LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI-2105)

ISOLASI DNA DAN ELEKTROFORESIS DNA

TANAMAN BAYAM (Amaranthus Sp.)

Tanggal Praktikum : 4 November 2013 dan 11 November 2013

Tanggal Pengumpulan : 18 November 2013

Disusun Oleh:

Annisa Amalia

10612007

Kelompok 1

Asisten :

Nofella Mahardika

10611063

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

BANDUNG

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul

lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi

DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa

gen, dan amplifikasi DNA. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan

dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding

sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan

terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse).  Dewasa ini telah

banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu

pengetahuan terutama dalam ilmu genetika. Dalam praktikum kali ini, dilakukan

isolasi DNA pada tanaman bayam (Lee, 2013).

Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi

mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan

cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar ultraviolet. Cara pemisahan dengan

elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi

DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai

tunggal atau untai ganda molekul DNA. Elektroforesis digunakan untuk

pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya. Dalam praktikum kali ini,

tujuan dilakukannya elektroforesis yaitu untuk menentukan kemurnian dan ukuran

DNA tanaman bayam (Cheng and Zhang, 2008).

1.2. Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah :

Menentukan kemurnian DNA berdasarkan hasil elektroforesis

Menentukan ukuran DNA tanaman bayam berdasarkan hasil elektroforesis

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Prinsip Isolasi DNA Pada Tanaman

Isolasi atau ekstraksi DNA merupakan proses pemindahan DNA dari sel atau

virus. Isolasi DNA merupakan langkah awal dalam melakukan analisa DNA

menggunakan metode elektroforesis atau PCR, dapat pula dijadikan langkah awal

untuk dapat mendiagnosa penyakit apapun, termasuk bawaan genetik, sejak dini.

Isolasi DNA banyak metodenya sesuai dengan sampel apa yang akan kita isolasi.

Misalnya untuk isolasi tumbuhan,tumbuhan diketahui memiliki dinding sel untuk

mengambil bagian dalam khususnya DNA sebelumnya kita harus menghancurkan

dinding sel nya terlebih dahulu yaitu menggunakan nitrogen cair dan digerus

untuk memudahkan hancurnya dinding sel tersebut. Berbeda dengan tumbuhan

untuk isolasi sel hewan tidak perlu menggunakan nitrogen cair,karena tidak

mempunyai dinding sel yang keras sel hewan cukup memakai buffer lisis,untuk

melisiskan selnya (Rice, 2010).

Proses pengambilan DNA dari organisme yang akan diuji dapat melalui

berbagai macam cara, mengambil sampel darah, atau rambut pada manusia,

contohnya, atau langsung mencampurkannya dengan larutan SDS seperti pada

Drosophila. Perlunya dilakukan dengan mencampurkan dengan SDS terlebih

dahulu, untuk melisiskan sel, dan mengeluarkan DNA yang terdapat di dalamnya,

serta menjaga DNA untuk tetap utuh, walau sel telah lisis. Untuk memisahkan

DNA dengan organel-organel lain di dalam sel, campuran disentrifugasi.

Sentrifuga memiliki prinsip perbedaan berat jenis saat dilakukan pemutaran

dengan kecepatan tertentu, sehingga akan diperoleh hasil dengan larutan yang

memiliki berat jenis yang lebih ringan akan berada paling atas (biasanya akan

terbentuk 2-3 fasa) (Rice, 2010).

Setelah sel lisis dan dipisahkan, DNA harus segera dijaga keadaan

fisiologisnya dalam lingkungan yang memungkinkan, yaitu dengan

mencampurkannya dengan sejenis buffer yang mengandung fenol dan kloroform.

Sehingga DNA dalam keadaan utuh dan terjaga fisiologisnya. Kemudian larutan

dihomogenisasi atau di vortex, setelah itu larutan kembali disentrifuga, yang

nantinya akan diperoleh DNA berada di atas dan fasa organik dengan fenol dan

kloroform berada di bawah. DNA yang telah dipisahkan setelah disentrifugasi

diendapkan menggunakan etanol atau isopropanol, karena DNA tidak dapat larut

dalam etanol maupun isopropanol, sehingga DNA akan mengendap. Kemudian

setelah dilakukan pemurnian DNA, DNA dikeringkan, lalu dilarutkan dalam TE

untuk presipitasi agar dapat disimpan untuk analisis DNA selanjutnya. Secara

keseluruhan, tahapan isolasi DNA adalah pemecahan sel, pemisahan protein,

pengendapan DNA, dan pemurnian DNA (Rice, 2010).

