Laporan Praktikum

Genetika Sel

Isolasi DNA Allium cepa L.(dengan cara sederhana)

Universitas Gadjah Mada

Yogyakarta

2010

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode yang ada untuk keperluan penelitian dalam biologi molekuler dan

genetik terus berkembang dengan cepat. Agar dapat digunakan untuk

manipulasi, diagnosis, dan terapeutik, DNA dan RNA harus diisolasi

dalam bentuk dan jumlah yang sesuai. Metode terbaik untuk isolasi DNA

dan RNA dan perbanyakannya tergantung pada tujuan penggunaan.

Walaupun hampir semua teknik melibatkan banyak kerja dan

membutuhkan sejumlah besar materi awal, penggunaan kit dari berbagai

perusahaan bioteknologi cukup menyederhanakan isolasi DNA dan RNA.

Isolasi baik secara klasik maupun dengan kit menggunakan prinsip dasar

yang sama (Lyrawati, 2004).

Isolasi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Jumlah,

kemurnian sampel DNA dan kondisi optimum reaksi menjadi hal yang

menentukan dalam analisis genetika molekuler. Oleh karena itu diperlukan

metode yang tepat dalam isolasi DNA (Pharmawati, 2009). Prosedur

isolasi DNA dapat berbeda-beda tergantung tujuan isolasi dan kuantitas

yang dibutuhkan (Remelia, 2008). Protokol sederhana dan singkat, seperti

dalam ekstraksi bawang atau pisang telah dikembangkan untuk

memfasilitasi eksperimen yang dapat dilakukan dengan peralatan

sederhana serta biaya yang relatif murah (De Boer, et.al., 2000)

B. Permasalahan

1. Bagaimana cara/tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara

sederhana?

2. Apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium

cepa L.?

3. Bagaimana benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.?

1

C. Tujuan

1. Mengetahui cara/ tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara

sederhana.

2. Mengetahui apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA

Allium cepa L.

3. Melihat benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.

2

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

DNA merupakan polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis

dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan. Asam

nukleat merupakan polimer nukleotida yang tersusun atas:

1. Basa Nitrogen

Terdapat dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat, yaitu

basa purin yang terdiri dari Adenin dan Guanin,serta basa pirimidin

yang terdiri dari Sitosin, Timin dan Urasil.

2. Gula Pentosa

Gugus gula pada RNA adalah ribose, sedangkan pada DNA adalah

deoksiribosa. Perbedaan keduanya terletak pada atom C nomor 2 yang

dalam RNA berikatan dengan gugus hidroksil (OH), sedangkan dalam

DNA berikatan dengan atom H.

3. Gugus Fosfat

Gugus fosfat terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan fosfodiester.

Gugus ini yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat

(Yuwono, 2008)

DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu

organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein

dan RNA, yang terdapat pada suatu sel secara bersama-sama (Weaver dan

Hedrick, 1997). Ukuran DNA yang menyusun kromosom eukariot jauh

lebih panjang daripada ukuran selnya. Oleh karena itu, DNA dikemas

dalam sistem yang sangat efisien dan kompak mengunakan protein histon.

Kompleks DNA dan protein histon (nukleosom) menyebabkan kondensasi

atau pengemasan DNA menjadi enam kali lebih kompak. Ikatan antara

DNA dengan histon ini dapat dipisahkan mengunakan garam dengan

konsentrasi tinggi. Rangkaian nukleosom membentuk struktur yang

disebut kromatin, terdiri atas DNA, protein dan RNA (kurang dari 10%)

(Yuwono, 2008).

3

Dalam penerapan teknik molekuler, bahan pokok yang harus dimiliki adah

DNA atau RNA. DNA atau RNA ini dapat diperoleh melalui proses isolasi

(Pai, 1992). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul

lain seperti dinding sel, membran sel dan membran ini sehingga

strukturnya dapat dilihat dengan jelas. Tahap dalam isolasi DNA tanaman

yaitu pengambilan sampel (jaringan), lisis dinding sel dan membran sel,

purifikasi, serta presipitasi (Kephart, 1999). Lisis sel dapat dilakukan

secara kimiawi atau enzimatik tergantung sumber DNA-nya. Zat kimia

yang biasa digunakan adalah detergen. Detergen akan menyebabkan

protein membran terdenaturasi sehingga struktur membran akan rusak.

Ekstraksi biasanya dengan menggunakan fenol-klorofom-isoamil alkohol

atau ammonium asetat yang akan mengendapkan protein. Presipitasi DNA

dapat menggunakan etanol absolute atau isopropanol, karena bersifat

sangat polar dan dapat menarik molekul air dari DNA sehingga DNA

mengendap (Schleic, 1998). Protokol ekstraksi DNA genom juga harus

memenuhi syarat, yaitu mencegah oksidasi zat fenolik yang dapat bereaksi

dengan asam nukleat dan protein untuk menghilangkan polisakarida yang

mengganggu dengan manipulasi enzimatik dalam penelitian biologi

molekuler (Oboh, 2009).

