ISOLASI DNA SEDERHANA

LAPORAN PRAKTIKUM

disusun untuk memenuhi tugas Matakuliah Genetika

yang dibimbing oleh Prof. Dr. A. Duran Corebrima, M.Si

Disusun Oleh:

Kelompok 3/Offering A

Dwi Arianita Wulan S (140341602770)

Anis Fitriana Pratama (140341606809)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

JURUSAN BIOLOGI

Februari 2016

A. TUJUAN

Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah:

1. Untuk memperoleh keterampilan mengisolasi DNA secara sederhana

B. DASAR TEORI

Pada umumnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA.

DNA terletak dalam kromosom, yang dijumpai dalam nukleus, mitokondria, dan

kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di dalam nukleus, sitoplasma dan ribosom.

Di dalam sel mahluk hidup terdapat DNA, dimana zat ini disebut sebagai cetak

biru kehidupan karena mempunyai peranan yang sangat penting, yaitu sebagai

pembawa hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme

lain (Hays, 2005 dalam Jamilah 2005).

DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) merupakan struktur makromolekuler

yang disusun oleh sub unit yang disebut mitokondria (Gardner, 1991). DNA

ditemukan pada semua makhluk hidup dari mikroorganisme sampai organisme

tingkat tinggi misal: manusia, hewan dan tanaman. DNA terdapat di dalam sel dan

inti sel. DNA dapat diekstrak dari segala macam organ yangterdapat pada bagian

tubuh mahluk hidup bersel, misalnya pada tumbuhan dapat diekstrak dari daun,

buah maupun dari batangnya (Muladno, 2002).

Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh

makhluk hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Zubaidah (2004: 38)

menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan

tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah

berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam

konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga

mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi,

atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak

dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.

Prinsip teknik isolasi DNA ada berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang

berbeda-beda pada setiap tahapnya. Tahap pertama adalah penghancuran dinding

sel, tahap ini dapat dilakukan secara mekanis dan enzimatis. Tahap kedua adalah

melisis sel, cara ini tergantung dari jenis selnya. Tahap ketiga adalah pemurnian

DNA dari sisa-sisa molekul penyusun sel, seperti protein dan lain-lain.

Isolasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan perlakuan deterjen.

Detergen telah lama dikenal masyarakat sebagai bahan untuk membantu dalam

proses mencuci, karena detergen memilki sifat sebagai bahan pengemulsi yang

baik. Detergen memiliki ikatan kimia dengan gugus hidrofil yang bersifat polar

dan gugus hidrofob yang bersifat non polar. Gugus hidrofob inilah yang

bertanggung jawab dalam pengikatan kotoran dari bahan cuci, karena mampu

mengikat senyawa non polar (protein dan lipid) dari lingkungan sekitar dan

membentuk “ protein-lipid-detergen kompleks”, hal inilah yang menyebabkan

detergen menjadi salah satu polutan bagi lingkungan perairan, karena kemampuan

membentuk “ protein-lipid-detergen kompleks” dapat mengakibatkan rusaknya

membran sel orgaisme (Machmud, 2006).

C. ALAT DAN BAHAN

Alat:

1. Blender

2. Timbangan

3. Beaker glass 100 ml

4. Gelas ukur 50 ml

5. Saringan teh

6. Kain saring

7. Corong

8. Pengaduk kaca

9. Spatula

10. Pipet tetes

11. Tabung reaksi

12. Rak tabung Reaksi

Bahan:

1. Buah semangka,melon, jeruk

2. Detergen rinso, wings cream,

sunlight

3. Garam (NaCl)

4. Alkohol 70%

5. Aquades

6. Alkohol 96% (dingin)

7. Kertas saring

8. Kertas label

D. PROEDUR

Memblender satu macam buah (semangka, nanas, jeruk)yang telah dikupas sebanyak 200 gram bersama 200 ml air

aquades hingga halus

Menyaring buah yang telah diblender dengan saringan teh dan menampung hasilnya

Menyaring kembali dengan menggunakan kain saring dan menampung hasilnya ke dalam beaker glass yang berbeda