Pada jaringan tanaman, yang harus diperhatikan adalah jaringan tanaman

diperlakukan terlebih dahulu dalam Nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan

penggerusan agar diperoleh ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel

diperlakukan dengan ekstrak

2.2 Fungsi Larutan-Larutan yang Digunakan Dalam Isolasi DNA

Pada percobaan digunakan berbagai macam larutan dan reagen. Larutan-

larutan dan reagen tersebut memiliki fungsi tersendiri. Pada isolasi DNA bayam,

digunakan nitrogen cair pada saat penggerusan daun bayam. Nitrogen cair ini

memiliki fungsi menghancurkan dinding sel sehingga DNA lebih mudah diakses.

Kemudian pada saat gerusan telah didapat, terdapat penambahan extraction

buffer atau disebut juga buffer eksteaksi. Buffer ekstraksi mengandungTris-HCl-

SDS yang masing-masing bahan tersebut memiliki fungsi masing masing. Tris-

HCl berperan penting dalam kestabilan pH. Kestabilan pH menjadi hal yang

krusial karena pH yang pas akan membuat DNA tidak ikut terdenaturasi. Menurut

Rice, SDS merupakan deterjen yang memiliki fungsi membuang lipid dan protein

pada proses purifikasi DNA. Pada isolasi DNA bayam juga terdapat penambahan

Kloroform Isoamil atau disebut juga dengan CI yang memiliki fungsi untuk

menghilangkan kontaminan protein. Protein yang telah dipisahkan nantinya akan

terendapkan oleh etanol.

Layaknya percobaan-percobaan lain yang membutuhkan beberapa reagen

kimia untuk mendukung dan mempermudah proses percobaan, pada percobaan

kali inipun digunakan beberapa jenis reagen untuk isolasi DNA tanaman bayam,

diantaranya ethanol 75%, buffer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl, EDTA,

NaCl, dan 2-merkaptoetanol (SDS), isopropanol, nitrogen cair, larutan fenol :

kloroform : Isoamil alkohol (25:24:1), potassium asetat, serta sodium asetat.

Masing-masing buffer memiliki fungsinya tersendiri, misalnya saja salah satu

reagen yang penting yakni buffer ekstraksi yang digunakan mengandung Tris

HCl, EDTA, dan SDS. Tris HCl berperan sebagai buffer yang mengatur pH

larutan ekstraksi. Ethylenediamine tetraacetic acid atau EDTA berperan sebagai

chelating agent yang mengikat ion metal dalam larutan ekstraksi (Henry, 2001).

EDTA melemahkan sel dengan mengikat ion bivalen (Mg+2 dan Ca+2) yang

diperlukan untuk kestabilan membran sel. EDTA juga digunakan agar enzim

nuklease yang dapat mendegradasi DNA tidak aktif. Sementara itu SDS (sodium

dodecyl sulfate) merupakan detergen biologis yang menyebabkan membran sel

hancur serta mengemulsikan lipid dan protein sel dengan mengganggu interaksi

polar yang mengikat membran sel (Brooks, 2013).

Selain buffer ekstraksi, digunakan pula larutan fenol:kloroform:isoamil

alcohol (25:24:1) yang berperan sebagai pelarut organik yang dapat melarutkan

protein dan polisakarida, namun tidak dapat melarutkan DNA. Oleh karena itu

pelarut ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNAdari komponen-komponen

organik lainnya (Henry, 2001).

Nitrogen cair digunakan untuk melisiskan dindng sel sehingga semua isi

sel dapat dikeluarkan dan kemudian dapat ditampung dalam larutan buffer.

Dinding sel yang dikenai nitrogen cair akan menjadi getas dan mudah

dihancurkan ketika dilakukan proses penggerusn. Selain menggunakan nitrogen

cair, dinding sel juga dapat dipecahkan dengan penggerusan menggunakan buffer

ekstraksi diikuti penghangatan pada suhu 650C (Subandiyah, 2006).