B. Hipotesis

Metode yang digunakan pada praktikum ini dapat digunakan untuk

mengisolasi DNA Allium cepa L.

4

BAB III

METODOLOGI

A. Alat

Tube plastik, mikropipet, tip, gelas beker, corong gelas, saringan, kertas

filter, blender, microsentrifuge.

B. Bahan

Umbi bawang bombay (Allium cepa L.), larutan buffer (dibuat dari

campuran akuades steril, NaCl, NaHCO3, dan detergen 10%), isoprophyl

alcohol dingin, alkohol 70%, buffer TE (tris EDTA).

C. Cara Kerja

Sel-sel umbi bawang bombay dihancurkan menggunakan blender. Juice

bawang Bombay kemudian disaring menggunakan saringan biasa,

dilanjutkan penyaringan menggunakan kertas filter. Filtrat yang diperoleh

dimasukkan ke tube plastik sebanyak 400µL. Kemudian ditambahkan

larutan buffer sebanyak 800µL. Tube digoyang-goyangkan dengan cepat

dan searah selama 3 menit untuk mencampur filtrat dan buffer.

Selanjutnya campuran disentrifugasi menggunakan microsentrifuge

dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.

Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru

sebanyak 400µL. Kemudian sebanyak 800µL isoprophyl alcohol dingin

dimasukkan secara perlahan melalui dinding tabung. Tube digoyangkan

perlahan, lalu diamati benang-benang DNA yang mulai terpisah.

Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit

untuk presipitasi DNA.

Supernatan dibuang, pellet dicuci dengan menambahkan 100µL alkohol

70% dan diresuspensi menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 10000

rpm selama 5 menit. Larutan alkohol kemudian dibuang, pellet

dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol (bias juga dengan

diserap menggunakan tisu). Selanjutnya pellet diberi 50 µL pelarut DNA

(tris EDTA), lalu disimpan dalam freezer.

5

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar 1. Presipitat DNA Allium cepa L. hasil isolasi (pellet putih di dasar tube)

B. Pembahasan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan isolasi DNA dari umbi

bawang Bombay (Allium cepa L.) dan melihat benang DNA yang

diperoleh. Penggunaan umbi dalam praktikum ini didasarkan bahwa pada

umbi kromosomnya lebih lengkap. Umbi bawang Bombay mudah didapat,

memiliki kandungan air yang tinggi dan memiliki kromosom yang relatif

besar.

Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan

mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang

terdiri atas sel-sel jaringan dan DNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi

sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA total. Pada teknik

isolasi DNA sederhana, purifikasi yang dilakukan hanya memisahkan

benang DNA dengan debris selnya. Dalam teknik isolasi ini tidak

diperoleh DNA murni, melainkan DNA kotor yang masih berikatan

dengan protein. Kemungkinan tidak hanya terdiri atas DNA tetapi juga

terdapat RNA.

6

Proses isolasi diawali dengan penghancuran sel yang dilakukan secara

mekanis menggunakan blender. Kemudian juice yang dihasilkan disaring

dua kali, menggunakan saringan biasa dan kertas filter. Ini bertujuan untuk

memisahkan DNA genom yang terlarut dalam sari umbi dengan sisa-sisa

jaringan umbi yang telah hancur. Proses dilanjutkan dengan penambahan

larutan buffer, yang terdiri atas 3gr NaCl, 10gr NaHCO3, 10ml detergen

10%, dan akuades, ke tube yang berisi filtrat umbi. Larutan buffer

merupakan larutan campuran garam dan detergen, digunakan untuk

merusak membran sel, sehingga komponen DNA dalam sitoplasma sel

dapat keluar dan diisolasi (DeBoer et al., 2000; Faatih, 2009). Garam

dalam buffer berfungsi untuk memisahkan molekul DNA dari komponen

lainnya dengan membentuk ikatan ionik dengan asam nukleat (kondisi

ionik yang lebih stabil). Deterjen dapat berasosiasi dengan protein

membran sehingga akan melarutkan protein tersebut sehingga membran

sel akan dengan mudah dilisiskan (Sambrook dan Russel, 2001).

Tube berisi campuran filtrat dan buffer digoyang-goyangkan dengan cepat

dan searah selama 3 menit agar larutan menjadi homogen. Selanjutnya

dilakukan sentrifugasi pada kecepatan rendah (3000 rpm) selama 15 menit.

Sentrifugasi ini dimaksudkan untuk memisahkan campuran menjadi dua

fase, yaitu fase terlarut dan fase organik. Fase terlarut (supernatant)

mengandung DNA genom karena memiliki berat molekul lebih ringan

dibandingkan fase organiknya. Menurut Seidman dan Moore (2000), fase

organik (pellet) yang terbentuk pada bagian dasar tabung merupakan

molekul-molekul protein dan polisakarida yang terdenaturasi.

