BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr). Hanya sedikit

DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator (Fatchiyah,2006).

1.2 Tujuan Mengetahui definisi isolasi DNA Mengetahui macam metode isolasi DNA Mengetahui tahapan isolasi DNA Mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3 Manfaat Dapat mengetahui definisi isolasi DNA Dapat mengetahui macam metode isolasi

DNA Dapat mengetahui tahapan isolasi DNA Dapat mengetahui manfaat isolasi DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi isolasi DNA

Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.

Isolation of dna is a process to get pure DNA that can be used for the purposes of examination or diagnosis.

(Steven, 2007)

Isolasi dna merupakan suatu proses untuk menda-patkan DNA murni yang dapat digunakan untuk ke-perluan pemeriksaan atau diagnosa.

2.2 Macam-macam metode isolasi DNA

Teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA.

Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu

sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur.

Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternative pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah strowberi, hal ini dikarenakan strowberi mudah dihancurkan. Selain itu, strowberi matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel. Strowberi yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari setiap jenis kromosom yang juga dikatakan bahwa strowberi memiliki DNA yang berlimpah. (smbrook, 1989)

2.3 Tahap iolasi DNA

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000). 

Tahap kedua : menggunakan cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994).

Tahap ketiga ialah: ekstraksi DNA, seringkali menggunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein. Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase

aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol.

Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. (Mangoendidjojo, 2003)

2.4 Manfaat isolasi DNA

Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan

secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern Isolasi DNA genomik dalam rangka  pembuatan

pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin

peminakan DNA Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan

(template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat

Mortar+pistil : Menghaluskan bahan Tabung reaksi : Untuk mengamati reaksi Spatula : Menngambil detergen dan garam Beaker glass : Tempat mencampur

detergen,garam,alkohol serta bahan pengamatan

Gelas ukur : Mengukur volume larutan yang digunakan

Pipet : Mengambil larutan Cutter : Memotong mangga Saringan : Menyaring ekstrak mangga Timbangan : Menimbang bahan Rak tabung : Meletakkan tabung reaksi

Bahan

Mangga : Bahan yang akan diamati Aquades : Sebagai pelarut Garam : Memisahkan benang-benang DNA Alkohol dingin : Untuk melihat DNA pada mangga Detergen bubuk : Melihat kemampuan merusak sel Detergen cair : Melihat kemampuan merusak sel Detergen krim : Melihat kemampuan merusak sel

3.2 Langkah Kerja

Siapkan alat dan bahan

Timbang mangga sebanyak 5 gr masing-masing sebanyak 3 kali

Haluskan menggunakan mortar masukkan kedalam gelas beaker

Tambahkan aquades 50 ml + garam 2,5 gr + masing-masing detergen 2,5 gr

aduk homogenkan

Masukkan ekstrak mangga

Saring

Ambil ekstrak 5ml menggunakan pipet

Masukkan kedalam tabung reaksi

Tambahkan alkohol dingin 6ml

3.3 Analisa Perlakuan

Pada praktikum isolasi DNA kasar menggunakan bahan praktikum buah mangga dan detergen bubuk,detergen cair dan detergen krim. Perbedaan dari penggunaan detergen ini bertujuan untuk mengetahui daya rusak paling tinggi yang diakibatkan dari masing-masing detergen tersebut. Detergen tersebut dimasukkan kedalam ekstrak buah mangga yang sudah dihaluskan sebelumnya. Dan diamati perbedaan DNAnya dari tiap masing-masing ekstrak mangga yang telah diberikan perlakuan detergen yang berbeda-beda. Detergen mana yang paling jelas dan paling banyak menghasilkan DNA dari buah mangga tersebut. Sumber DNA ini dihaluskan yang bertujuan untuk merusak membran sel, dinding sel dan membrane inti sehingga DNA bisa keluar dari sel dan masuk ke larutan. Setelah dihaluskan, ekstrak buah ditambah garam dapur dan disaring serta ditambah etanol absolute dingin. Penambahan NaCl bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati.

Amati perubahan warna dan gumpalan DNAnya

Lakukan langkah kerja diatas 3 kali untuk masing-masing jenis detergen

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Dokumentasi Keterangan

Penghalusan buah mangga sebanyak 5gr menggunakan mortar+pistil

Hasil dari penghalusan mangga dan larutan dari masing-masing detergen (detergen bubuk,detergen cair,detergen krim)

Ekstrak mangga sudah dicampur kedalam masing-masing jenis detergen dan siap disaring

Ektrak mangga sudah disaring dan diletakkan pada tabung reaksi, dan amati DNA yang paling jelas terlihat serta paling banyak menggandung DNA diantara ketiga jenis detergen tersebut.

4.2 Pembahasan

Dari hasil praktikum isolasi DNA menggunkan bahan buah mangga dengan 3 macam detergen yang berbeda yaitu detergen bubuk,cair dan krim didapatkan hasil benang-benang DNA yang berbeda banyaknya. Paling banyak DNA yang dihasilkan adalah dari penggunaan detergen bubuk, namun pada hasil DNA dengan menggunakan detergen krim menghasilkan DNA ynag lebih jelas terlihat namun jumlah benang-benang DNA nya sedikit. Dan yang terakhir adalah detergen cair yang mengahasilkan jumlah DNA paling sedikit.

Menurut Jamilah (2005: 95) Perbedaan detergen mempengaruhi tingkat pemunculan DNA dalam isolasi DNA, ini disebabkan karena kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen bubuk. DNA yang telihat dengan menggunakan deterjen bubuk lebih banyak daripada deterjen krim dan cair, karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan membran sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain. Deterjen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau

hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. 

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari hasil praktikum isolasi DNA didapatkan bahwa penggunaan detergen bubuk paling banyak menghasilkan benang-benang DNA pada buah mangga.

Hal ini disebabkan karena karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan membran sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain. Deterjen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat

5.2 Saran

Semoga praktikum ini bermaanfaat mbak, terimakasih

DAFTAR PUSTAKA

Hendaryono, D. P. S dan Wijayati, A., 2006. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Jakarta.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Universitas Negeri Malang: Malang

Mangoendidjojo, W. 2003. Dasar-Dasar Pemuliaan Tanaman. Kanisius : Yogyakarta

Steven, A. William. 2007. Biology Moleculery. Jones and Bartlett Publishers: America

Smbrook J, E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Old spring Harbor Laboratory Press. USA.