Menyaring kembali dengan menggunakan corong yang dilapisi dengan kertas saring yang telah dilipat. Mengaduk perlahan

dan hati-hati menggunakan pengaduk kaca untuk memudahkan penyaringan. Menampung hasilnya pada

beaker glass

Menambahkan satu spatula detergen ke dalam masing-masing beaker glass (untuk sabun krim, melarutkannya terlebih dahulu dengan air). Mengaduknya dengan perlahan dan berhati-hati agar tidak berbusa. Memberikan label untuk

masing-masing beaker glass

Membagi hasil saringan ke dalam 3 beaker glass yang berbeda

Setelah detergen larut, menambahkan masing-masing satu spatula garam dapur (NaCl). Mengaduknya perlahan

Menuang masing-masing 10 ml ke dalam tabung reaksi

Memperhatikan pembentukan struktur berwarna putih yang dapat berupa benang-benang serupa kapas, atau seperti

kabut di bagian batas antara alkohol dan larutan. Bentukan yang berwarna putih itulah yang merupakan DNA pada

buah

Mencatat kuantitas dan waktu terbentuk struktur tersebut untuk masing-masing buah dan masing-masing jenis detergen

Menambahkan 5 ml alkohol dingin dengan perlahan melalui dinding tabung reaksi

E. DATA

No. Jenis Buah Jenis Detergen Waktu (s) Kuantitas Keterangan

1. Semangka Rinso 60 ++ Seperti

kabut

Wings cream 40 ++++ Seperti

kabut

Sunlight 13 +++ Seperti

kabut

2. Melon Rinso 43 ++ Seperti

kabut

Wings cream 53 +++ Seperti

kabut

Sunlight 25 ++++ Seperti

kabut

3. Jeruk Rinso 8 ++++ Seperti

kapas

Wings cream 9 +++ Seperti

kapas

Sunlight 13 ++ Seperti

kapas

Keterangan:

+ : sedikit

++ : agak banyak

+++ : banyak

++++ : sangat banyak

Mengulangi langkah di atas untuk jenis buah yang lain

F. ANALISA DATA

Pada buah semangka, ketika jus diberikan larutan detergen rinso, tercatat

waktu hingga 60 sekon hingga terbentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas

agak banyak. Kemudian, ketika jus buah semangka pada beaker glass yang lain

diberikan larutan wings cream, dibutuhkan waktu sebanyak 40 sekon hingga

terbentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas sangat banyak. Penambahan

larutan sunlight pada beaker glass ketiga yang berisi jus semangka, dibutuhkan

waktu 14 sekon hingga terbentuk struktur berwarna putih. Semua struktur

berwarna putih yang terbentuk pada buah ini bersifat seperti kabut.

Pada buah melon, ketika ditambahkan larutan rinso, dibutuhkan waktu 43

sekon hingga terbentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas agak banyak.

Kemudian, pada beaker glass yang berbeda ditambahkan larutan detergen wings

cream dan didapatkan hasil bahwa dibutuhkan waktu 53 sekon hingga terbentuk

struktur berwarna putih dengan kuantitas banyak. Selain itu, pada beaker glass

yang ketiga juga ditambahkan larutan sunlight dan dibutuhkan waktu 25 sekon

untuk membentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas sangat banyak. Semua

struktur berwarna putih pada buah melon bersifat seperti kabut.

Pada buah jeruk, ketiga beaker glass yang berisi jus jeruk dan ditambahkan

3 larutan detergen yang berbeda terbentuk struktur berrwarna putih yang bersifat

seperti kapas. Ketika ditambahkan larutan rinso, dibutuhkan waktu 8 sekon untuk

membentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas sangat banyak. Ketika

ditambahkan larutan wings cream, pada detik ke 9 sekon baru terbentuk struktur

berwarna putih dengan kuantitas banyak. Kemudian, ketika ditambahkan larutan

sunlight, membutuhkan waktu 13 sekon hingga bisa terbentuk struktur berwarna

putih dengan kuantitas agak banyak.

G. PEMBAHASAN

Dari detergen yang telah digunakan ada yang berpengaruh sangat baik

dalam pembentukan isolasi DNA dan ada pula yang tidak berpengaruh secara

baik terhadap isolasi DNA. Pada pengamatan kali ini macam detergen yang

digunakan sebanyak 3 macam detergen yaitu sunlight, rinso dan cream.

