ISOLASI DNA GENOM

Langkah 1Memecahkan sel yang ingin diisolasi DNAnyaPada sebagian sel, pekerjaan memecahkan sel adalah mudah, contoh pada sel hewan yang dikultur, yaitu dengan menambahkan detergent seperti SDS.SDS berfungsi merusak membran sel.

Jenis sel yang lain memiliki dinding sel yang kuat sehingga membutuhkan perlakuan yang lebih serius.Sel tumbuhan keras dan membutuhkan alat penggerus untuk memecahkannya.Penggerusan merupakan cara yang paling efektif untuk merusak dinding selulosa sel tumbuhan.Sel bakteri E.coli dapat dilisis dengan memberikan perlakuan kombinasi enzimatis dan kimia.

Enzim yang dipakai disebut Lysozyme, yang didapat dari putih telur.Lysozyme berfungsi memutuskan komponen-komponen polymeric pada dinding sel bakteri.Senyawa kimia yang dipakai adalah EDTA (ethilenediamine tetra acetate), yang membuang ion magnesiumAkibat keduanya terjadi penurunan integritas dinding selPemberian detergent untuk merusak dinding sel mengakibatkan pecahnya sel secara meledak.

Langkah 2Melakukan pemurnian DNA dengan menerapkan 2 metoda:Metoda 1: Mendegradasi atau membuang semua komponen-komponen sel yang masih bercampur dengan DNA.Metoda pertama ini bekerja dengan sangat baik bila sel tidak mengandung banyak lipid dan karbohidrat.

Pertama, ekstrak disentrifugasi dengan kecepatan rendah untuk membuang semua debris seperti potongan-potongan dinding sel, yang akan membentuk pellet pada bagian dasar tube.Kedua, supernatan dipindahkan ke tube yang baru dan dicampur dengan fenol, yang menyebabkan protein menggumpal (presipitasi) pada daerah interface antara antara fenol dan lapisan air.

Ketiga, lapisan air yang mengandung asam nukleat terlarut dipindahkan ke tube yang baru dengan pipetting.Keempat, untuk menghancurkan RNA menjadi nukleotida atau oligonukleotida, ke dalam larutan ditambahkan enzim ribonucleaseKelima, dilakukan precipitasi DNA (utuh) menggunakan ethanol absolut, lalu disentrifugasi untuk mengendapkan.Keenam, DNA yang muncul kemudian dilarutkan kembali menggunakan ddH2O, atau TE buffer.

Metoda 2: mengambil DNA dari ekstrak.Langkah 1: menambahkan detergent CTAB (cetyltrimethylammonium bromida), yang akan membentuk kompleks tidak larut dengan asam nukleat.Langkah 2: mengambil presipitasi (kompleks) dengan cara sentrifugasi Langkah 3: melarutkan kembali kompleks dalam larutan garam tinggi yang menyebabkan pecahnya kompleks dan melepaskan asam nukleat.

Langkah 5: Menghancurkan RNA dengan enzim ribonukleaseLangkah 6: Presipitasi DNA dengan ethanol absolut

Metoda 3: Membuat binding (ikatan) antara DNA dan partikel silika dengan menambahkan bahan kimia terdenaturasi seperti guanidium thiocyanate.Cara 1: Partikel silika dan guanidium thiocyanate dapat ditambahkan langsung ke ekstrak, lalu dilakukan centrifugasi untuk mendapatkan DNA.Cara 2: Silika dimasukkan ke dalam kolom kromatografi, dimana ekstrak dan guanidium thiocyanate dapat lewat.

DNA akan terikat ke partikel silika di dalam kolom. DNA diambil dengan cara mencuci guanidium thiocyanate dengan air, sehingga DNA lepas dari silika dan mengalir keluar dari kolom.

APLIKASI DI LAB BIOTEK UNP

Menggunakan kit yang berasal dari perusahaan Promega.