2.3 Prinsip Kerja Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).

Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).

Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau

pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik.  Prinsip kerja

dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif

(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),

sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju

kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil

amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah

terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan

menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings

1994: 397).

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. 

Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor

seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat

medan listrik dan sebagainya.  Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan

atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan

kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak

melalui matriks tersebut (Brown 1992: 19). Di dalam elektroforesis digunakan

sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well,

platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik danloading buffer),

matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cummings 1994: A-6).

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.        Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.        Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.  Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.        Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.        Densitas muatanDensitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.  Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.        Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.        VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.        Larutan buffer elektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA

(Wolfe, 1993).

2.4 Fungsi Reagen dalam Elektroforesis

Seperti yang sempat dalam paragraf sebelumnya bahwa dalam setiap

percobaan biasanya memerlukan reagen guna mendukung dan memudahkan

proses percobaan, hal itu pula yang terjadi pada percobaan elektroforesis.

Beberapa reagen yang digunakan dalam percobaan elektroforesis misalnya

sajaagarosa, TAE, loading buffer, dan Etidium Bromida. Masing-masing reagen

memiliki peran dan fungsi tersendiri yang amat mendukung dan menentukan hasil

akhir dari percobaan.

Reagen loading dye misalnya. Pada percobaan, sampel DNA yang akan

dielektroforesis ditambahkan loading dye terlebih dahulu. Hal ini dikarenakan

larutan loading dye memiliki peran penting dalam menghasilkan ban DNA yang

tajam. Tiga fungsi utama dari larutan tersebut adalah untuk menterminasi reaksi

enzimatik sebelum elektroforesis, menyediakan kerapatan agar sampel dapat

bergerak dalam sumur gel, dan menyediakan cara untuk melihat pergerakan

molekul DNA saat elektroforesis (Surzycki, 2003).

Loading dye mengandung bromofenol biru, xylene cyanol, dan orange G

yang digunakan untuk memvisualisasi sampel DNA. Pada agarosa 1 %, xylene

cyanol bergerak dengan kecepatan setara dengan 4000 bp DNA, bromofenol biru

bergerak dengan kecepatan setara dengan 200 bp DNA, dan orange G bergerak

dengan kecepatan setara dengan 200-400 bp DNA. Biasanya loading dye juga

mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kerapatan DNA sehingga

dapat masuk dan bergerak dalam sumur gel (Elkins, 2013).

Buffer TAE (Tris-Asetat-EDTA) berperan dalam pemberian sensitivitas

dan kemampuan pemisahan yang tinggi. Buffer TAE memberikan ion untuk

konduktivitas listrik sehingga molekul-molekul DNA dapat bererak dengan baik

di dalam gel (Mitchelson and Cheng, 2001) selain itu larutan TAE juga berperan

sebagai penghantar arus pada media (Yuwono, 2005).

Setelah dielektroforesis, DNA divisualisasi menggunakan pewarna etidium

bromida. Etidium bromida dapat berikatan dengan kuat pada DNA dan

menghasilkan pendar sinar orange ketika dilihat dibawah sinar ultraviolet (Cheng

and Zhang, 2008). Karenanya, larutan etidium bromide dapat dikatakan memiliki

fungsi sebagai reagen pembantu visualisasi dalam proses elektroforesis DNA

(Marks et al, 2000)

2.5 Ukuran Genom Tanaman Bayam

Secara keseluruhan kumpulan gen-gen yang terdapat di dalam setiap sel-sel

individu organisme disebut sebagai genom. Ukuran genom adalah jumah total

DNA yang terkandung dalam satu salinan genom tunggal. Panjang molekul DNA

yang beruntai tunggal diukur dalam satuan basa. Karena secara kebanyakan DNA

merupakan pasangan komplementer dari untaian polimer yang disatukan dengan

ikatan hidrogen, panjang dari DNA beruntai ganda diukur dalam pasangan basa

atau base pairs (bp). Seribu pasangan dianggap sebagai 1 Kb , dan satu juta

pasangan basa sebagai 1 Mb (Bruzel, 1998). Kompleksitas suatu organisme tidak

berbanding lurus degan ukuran genom, beberapa organisme sel tunggal memiliki

DNA lebih besar dibandingkan dengan manusia (Stewart, 2009).