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk

mendapatkan DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand

DNA yang dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut

putih yang terbentuk antara campuran ekstrak buah, detergen dan garam

dengan alkohol. Sumber DNA yang digunakan pada praktikum kali ini adalah

buah-buahan (jeruk, semangka, melon).

Pada proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA

bertujuan untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara

mekanik. Kemudian pecampuran dengan garam memiliki fungsi yang sama

dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan

kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410).

Selain itu, garam (NaCl)berfungsi untuk menghilangkan protein dan

karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan

bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer.

Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung

oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat

DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak

satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub

negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994 dalam Jamilah,

2005:21).

Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan bahwa selain digunakan

untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing

buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Sedangkan detergent

berfungsi untuk melisiskan barrier (penghalang) sel secara kimia sebagai

pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara

lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan

kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk

menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan

struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak

DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang bisa “memakan”

DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi

lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel

karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki

fungsi yang sama dengan dodesil sulfat (Jamilah, 2005:11). Machmud (2006)

menyatakan bahwa penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan

karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang

dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran

membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat

terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik,

demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.

Pengadukan larutan bertujuan untuk memperbesar pergerakan partikel sel

dan detergen agar reaksi berlangsung cepat, karena detergent merupakan bahan

yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukan tidak secara perlahan

akan menimbulkan buih yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi

DNA dan akan sulit diamati karena terhalangnya penyatuan DNA di daerah atas

antara etanol absolut dengan campuran ekstrak buah, detergent dan garam akibat

adanya rongga udara yang ditimbulkan oleh adanya buih.

Setelah itu, campuran dari ekstrak buah, detergent dan garam tersebut

dimasukkan dalam tabung reaksi, ditetesi dengan etanol absolut dingin hingga

terlihat adanya cincin seperti kabut putih yang terbentuk di antara campuran

dengan etanol absolut. Penambahan etanol dingin juga bertujuan untuk

mempermudah proses presipitasi DNA. Sehingga DNA yang telah terkumpul

akan mampu terpisah dari larutan dan membentuk lapisan-lapisan yang dapat

diidentifikasi unsur penyusunnya. Etanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan

DNA yang juga bersifat polar. Dari hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui

bahwa jenis detergen berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen

tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu pula

dengan kadar air berbeda.

Dari hasil yang didapatkan buah jeruk memiliki waktu yang cepat dalam

pengisolasian DNA dibandingkan buah yang lainnya yaitu, 8 detik, 9 detik , dan

13 detik,dan terbentuk menyerupai kapas. Hal ini dikarenakan buah jeruk

memiliki kadar air tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon dan

semangka meskipun kadar airnya lebih tinggi dibanding jeruk namun DNA yang

terlihat tidak terlalu jelas meskipun waktu DNA terangkatnya pun lebih cepat

dibanding buah jeruk. Dikarenakan pada buah melon dan semangka kandungan

airnya lebih encer dibanding jeruk.

Buah-buah yang memiliki kandungan air yang tinggi sehingga membuat

ekstrak uji menjadi encer, seperti semangka dan melon yang memiliki DNA

murni hanya serabut-serabut tipis saja dengan waktu yang cukup lama

dibandingkan buah-buah lainnya. Secara keseluruhan serabut putih yang tampak

tidak terlihat terlalu jelas bila dibandingkan dengan buah lain.

Buah-buahan dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang

berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi

kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,

sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

H. SIMPULAN

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk

mendapatkan DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand DNA

yang dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut putih yang

terbentuk antara campuran ekstrak buah, detergen dan garam dengan alkohol.

Sumber DNA yang digunakan pada praktikum kali ini adalah buah-buahan (jeruk,

semangka, melon).

Proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA bertujuan

untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara mekanik.

Kemudian dibikin homogen dengan garam memiliki fungsi yang sama dengan

SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi

ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410).

Buah jeruk memiliki waktu yang cepat dalam pengisolasian DNA

dibandingkan buah yang lainnya. dikarenakan buah jeruk memiliki kadar air

tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon dan semangka meskipun

kadar airnya lebih tinggi dibanding jeruk namun DNA yang terlihat tidak terlalu

jelas meskipun waktu DNA terangkatnya pun lebih cepat dibanding buah jeruk.

