1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang

begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering

terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat

canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi

DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya

yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan

sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga

MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sedasar teori. DNA

(Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode

semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme

(Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa,

basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk

hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk

dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA

terdapat pada nukleus, mitokondria, plastid dan sentriol. Molekul DNA pada nukleus

memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang

terletak pada mitokondria dan plastid berbentuk lingkaran.

DNA ditemukan pada semua makhluk hidup dari mikroorganisme sampai

organisme tingkat tinggi misalnya manusia, hewan dan tanaman. DNA terdapat

dalam sel dan inti sel. DNA dapat diekstrak dari segala macam organ yang terdapat

pada bagian tubuh mahluk hidup bersel, misalnya pada tumbuhan dapat diekstrak dari

daun, buah maupun dari batangnya (Muladno, 2002).

Isolasi DNA ini dimaksudkan untuk mendapatkan DNA murni. Selain itu

Muladno (2002) menjelaskan bahwa cara ekstraksi DNA dari berbagai sumber pada

1

prinsipnya adalah sama, akan tetapi ada beberapa modifikasi tertentu yang biasanya

dilakukan agar dapat menghancurkan inhibitor pada masing-masing sumber tersebut.

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp

isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk

memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang

mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul

ringan akan berada pada bagian atas tabung. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,

yaitu:

1. Isolasi jaringan

2. Dinding dan membran sel dilisiskan

3. Diekstraksi dalam larutan

4. Dipurifikasi

5. Dipresipitasi

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan

presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat

jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang

lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak

di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama

mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation

per minute) atau 3000 rpm.

1.2 Tujuan

Tujuan yang ingin di capai dalam praktikum ini adalah mahasiswa mampu

mempraktikkan cara mengisolasi DNA sederhana.

2

II. TINJAUAN PUSTAKA

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molekul (molekul utama) yang

mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap

organisme (Jamilah, 2005). Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa

nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang

kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin

dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin.

Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).

DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara

seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara

ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan

protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan

tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal

ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari

kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan

struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk

sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug

& Cummings, 1994).

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal

tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel

makhluk hidup. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat

ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas

menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi

semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses

fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94).

3

Fungsi DNA adalah sebagai berikut :

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup

(Sadava dkk.2004:220).

2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan

molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu

fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).

Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk

hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Zubaidah (2004: 38) menyatakan

bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap

jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain

karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang

dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti

polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain

yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.

Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik

untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul

yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan

molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu

supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115).

Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen

dari campuran (Alberts dkk. 1994:254).

Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada

masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan

kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan

4

buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam

ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Prinsip isolasi DNA mencakup berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang

berbeda-beda untuk setiap tahapnya. Menurut Clark (1963) tahap-tahap isolasi DNA

tersebut adalah :

- Pelepasan DNA yang terlarut dengan cara merusak membran sel dan

membran partikel subseluler misalnya asam nukleat.

- Penguraian DNA protein kompleks dari denaturasi

- Pemisahan DNA molekul yang lain

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA, dengan tujuan

untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Untuk

mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,

membran plasma dan membran inti baik secara mekanik atau kimiawi. Cara mekanik

bisa dilakukan dengan pemblenderan. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan

dengan pemberian perlakuan yang dapat merusak membran sel dan membran inti,

misalnya menggunakan deterjen. Dengan adanya detergen ini dapat membantu

mempercepat lisis sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen

dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-deterjen

kompleks.

5

III. METODOLOGI

3.1 Waktu dan tempat

Praktikum dilaksanakan pada hari Kamis, 10 April 2014 pada pukul 10.00-

11.00 WIB di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan

Ageng Tirtayasa.

3.2 Alat dan bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah botol selai 20 buah,

beker glass 250 ml 5 buah, pipet tetes 10 buah, saringan biasa 5 buah, kain penyaring

5 buah, kertas saring 75 lembar, blender 1 buah, corong glass 5 buah, tabung reaksi

15 buah, rak tabung reaksi 5 buah, spatula 5 buah, gelas ukur 250 ml 5 uah,

timbangan 1 buah, stopwatch 5 buah, pisau skaple 5 buah, mortal dan pestle 5 buah,

nanodrop, tube 1,5 ml, sudip, pipettor 100 mikroliter, vortex.

Bahan yang digunakan yaitu buah-buahan ( melon, semangka, tomat, nanas,

jeruk) bahan untuk 3 kelas @750 g, detergen bubuk, akuades, NaCl, etanol absolut

(didinginkan dalam freezer kulkas).