Bahan-bahan yang dibutuhkan:Larutan pelisis sel: Tris-HCL, EDTALarutan pelisis inti sel: NaOH, SDSBahan untuk penggumpal protein: sodium perkloratBahan untuk penghancur RNA: RNAseBahan untuk presipitasi DNA: alkohol absolutBahan untuk pencuci: alkohol 70%Kertas tissue

Alat-alat yang dibutuhkanMikrosentrifus kecepatan tinggi (13.000 rpm)Mikropipet: 10 l, 50 l, 100 l, 1000 l.Pipet transferMikrotubeVorteks

Isolasi DNA leukosit300 l darah+EDTA di+kan ke dalam 900 l larutan pelisis sel, dibolak-balik sebentar, lalu diinkubasi 10 menit pada RT sambil sekali-sekali dibolak balik selama inkubasi.Campuran kemudian disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm 1 menit.Supernatan dibuang, pelet dilisis kembali dengan 600 l larutan pelisis sel, divorteks sebentar, lalu disentrifus kembali selama 1 menit, 13.000 rpm.Supernatan dibuang, didapatkan pelet berwarna putih yang sudah bebas dari eritrosit.Ke dalam mikrotube ditambahkan 300 l larutan pelisis leukosit dan nukleus, dipipet up and down sampai homogen.

Selanjutnya ditambahkan 1,5 l RNAse, diinkubasi pada suhu 37C, 15 menit 1 jam.Selanjutnya ditambahkan 100 l larutan penggumpal protein, divorteks 30 detik sampai terbentuk butiran-butiran coklat.Campuran disentrifus selama 3 menit, 13.000 rpm, sampai terbentuk endapan coklat di dasar mikrotube.Supernatan dipindahkan ke mikrotube baru yang telah diisi dengan 900 l alkohol absolut.Tabung dibolak balik beberapa kali sampai terlihat benang-benang DNA yang melayang-layang dalam alkohol.Tabung disentrifus 1 menit, 13.000 rpm untuk mengendapkan DNA di dasar tabung.Alkohol absolut dibuang, DNA dicuci dengan 900 l alkohol 70%.Tabung disentrifus 1 menit, 13.000 rpm, alkohol dibuang.DNA dikering anginkan dengan posisi tabung terbalik.Setelah DNA benar-benar kering, DNA dilarutkan dalam 100 l buffer TE atau akuabides steril.

ISOLASI DNA PLASMIDPlasmid dan kromosom bakteri keduanya berupa DNA supercoiled.Melisis sel bakteri akan menyebabkan terjadinya perusakan sejumlah tertentu nukleoid, sehingga loops dari supercoil akan rusak.Ekstrak sel selanjutnya mengandung DNA plasmid supercoiled dan kromosom non-supercoiled.Selanjutnya plasmid dapat diisolasi dengan suatu metoda yang dapat memisahkan molekul DNA dengan konformasi yang berbeda tersebut.

Salah satu teknik yang dapat diterapkan adalah dengan menambahkan NaOH sampai pH ekstrak mencapai 12 12,5.Pembuatan lingkungan basa ini akan menyebakan DNA untai ganda non-supercoiled menjadi untai tunggal.DNA untai tunggal tersebut selanjutnya menjadi kusut dan terjerat dalam cairan yang berisi bahan-bahan lain. Selanjutya dilakukan dilakukan sentrifugasi.

DNA untai tunggal yang terperangkap akan membentuk endapan bersama dengan bahan-bahan lain di dasar tabung, sedangakan DNA plasmid supercoiled terlarut dalam supernatan.

Isolasi DNA plasmid bakteriMasukkan 1,3 ml biakan bakteri (medium cair) ke dalam mikrotube, sentrifus 1 menit, 13.000 rpm.Buang supernatan, pelet dilisis dengan 300 l bufer 1, pipet up & down sampai homogen, +kan 300 l bufer 2, pipet up & down.Inkubasi 5 mnt pada RT, lalu +kan 300 l bufer 3, pipet up & down, sentrifus 20 menit, 13.000 rpm.Pindahkan supernatan ke mikrotube baru dan sentrifus 5 menit, 13.000 rpm.Pindahkan kembali supernatan ke mikrotube baru, +kan 1000 l isopropanol dingin, bolak balik tabung sampai terlihat benang-benang DNA.