Dikarenakan pada buah melon dan semangka kandungan airnya lebih encer

dibanding jeruk

DISKUSI

1. Jelaskan fungsi reagen-reagen pada praktikum isolasi DNA:

a. Detergen

b. Garam

c. Alkohol

2. Apa fungsi pemblenderan buah pada proses isolasi DNA?

2. Mengapa pada proses pengadukan tidak boleh berbusa?

3. Mengapa alkohol yang ditambahkan diharus dalam keadaan dingin?

4. Mengapa pada macam detergen yang berbeda diperbolehkan kuantitas

DNA dan waktu pembentukan yang berbeda?

5. Mengapa pada macam buah yang berbeda diperoleh kuantitas DNA

dan waktu pembentukan yang berbeda?

Jawaban

1. fungsi reagen-reagen pada praktikum isolasi DNA berikut:

a. detergen

jawab: Detergen berfungsi memecah membran sel (baik membran

sitoplasma maupun membran nukleus). Molekul detergen dan lemak

terdiri dari dua bagian, yaitu bagian kepala yang suka dengan air

(hidrofil) dan bagian ekor yang beni dengan air (hidrofob). Bagian yang

hidrofob akan berikatan dnegan molekul lemak dan protein yang

menyusun membran sel sedangkan bagian hidrofil akan berhubungan

dengan air

b. garam

Jawab: garam dapur (NaCl) dapat melisiskan sel yaitu dengan membuat

kondisi hipertonis sehingga sel mengalami plasmolisis. NaCl juga

berguna untuk melisiskan membran sel, bekerja pada molekul

oligosakarida dan glikoprotein pada membran

c. alkohol

Jawab: Alkohol dingin berfungsi untuk memisahkan DNA dengan

molekul yang lain seperti protein. Alkohol mempunyai molekul yang

lebih pdat dan ringan daripada air sehingga akan berada pada permukaan

campuran. Protein dan lemak akan berada pada bagian bawah sedangkan

DNA akan memisah dan berada pada daerah alkohol. Selain itu, alkohol

dingin akan mempercepat pembentukan fase gel DNA karena dalam

keadaan panas akan memperlambat pembentukan gel

1. pemblenderan berfungsi untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel. Cara

untuk merusak membran sel itu salah satunya dengan pemblenderan.

3. Karena busa yang ditimbulkan oleh detergen akan mengganggu

pengamatan, karena DNA yang berhasil diisolasi nampak tipis, dan

dapat dipastikan lapisan DNA tersebut akan tertutupi jika terdapat

banyak busa. Disamping itu juga adanya busa akan dapat merusak

pembentukan DNA. Selain itu karena sel dapat mengalami lisis yang

disebabkan karena rusaknya dinding dan membran sel.

4. Penambahan alkohol dingin akan mempermudah koagulasi DNA

sehingga DNA yang bersifat transparan dapat terlihat dengan jelas

berupa benang-benang halus pada lapisan tengah campuran buah dan

detergen, selain itu juga karena pada alkhohol yang dingin dapat

membentu mempercepat proses mempertifikasi DNA dan jika alkohol

yang dingin yang diberikan maka konsentrasi DNA yang akan terikat

oleh alkohol tersebut akan semakin pekat.

5. Karena dari hasil isolasi DNA yang dilakukan, dapat diketahui bahwa

jenis detergen berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen

tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu

pula dengan kadar air berbeda.

6. Sebab jenis buah berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA. DNA pada

masing-masing buah mempunyai kadar atau jumlah yang berbeda dan

warnanya pun berbeda. Buah-buahan dengan kadar air tinggi akan

menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah

berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di

dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi

juga akan sedikit.

LAMPIRAN

Isolasi DNA pada Semangka Isolasi DNA pada Jeruk

Isolasi DNA pada Melon

DAFTAR PUSTAKA

Clark, M. John. 1963. Experimental Biochemistry. San Fransisco: WH Freeman

and Company.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan

Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai

Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi

tidak diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi.

Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. Englewood :

Prentice-Hall Inc.

Machmud, wildan. 2006. Penentuan LC 50 48 Jam Detergen dan Pengaruhnya

Terhadap Mortalitas Larva Ikan Mas (Cyprus Corpio) Ras Punten

dengan tipe Ploidi Yang Berbeda. Skripsi tidak diterbitkan. Malang:

Program Sarjana Biologi

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka

Wirausaha Muda