3.3 Cara kerja

a. Buah dibersihkan dari kulitnya dan di timbang sebanyak 250 gram,

ditambah 250 ml aquades, diblender selama 1 menit atau dihancurkan

menggunakan mortal dan pestle.

b. Disaring dengan penyaring biasa, kain saring dan kertas saring sebanyak 5

kali saring.

c. Hasil saringan (alikot) diletakkan dalam beker glass.

d. Larutan NaCl dan detergen dibuat dengan mencampurkan 1 sendok detergen

ditambah 2 spatula NaCl lalu ditambah dengan 56 ml akuades, diaduk

selama 15 menit hingga larut. Pengadukkan dilakukan secara perlahan agar

tidak ada buih yang dihasilkan dari pengadukan.

6

e. Alikot yang sudah siap dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml,

kemudian ditambah dengan larutan detergen-garam. Lalu diaduk secara

perlahan agar tidak menghasilkan buih selama sekitar 3 menit.

f. Setelah 3 menit, alikot yang telah tercampur dengan larutan detergen-garam

ditambahkan dengan etanol absolut dingin tetes demi tetes sebanyak 6 ml

melalui dinding tabung reaksi.

g. Waktu pembentukkan dan ketebalan benang-benang DNA dicatat pada

masing-masing jus buah.

h. Benang-benang yang terbentuk diambul dengan menggunakan sudip,

kemudian dimasukkan dalam tube 1,5 ml serta ditambahkkan aquades steril

100 mikroliter dan selanjutnya di vortex dan DNA disimpan dalam freezer

bila tidak digunakan.

i. Ukurlah konsentrasi DNA dengan menggunakan alat nanodrop.

7

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Table 1. hasil penghitungan waktu dan pengukuran ketebalan benang-benang

DNApada beberapajenis buah yang terbentuk.

No Nama Buah Waktu (detik) Keterangan

1 Jeruk 15,66 34,58 Ada gumpalan mengambang dan

terbentuk cincin

2 Semangka 29 29 DNA tidak terlihat/sedikit

3 Pepaya 7,01 5,42 Ada gumpalan sedikit dan tidak

mengambang

4 Tomat 24 15 Nampak seperti cincin dan

gumpalan yang sedikit

mengambang

5 Melon 15 9 DNA tidak terlihat/sedikit

4.2 Pembahasan

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk mendapatkan

DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand DNA dapat terpisah dari

dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut putih yang terbentuk antara campuran

ekstrak buah, detergen dan garam dengan alkohol. Sumber DNA yang digunakan

pada praktikum kali ini adalah buah-buahan (jeruk, semangka, pepaya, tomat, melon).

Proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA bertujuan

untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara mekanik.

Dicampurkan dengan garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi

DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi

berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410). Selain itu, garam berfungsi untuk

menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya

terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya

lysing buffer. Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang

8

dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif

fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak

mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub

negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994 dalam Jamilah, 2005:21).

Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan bahwa selain digunakan untuk

menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer,

garam juga membantu proses pemekatan DNA.

Sedangkan detergent berfungsi untuk melisiskan barrier (penghalang) sel

secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan

membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang

menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi

untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan

struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak

DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang bisa “memakan”

DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid

dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena

detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang

sama dengan dodesil sulfat (Jamilah, 2005:11). Sedangkan menurut Machmud

(2006), penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen

dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi

hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa

”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein

dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,

sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.

Pengadukan larutan bertujuan untuk untuk memperbesar pergerakan partikel

sel dan detergen agar reaksi berlangsung cepat, karena detergent merupakan bahan

yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukannya terlalu cepat akan

menimbulkan buih yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi DNA. DNA

akan sulit diamati karena terhalangnya penyatuan DNA di daerah atas antara etanol

9

absolut dengan campuran ekstrak buah, detergent dan garam akibat adanya rongga

udara yang ditimbulkan oleh adanya buih.

Setelah itu, campuran dari ekstrak buah, detergent dan garam tersebut

dimasukkan dalam tabung reaksi, ditetesi dengan etanol absolut dingin hingga terlihat

adanya cincin seperti kabut putih yang terbentuk di antara campuran dengan etanol

absolut.

Berdasarkan analisis data yang diperoleh terdapat tiga lapisan yaitu lapisan

terbawah adalah filtrat, lapisan tengah berupa benang-benang yang merupakan DNA,

sedangkan lapisan teratas adalah etanol yang berwarna bening, karena etanol

memiliki densitas (kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. Strand-strand (suatu

bahan yang kental dengan gelembung udara yang terperangkap di dalamnya) DNA

yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung di

atas filtrat.

Penambahan etanol dingin juga bertujuan untuk mempermudah proses

presipitasi DNA. Sehingga DNA yang telah terkumpul akan mampu terpisah dari

larutan dan membentuk lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.

Etanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan DNA yang juga bersifat polar. Dari

hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui bahwa jenis detergen berpengaruh

terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling

baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda.