Amaranthus sp. merupakan salah satu organisme dengan model terbaik dalam

penelitian ukuran genom. Secara evolusi, spesies Amaranthus sp. sangat kaya

akan sumber daya genom. Berikut merupakan beberapa ukuran genom haploid

pada Amaranthus sp. (Stewart, 2009). Adapun bayam, organisme yang menjadi

objek percobaan kali ini, diikutip dari Brooks (2010), Spinacia oleracea atau

bayam yang merupakan kelompok tumbuhan Amaranthus memiliki genome 989

Mb.

Tabel 3.1 Ukuran Genom Haploid dari Amaranthus sp. (Stewart, 2009)

2.6 Gambar Susunan Ladder 1kb

Ladder DNA merupakan larutan yang terdiri dari berbagai ukuran molekul

DNA yang digunakan pada gel elektroforesis sebagai pembanding untuk

menentukan ukuran suatu DNA. Ladder memiliki ukuran yang berbeda-beda,

disesuaikan dengan perkiraan panjang DNA (Mobile Reference, 2007). Masing-

masing pabrik yang memproduksi ladder memiliki jangkauan base pair yang

berbeda-beda walaupun memiliki ukuran yang sama. Gambar 2.2 di bawah ini

merupakan ladder 1 Kb yang diproduksi oleh Geneaid, terdiri dari 13 garis linear

fragmen DNA yang dapat digunakan untuk mengukur DNA yang memiliki 250

bp hingga 10000 bp.

Gambar 2.2 Ladder 1 kb (Geneaid, 2013)

2.7 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Hasil Elektroforesis

Terkadang hasil elektroforesis yang didapatkan tidak sesuai dengan yang

diharapkan, baik berupa ban fragmen yang tidak terlihat, muncul smear, ataupun

terdapat anomali migrasi DNA. Berikut ini hal-hal yang menyeabkan ban yang

muncul pucat atau bahkan tidak muncul ban (Dube, 2010):

1) Kurangnya jumlah atau konsentrasi DNA, dapat diatasi dengan

menambahkan jumlah DNA asalkan tidak melebihi 50 ng/ban.

2) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.

3) Voltase yang digunakan terlalu rendah.

4) Panjang gelombang sinar ultraviolet yang tidak tepat untuk visualisasi

menggunakan pewarna etidium bromida. Untuk hasil yang baik

gunakan panjang geombang 254 nm.

Hasil lain yang seringkali muncul pada percobaan elektroforesis yang

gagal adalah smear. Masih menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear

pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah:

1) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.

2) Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis

3) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat.

4) Terlalu banyak garam pada DNA

5) DNA terkontaminasi protein

6) Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan

Sedangkan pada hasil elektroforesis yang menunjukkan anomali migrasi

DNA, Dube (2010) menambahkan, terdapat beberapa faktor mendasar yang

menyebabkan hal tersebut terjadi, diantaranya adalah:

1) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Jangan menggunakan voltase

lebih dari 20 V/cm dan jaga agar temperatur di bawah 300 C selama

elektroforesis. Harus dicek pula apakah konsentrasi buffer yang

digunakan sudah tepat.

2) DNA terdenaturasi. Jangan pernah memanaskan DNA ketika akan

dilakukan elektroforesis.

Senada dengan Dube, Sambrook (1989) juga mengidentifikasi beberapa

faktor utama yang menyebabkan hasil elektroforesis tak sesuai dengan yang

diharapkan. Hasil elektroforesis yang buruk seringkali disebabkan oleh banyaknya

zat-zat pengotor dalam DNA atau dengan kata lain DNA yang didapat tidak

murni. Beberapa faktor yang memengaruhi kemurnian DNA yakni tingkat

kontaminasi protein dalam larutan, faktor pengencer, serta daya absorbansi. Pada

elektroforesis, konsentrasi DNA diukur secara Sprektrofotometri dengan

menggunakan GeneQuant DNA calculator. Dasar teknik ini adalah DNA yang

dapat menyerap sinar ultraviolet dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm,

sedangkan 280 nm merupakan daerah serapan protein. Panjang gelombang dengan

nilai serapan 1,0 (A260=1,0 ) setara dengan 50 mg DNA utas ganda per milliliter

larutan. Oleh karena itu, didapatkan bahwa konsentrasi DNA (µg/ml) diperoleh

dari perkalian antara faktor pengencer, faktor konversi (50 µg/ml) dan Absorbansi