Supernatant yang diperoleh dipindahkan ke tube yang lain, kemudian

ditambahkan isoprophyl alcohol dingin. Penambahan ke dalam supernatant

harus dilakukan perlahan-lahan dan melalui dinding sel agar tidak merusak

benang-benang DNA. Beberapa saat setelah penambahan isoprophyl

alcohol, akan tampak 3 lapisan pada tube. Lapisan pertama yang tampak

bening merupakan isoprophyl alcohol, lapisan kedua yang tampak seperti

7

kumpulan benang putih merupakan benang-benang DNA, sedangkan

lapisan paling bawah merupakan sisa supernatant DNA (Gambar 2)

Gambar 2. Presipitasi DNA setelah pemberian isoprophyl alcohol

(isopropanol), tampak benang- benang DNA (B) berwarna

putih diantara isopropanol (A) dan supernatant (C)

Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat

DNA. ion-ion seperti Na+ Mg2+ akan menyelimuti rantai DNA yang

bermuatan negatif. Di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na+)

dan negatif (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih

berikatan dengan air. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol

atau isopropanol adalah menurunkan konstanta dielektrik air atau

memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih

mudah terpresipitasi.

8

B

A

C

Gambar 3. Aktivitas pelarut terhadap DNA

Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5

menit untuk mengendapkan molekul DNA. Setelah sentrifugasi, DNA

mengendap sebagai pellet berwarna putih di dasar tube.

Pellet kemudian dicuci menggunakan alkohol 70% dan diresuspensi

dengan sentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit. Setelah dicuci DNA

tampak seperti endapan tepung putih. Alkohol yang digunakan untuk

mencuci DNA dibuang kemudian pellet dikeringanginkan untuk

menghilangkan sisa alkohol. Pellet harus terbebas dari alkohol karena

dapat merusak pellet DNA. Kemudian ditambahkan buffer TE (Tris

EDTA) yang berfungsi melarutkan DNA dan melindungi dari kerusakan

oleh endonuklease. Dengan penambahan TE ini, DNA dapat disimpan

dalam waktu yang lama sebelum digunakan untuk analisis selanjutnya

karena senyawa Tris dapat mempertahankan pH, sedangkan EDTA

mampu menghambat aktivitas endonuklease (Seidman dan Moore, 2000).

9

Pelarut Isopropanol

BAB V

KESIMPULAN

1. Tahapan isolasi DNA dengan cara sederhana meliputi penghancuran

jaringan dan lisis sel, purifikasi dari debris sel dan presipitasi DNA.

2. Dari praktikum yang dilakukan diketahui bahwa metode ini dapat

digunakan untuk mengisolasi DNA genom Allium cepa L. Namun, DNA

yang diperoleh dari metode ini berupa DNA kotor yang masih berikatan

dengan protein, juga kemungkinan terdapat pula RNA.

3. Hasil isolasi DNA tampak benang-benang berwarna putih. Setelah

dilakukan presipitasi dan sentrifugasi DNA tampak sebagai endapan putih

di dasar tube.

10

DAFTAR PUSTAKA

DeBoer, R.L., Sobieski, R.J., and Crupper, S.S. 2000. Isolation and Restriction Endonuclease Digestion of Onion in Junior College-High School Biology Laboratory. Bioscience 26 (3): 15-17

Faatih, M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi 10 (1): 61-67

Kephart, D. 1999. Rapid Isolation of Genomic DNA from Small Quantities of Human Tissue. www.promega.com/profiles/203/ProfilsinDNA

Lyrawati, D. 2004. DNA Recombination and Genetic Techniques, Transmission of Human Disease and Computer Resources for The Clinical and Molecular Geneticist (transl.Indonesian). Agric. Fac. Unibraw Publ., Indonesia (ISBN 979-508-543-3).

Oboh,B.Q., L.A.Ogunkanmi, N.Agwu. 2009. Rapid Isolation of Genome DNA suitable for PCR from Tropical Almond (T.catappa) Plant Populations. International journal of Botany 5(3):250-254

Pai, A.C. 1992. Dasar – Dasar Genetika. Jakarta: Erlangga.

Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea sp. (Proteaceae). Jurnal Biologi 8 (1): 12-16

Ramelia, M. 2008. Analisis Insersi T-DNA Pembawa Transposon pada T0 dan Aktivitas Ds pada T1 Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Kultivar Nipponbare. Jakarta: FMIPA UI

Sambrook, J.dan D.W. Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: CSHL press

Schleic, R. 1998. Genetics and Molecular Biology.3rd ed. London: John Hopkins University press.

Seidman, L.A. dan C.J.Moore. 2000. Basic Laboratory Method for Biotechnology. London: Prentice Hall

Weaver, R.F. dan P.W.Hedrick. 1997. Genetics. 3rd ed. Chicago: Wm.C. Brown. Publishers.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga

11