Dari hasil yang di dapatkan bahwa buah pepaya memiliki waktu tercepat

dalam pembentukkan DNA murni yaitu 7,01 detik dan 5,42 detik. Dikarenakan

semakin sedikit kandungan air maka DNA murni yang di uji akan semakin terlihat.

Tingkat kekentalan air pada buah pepaya lebih kental dibanding buah yang lain.

Meskipun air yang terkandung di dalam buah pepaya lebih kental namun DNAnya

tidak tampak mengambang. Mungkin ada kesalah dalam proses isolasinya atau harus

menunggu lebih lama untuk dapat DNAnya mengambang ke atas.

Tomat memiliki kandungan air yang cukup banyak, jadi DNAnya tidak

Perbedaan kandungan air pada buah-buahan yang diuji kali ini sangat

menentukan hasil dari isolasi DNA dalam pembentukkan DNA murni pada buah.

10

Buah-buah yang memiliki kandungan air yang tinggi sehingga membuat ekstrak uji

menjadi encer, seperti semangka yang memiliki DNA murni hanya serabut-serabut

tipis saja dengan waktu yang cukup lama dibandingkan buah-buah lainnya. Secara

keseluruhan serabut putih yang tampak tidak terlihat terlalu jelas bila dibandingkan

dengan buah lain.

Anonim dalam Setiadi (2012), menyatakan bahwa dengan encernya larutan

uji, maka kemungkinan terjadi lisis sel yang lebih besar daripada larutan uji yang

kental. Mungkin pada uji yang dilakukan ini telah terjadi lisis pada ekstrak uji. Atau

terjadi kerusakan saat pembuatan ekstrak karena pemblenderan yang terlalu lama. Hal

ini juga ditunjukkan dengan lamanya serabut putih atauDNA yang telah terkumpul

terangkat ke permukaan.

Pada buah jeruk meskipun DNA terangkat ke permukaan cukup lama tapi

DNA yang terlihat sangat jelas. Hal ini dikarenakan buah jeruk memiliki kadar air

tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon meskipun kadar airnya lebih

tinggi dibanding jeruk namun DNA yang terlihat tidak terlalu jelas meskipun waktu

DNA terangkatnya pun lebih cepat dibanding buah jeruk. Dikarenakan pada buah

melon kandungan airnya lebih encer dibanding jeruk.

Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika

dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel

yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang

terpretisipasi juga akan sedikit.

11

V. PENUTUP

5.1 Simpulan

Tahap-tahap dalam isolasi DNA pada praktikum ini ada tiga. Tahap pertama

dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan,

Tahap kedua isolasi DNA adalah melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan

garam ke dalam campuran. Pemberian detergent berfungsi untuk membuka atau

memecah membran sel (baik membran sitoplasma maupun membran nukleus. Tahap

ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan manambahkan ethanol

absolut dingin, berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-molekul lain.

Buah pepaya memiliki waktu tercepat dalam pembentukkan DNA sedangkan

yang paling lama dan paling tipis serabut-serabutnya adalah pada buah semangka.

Dari lima buah yang di uji memang pepaya lah yang memiliki kandungan air yang

cukup kental namun DNA yang dihasilkan tidak sebanyak pada buah jeruk. Buah

jeruk memiliki kandungan air yang lumayan banyak tapi tidak berlebihan namnun

buah jeruk memiliki serat pada buahnya. Buah jeruk waktunya paling cepat ke tiga

setelah buah melon namun DNA yang terlihat pada buah jeruk sangat jelas dan

mengambang ke atas. Sedangkan pada buah melon meskipun waktunya cepat tapi

DNA yang terlihat sangat tipis hampir tidak terlihat. Pada buah tomat terlihat DNA

tipis namun DNAnya sampai mengambang.

5.2 Saran

Praktikan lebih teliti lagi dalam melalukan praktikum. Karena satu kesalahan

kecil maka hasilnya akan berbeda pula dengan dasar teorinya. Bertanya jika tidak

tahu itu sangat penting dalam praktikum maka praktikan harus lebih aktif lagi.

12

DAFTAR PUSTAKA

Clark, M. John. 1963. Experimental Biochemistry. San Fransisco: WH Freeman and

Company.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan

Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai

Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak

diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi.

Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. Englewood : Prentice-

Hall Inc.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha

Muda

Sadava. 2004. Basa Nitrogen DNA,(Online), (http://basa-nitrogen-dalam-dna-dan-

peranannya). Diakses tanggal 29 April 2014.

13

LAMPIRAN

Gambar 1. Alat dan bahan Gambar 2. Buah di timbang dan di hancurkan

Gambar 3. Ekstrak di saring 5 kali saringan Gambar 4. Menambahkan larutan dan

dan dimasukan tabung reaksi diaduk

Gambar 5. Mengambil dan menambahkan Gambar 6. Hasil

ethanol absolut dan di hitung waktu

14

pembentukkan DNAnya

15