(A260). Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam

larutan. Rasio optical density (OD) menurut Montgomery and Sise (1990), apabila

260 nm dan 280 nm berada di antara 1.8-2.0 menunjukkan bahwa proses

deproteinasi pada metode tersebut baik. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka

masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam larutan (Sulandari dan Zein,

2003)

BAB III

METODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah :

Tabel 3.1. Alat dan Bahan

Alat BahanAlat sentrifuga Tabung eppendorfVortex TipsFreezer TAE 50xWaterbath Loading buffer 6xMikropipet Etidium bromidePestel dan mortar Jaringan tanaman (Bayam)Cetakan gel Ethanol 75%Alat pencetak sumur Buffer ekstraksiSumber arus Isopropanol

Alat pemanas Nitrogen cairFenol:Kloroform:Isoamil alkohol (25:24:1)Potassium asetat 5MSDS 20%Buffer Tris EDTA : 10 mM Tris-HCl pH 8,1 mM EDTA

3.2. Metode Kerja

3.2.1. Isolasi DNA

Sebanyak 0,2 gram daun bayam digerus dengan nitrogen cair hingga halus.

Setelah itu, dimasukkan ke dalam microtube. Kemudian, kedalam microtube

ditambahkan 500 µL extraction buffer. Microtube di vortex selama 5 detik dan

diinkubasi waterbath 60ºC selama 30 menit dalam apung-apung. Microtube hasil

inkubasi ditambahkan 500 µL Chloroform:Isoamilalkohol (CI) dan dikocok

hingga tercampur. Kemudian, micortube disentrifuga 14000 g selama 5 menit.

Setelah disentrifuga, supernatant diambil sebanyak 400 µL. Kemudian, ke dalam

microtube ditambahkan isopropanol 400 µL dan diinkubasi selama 30 menit di

suhu -80ºC.Microtube hasil inkubasi disentrifuga 14000 g selama 5 menit.

Kemudian, supernatan dibuang dan pellet dikeringkan sampai agak bening

(sekitar 10-15 menit). Lalu, ke dalam microtube ditambahan buffer TE 50 µL.

Setelah itu, microtube ditempatkan pada es selama 5 menit dan disentrifuga 14000

g selama 2 menit. Setelah sentrifuga, supernatan yang terbentuk diambil dan

disimpan di suhu -20ºC. Kemudian, hasil isolasi DNA.

3.2.2. Elektroforesis DNA

Mula-mula, pencetak sumur diletakkan pada cetakan gel. Kemudian

agarosa dicampurkan dengan buter TAE 1x (konsentrasi akhir agarosa 0,3%) dan

didihkan. Setelah agak dingin, campuran agarosa dan TAE 1x ditambahkan

dengan 1 µL etidium bromide. Lalu, campuran gel tersebut dimasukkan kedalam

cetakan gel dan didiamkan sampai gel mengeras. Kemudian, cetakan gel

diletakkan pada alat elektroforesis. Setelah itu, buffer TAE 1x juga dituangkan

pada alat elektroforesis hingga mencapai tinggi 1mm diatas gel. Setelah gel

berada dalam larutan buffer TAE, pencetak sumur dilepaskan dari gel. Kemudian

10 µL DNA yang telah diisolasi dicampurkan dengan 2 µL loading buffer dan

campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah itu, alat elektroforesis

dihubungkan dengan sumber arus dan sumber arus dinyalakan pada 70 Volt

sampai bromofenol biru mencapai ujung gel. Setelah bromofenol biru mencapai

ujung gel, sumber arus dimatikan. Gel dikeluarkan dari tangki gel dan diamati.