Sentrifus selama 30 menit, 13.000 rpm untuk mengendapkan DNA.Buang supernatan, cuci pelet DNA dengan 700 l alkohol 70%.Sentrifus 5 menit, buang alkohol.Cuci pelet 1 x lagi, sentrifus dengan waktu dan kecepatan yang sama.Buang alkohol, kering anginkan DNA dengan posisi mikrotube terbalik.Setelah DNA kering, larutkan DNA dalam 30 l akuabides steril.

BuferBufer 1 (pH 8): 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 100 g/ml RNAse A.Bufer 2: 200 mM NaOH, 1% SDSBufer 3 (pH 4,8): 2,55 M Kalium acetat pH 4,8

Isolasi DNA virusCampurkan ke dalam mikrotube: 100 l serum darah, 350 l bufer TE, 30 l SDS dan 1,5 l proteinase K.Vorteks sebentar, lalu panaskan pada suhu 65C selama 1 2 jam.Tambahkan 200 l fenol & 200 l chloroform: IAA (24:1)Aduk dengan vorteks selama 3 x 1 menitSentrifus selama 15 menit, 10.000 rpm, 20C.Pindahkan bagian/larutan yang bening (aquous layer) ke mikrotube baru.Ulangi langkah 3 6 satu kali lagi.

Aquous layer + 30 l sodium asetat (0,1 volume) + 1 ml alkohol absolut, mikrotube dibolak balik secara perlahan selama 30 kali.Disimpan dalam freezer (-20C) selama semalam.Sentrifus selama 30 menit, 12.000 rpm, 4C.Supernatan dibuangCuci pelet dengan alkohol 70%.Sentrifus selama 15 menit, 12.000 rpm, 4C.Kering anginkan DNA dengan posisi mikrotube terbalik.Larutkan DNA dalam 20 l akuabides steril.

Polymerase Chain Reaction

PCRMetoda untuk memperbanyak fragmen DNA dari gen tertentu secara in vitro.1 siklus terdiri dari 3 tahap: denaturasi, annealing, dan elongasi.Membutuhkan enzim DNA polymerase khusus yang tahan terhadap temperatur tinggi (Taq polymerase).

Campuran PCR5 l bufer3 l MgCl212 l dNTP1 l primer forward (20 pmol)1 l primer reverse (20 pmol)0,25 l Taq polymerase27,75 l ddH2O l DNA cetakan

Siklus PCRAmplifikasi biasanya dilakukan sebanyak 35 40 siklus.Siklus pertama: Denaturasi pada suhu 94C selama 5 menit, annealing pada suhu 55C 62C selama 40 detik, elongasi pada suhu 72C selama 1,5 menit.Siklus 2-35: denaturasi 94C selama 60 detik, annealing selama 40 detik suhu 52C-62C, elongasi pada suhu 72C selama 1,5 menit.Pada akhir siklus (pada siklus ke-35) tahap elongasi diperpanjang selama 7 menit untuk memberikan kesempatan pada mesin PCR melengkapi seluruh amplikon yang belum selesai amplifikasinya.

PCR(Polymerase chain reaction)

Elektroforesis produk PCRAmplikon diperiksa dengan memisahkan fragmen DNA pada gel agarosa 1% - 2% menggunakan apparatus elektroforesis.Kedalam apparatus elektroforesis ditambahkan larutan bufer TAE 1X, lalu dimasukkan gel agarosa.Ke dalam tiap-tiap sumur gel, dimasukkan campuran yang terdiri dari 5 l DNA amplikon dan 3 l loading buffer (0,25% bromofenol blue, xylene xyanole, 40% sukrosa)Dielektroforesis pada tegangan 90 V selama 30 45 menit.Sebagai penanda ukuran DNA digunakan DNA marker (contoh: DNA/HindIII, X174/HaeIII)

Hasil elektroforesis produk PCR

310 pb231/271231 pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10