,dan protein

d. Presipitasi    Penggumpalan DNA menggunakan isopropanol dingin

(Puspita, 2010)

2.4 ManfaatIsolasi DNA Menghancurkan membran sel. Disosiasi protein sel. Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya.

(Puspita, 2010)

III. METODOLOGI

3.1 Alat, bahan, danfungsi3.1.1 Alat

Pisau : untukmembelahmangga Mortal danpastle : untukmenghaluskanmangga Botol : untuktempatmencampurkanbahan Sendok : untukmengaduklarutan Tabungreaksi : untuktempatlarutan Timbangananalitik : untukmenimbangbahan Saringan : untukmenyaringbahan Gelasukur : untukmengukur volume larutan

3.1.2 Bahan Buahmangga : sebagaispesimen yang akandiamati Detergen : untukmelisissel Garam : untukmemisahkan air dengankotoran Etanol 96% :untukmempresipitasi Aquades :untukmencucipermukaanalat

3.2 Cara KerjaManggaKupas

Ambil 5 gramGerus dengan mortal dan pestele

Mangga halus+2.5 gr garam

+2.5 gram detergen+aqudest 50ml

DiadukBiarkan 10 menit

saringambil 5ml

+6ml etanolAmati supernatan

3.3 AnalisaPerlakuan

Pada isolasi DNA kasar bahan yang digunakan adalah buah manga.pertama-tama mangga dikupas setelah itu ambil 5 gram gerus dengan mortal damn pestle.setelah mendapatkan mangga halus.lalu tambahkan 2,5 gr garamdan tambahkan 2,5 gram detergen.detergen yang diambil adalah rinso cair,rinso bubuk,bukrim,lalu setelah itu diaduk dan biarkan selama 10 menit setelah itu saring dan ambil 5 ml dan tambahkan 6 ml etanol lalu amati supermatan.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil

No. Dokumentasi Keterangan

1.

Mangga dihaluskan dengan

menggunakan mortar dan pestle

2.

Mangga yang sudah dihaluskan dimasukkan ke

dalam botol

3.

Ditambah garam, rinso cair,

aquadesh, diaduk dan didiamkan

selama 10 menit

4.

Ditambah garam, rinso bubuk,

aquadesh, diaduk dan didiamkan

selama 10 menit

5.

Ditambah garam, bu cream,

aquadesh, diaduk dan didiamkan

selama 10 menit

6. Setelah diaduk,

kemudian disaring

7.Setelah disaring,

diambil sebanyak 5 ml

8.

Hasil saringan dimasukkan ke dalam tabung

reaksi dan diberi label

9. Ditambah etanol 96% sebanyak 6 ml

10. Hasil

IV.2 PembahasanDari hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui bahwa

jenis detergen berpenuh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda.dari hasil praktikum dapat diketahui bahwa detergen yang paling berpengaruh dalam proses isolasi DNA kasar pada buah mangga ini adalah rinso cair, karena mangga mempunyai kandungan kadar air yang sedang. Namun pada praktikum kali ini, DNA tidak mau muncul keatas dan tetap berada pada permukaan

larutan. Perbedaan detergen dalam mempengaruhi tingkat pemunculan DNA dalam isolasi DNA ini disebabkan karena kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen.

Menurut Jamilah (2005) diantara detergen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan konsentrasi air tinggi.

Sedangkan untuk mengetahui fungsi detergen dalam isolasi DNA ini menurut Jamilah (2005) dalam proses isolasi DNA, detergen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa "memakan" DNA).

Kecepatan pembentukan DNA juga dipengaruhi oleh jenis detergen yang digunakan, dalam hal ini detergen cair memiliki kualitas paling baik dalam pembentukan DNA pada ekstrak buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain.

V. PENUTUP

V.1 KesimpulanDalam praktikum tentang isolasi DNA kasar pada buah

mangga ini dapat disimpulkan bahwa detergen cair memiliki kualitas paling baik dalam pembentukan DNA pada ekstrak buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain.

V.2 Saran Untuk praktikum:

Semoga UAPnya nanti, soal yang diberikan mudah dan dapat terjawab dengan baik dan benar

Untuk asisten :Semoga lebih baik dari sebelumnya.

DAFTAR PUSTAKA

Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.com/2010/03/isolasiDNA.html Diakses 01Desember 2012

Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedurefor small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang

Puspita, 2010.TahapanIsolasi DNA. http://puspitt .multiply.com /journal/item/14/ISOLASI-DNA? &show_interstitia l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem. Diaksestanggal 01 Desemb- er 2012

Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.