Gel dicelupkan ke dalam 0,2-0,5 µg/ml etidium bromide dan buter TAE 1x selama

10-60 menit, kemudian etidium bromide dihilangkan dari dalam gel dengan

memindahkan gel ke dalam buffer TAE 1 x selama 10-60 menit. Setelah itu, gel

disinari ultraviolet agar band-band DNA dapat dilihat dan diamati.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

4.1.1. Foto Hasil Pengamatan

Gambar 4.1 Hasil Elektroforesis (Dokumentasi Pribadi, 2013)

4.1.2. Proses dan Hasil Perhitungan Band Melalui Metode Regresi

Tidak dapat dilakukan perhitungan band dikarenakan hasil elektroforesis

seluruhnya dalam bentuk smear.

4.2. Pembahasan

Hasil elektroforesis yang didapat pada percobaan kali ini berbentuk smear

sehingga ukuran DNA tidak dapat dihitung. Menurut Dube (2010), penyebab

munculnya smear pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah:

A. Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis. Hal ini dapat diatasi dengan

mengurangi jumlah DNA yang digunakan. Dengan membatasi jumlah

komponen DNA yang diteliti, hasil elektroforesis yang didapat tentu akan

lebih akurat.

B. Terlalu banyak garam pada DNA. Seharusnya garam digunakan pada

takaran yang memang dianjurkan dan sesuai literature selama proses

elektroforesis DNA. Kelebihan garam malah akan mengganggu proses

KEL. 1KEL. 2KEL. 3KEL.4KEL. 5KEL. 6KEL. 7KEL. 8KEL. 9KEL.10KEL.11KEL.12KEL.13 KEL. 15KEL.14 KEL. 16

elektroforesis dan memengaruhi hasil yang akan didapat. Kondisi ini dapat

diatasi dengan teknik presipitasi garam berlebih menggunakan etanol.

C. DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease.

D. Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan. Kondisi ini dapat diatasi

dengan cara menambahkan etidium bromida saat elektroforesis.

E. Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Penggunaan voltase listrik yang

lebih dari 20 V/cm selama proses elektroforesis dapat memengaruhi hasil

yang didapat di akhir percobaan. Oleh sebab itu, selalu gunakan voltase

listrik dalam rentang di bawah 20V/cm serta selalu ingat untuk menjaga

temperature lingkungan tetap di bawah 300 C selama elektroforesis

berlangsung, tujuannya adalah agar DNA tidak terdenaturasi akibat suhu

yang terlalu tinggi.

F. DNA terkontaminasi protein.Protein dan zat organik lainnya (bahkan fenol

sekalipun) akan menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat menjadi

smear karena kesemua bahan tersebut akhirnya menjadi kontaminan bagi

DNA. Kontaminan tersebut yang menyebabkan hasil elektroforesis yang

didapat tidak jelas dan buruk akibat DNA yang dielektroforesis tidak

sepenuhnya DNA murni. Hal ini dapat diatasi dengan cara ekstraksi

protein menggunakan fenol.

Pita genom yang tidak smear atau bahkan tanpa latar pembayang di bagian

belakangnya mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik. DNA disebut

tidak terdegradasi atau terkontaminasi dan dapat diisolasi dengan baik.

Kontaminasi fenol dan bahan organik lainnya dapat dilihat dengan munculnya

latar pembayang atau smear di sepanjang jalur pergerakkan pita genom DNA

(Tenriulo et al.,2001). Ada 3 hal yang menjadi faktor penentu dalam metode

ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal, yakni penghomogenan jaringan

tanaman, komposisi larutan buffer, dan penghilangan enzim penghambat

polisakarida (Syarifudin dan Santoso, 2011).

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Setelah melakukan percobaan, didapat kesimpulan :

DNA yang didapat dari hasil isolasi tidak murni, banyak faktor pengotor lain

yang pada akhirnya memengaruhi hasil elektroforesis DNA pada percobaan

kali ini.

Ukuran DNA bayam tidak dapat dihitung karena hasil elektroforesis yang

didapat dari percobaan kali ini berbentuk smear.

5.2. Saran

Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum

dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat

mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam

penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam

petunjuk kegiatan praktikum.

Daftar Pustaka

Cheng, Liang and David Y. Zhang. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey : Humana Press

Henry, Robert J. 2001. Plant Genotyping : The DNA Fingerprinting of Plants. New York : CABI Publishing

Lee, Steven. 2013. DNA Extraction Methods. www.sjsu.edu/ people/ steven.lee/ courses/c3/s0/ DNA%2520ExtractiEx.ppt, (16 Oktober 2013).