I. PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. Isolasi DNA adalah suatu tekhnik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan enzimatis.1.2 Tujuan

Mengetahui Definisi Isolasi DNA

Mengetahui metode dan tahapan dalan isolasi DNA

Mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3 Manfaat

Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 Definisi Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung

(Mader, 1993).Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA

(Jamilah, 2005).DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive.

Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama. (Listanto,1996)2.2 Macam-macam Metode Isolasi DNA1.Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60%

(Istanti,1999)2. Metode CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dansenyawa polifenol

(Ardiana,2009)Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).3. Phenol:chloroform

Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

(Barnum 2005)4. SaltingOut

Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein. (Barnum 2005).5. Guanidine isothiocyanate

Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

(Barnum 2005).6. Silica Gel

Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005).

7. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif

(Giri, 2004)2.3 Tahapan Isolasi DNA

Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote.

Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).

Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong molekul DNA di bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim.

Selain dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA yang ujungnya tidak beraturan.

(Yuwono,2006)2.4 Manfaat Isolasi DNA

Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melaluiteknik Hibridisasi Southern Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedurperbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. (Arumingtyas, 2012)III. METODOLOGI3.1 Alat dan Bahan Fungsi

3.1.1 Alat yang digunakan :

Mortar:menghaluskan bahan

Pistil:alat untuk menghaluskan bahan

Tips: Ujung dari mikropipet, mendetialkan pengambilan dan pengeluaran sampel

Gelas ukur: mengukur bahan cairan buffer yang akan digunakan

Tubes 1,5 ml: wadah/tabung unutk pengamatan

Tissue: pembersih alat dan pengelap

Gunting : menggunting bahan (penisah bahan dari tulang daun)

Spatula : memindahkan bahan dari mortar

Mikro pipet: untuk mengambil bahan cair

Erlenmeyer: wadah dari bahan cair

Microwave: memanaskan bahan

Mesin PCR: untuk replikasi

Oven: memanaskan bahan dan mengeringkannya

Vortex: untuk menghomogenkan campuran

Timbangan analitik : mengukur berat bahan

Stirrer: mengaduk bahan dengan cairan

pH meter: mengukur ph

Mesin elektroforesis: untuk mengelektroforesis bahan Centrifuge: untuk menghomogenkan larutan

Autoclafe: untuk menyeterilkan bahan

Lemari es: untuk menginkubasi bahan pengamatan Pipet :mengambil bahan cair3.1.2Bahan yang digunakan

Daun - Belimbing : Bahan yang diamati

bayam : Bahan yang diamati

sawi hijau : Bahan yang diamati CTAB: melisis membran sel

HCl: untuk mencuci DNA

EDTA: sebagai penyangga

Merkaptho etanol: sebagai penyangga

Nitrogen cair: membantu proses penggerusan

PVP (polivinipirolidone) : memisahkan fase organic & fenol

CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk mengurangi kontaminasi protein

Buffer pencuci: untuk mencuci DNA

Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan kontaminan polisakarida

Ethidium bromide: mengurangi kontaminan RNA

PROMEGA

: sebagai penyangga

SRR

: sebagai penyangga

Isopropanol dingin: untuk presipitasi

3.2 Langkah Kerja + dokumentasiTimbang 0.1 gr sampel daun

Masukan dalam mortar dan tambahkan sedikit PVPdan tambahkan nitrogen cair.Gerus cepat sampai halus (jangan sampai mencair).Campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5 % w/v) dan mercaptoe ethanol 4 l (kocok sebelum digunakan)

Masukan 1 ml kedalam tube ukuran

1.5 ml dan tutup kembali tube

Beri label

Tube berisi buffer reaksi

Segera vortex sampai homogen

Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit)

Kaluarkan tube dan dinginkan

Sentrifuge 10000 rpm (10 menit)

Ambil supernatan

Pindahkan ke tube baru

Tambah 500 l CHISAM

Vortex sampai homogeny

Centrifuge 10000 rpm (10 menit)

Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml

Tambah 500 l CHISAM

Centrifuge 10000 rpm (10 menit)

Pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml

Tambah 300 l isopropanol dingin secara perlahan

Bolak-balik tube perlahan

Inkubasi dalam freezer (30 menit)

Keluarkan tube ( biarkan hingga tidak terlalu dingin )

Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit

Buang supernatan dan tambahkan buffer pencuci 500 l pada pellet dalam tube kemudian vortex

Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit)

Buang supernatan

Kering anginkan pellet 20 menitTambahkan buffer TE 50-100 l dan larutka pellet DNA dengan mengetukan tube perlahanTambah 1 l RNAse , inkubasi dalam oven (37oC selama 30 menit)ISOLAT DNA

Simpan dalam Freezer

Dokumentasikan

analisis

3.3 Analisis Perlakuan

Timbang 0.1 gr sampel daun kamudian daun dimasukan dalam mortar dan tambahkan sedikit PVPdan tambahkan nitrogen cair., hati-hati alam proses pengambilan nitrogen cair. Kkemuudian setelah nitrogen cair di letakan dalam mortar, kakukan penggerusan secara cepat sampai halus (jangan sampai mencair).

Lalu campur buffer ekstraksi dengan karbon (0.5 % w/v) dan mercaptoe ethanol 4 l (kocok sebelum digunakan). Setelahnya masukan 1 ml kedalam tube ukuran 1.5 ml dan tutup kembali tube dan jangan lupa beri laleb pada tiap tube, (Tube berisi buffer reaksi), pada tube yang telah berisi buffer reaksi, masukan gerusan bahan daun yang telah halus dengan menggunakan spatula, masukan secara perlahan dan usahakan jangan sampai ad abahan yang jatuh, kemudian setelah bahan masuk dan bercampur dengan buffer reaksi segera vortex bahan sampai homogen.

Inkubasi 65o C 30 menit (balik tube tiap 15 menit). Setelah itu keluarkan tube dan dinginkan, lalau sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit). Setelah disentrifuge ambil supernatan dari bagian yang ada pada tube yang telah mengalami beberapa pemisahan bagian. Lalu pindahkan ke tube baru dengan ukuran 1.5 ml dan Tambah 500 l CHISAM kemudian Vortex lagi sampai homogeny. Centrifuge lagi dengan kecepatan 10000 rpm (10 menit).

Lalu pindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml dan tambah 500 l CHISAM lagi-lagi bahan di Centrifuge 10000 rpm (10 menit).

Dan lagi-lagi dipindahkan supernatan ke tube baru 1.5 ml dan tambah 300 l isopropanol dingin secara perlahan-lahan. Bolak-balik tube secara perlahan kmudian Inkubasi dalam freezer (30 menit), setelahnya keluarkan tube ( biarkan hingga tidak terlalu dingin ), lalu Sentrifuse (8000 rpm) selama 10 menit. Dan buang supernatan dan tambahkan buffer pencuci 500 l pada pellet dalam tube kemudian vortex.

Sentrifuse pada 9000 rpm (10 menit) kemudian buang supernatan. Kering anginkan pellet 20 menit Dan terakhir tambahkan buffer TE 50-100 l dan larutka pellet DNA dengan mengetukan tube perlahan Tambah 1 l RNAse , inkubasi dalam oven (37oC selama 30 menit).

ISOLAT DNA pun di dapatkan jangan lupa Simpan dalam Freezer, Dokumentasikan dan laporan pun siap menunggu untuk dikerjakan dan dikumpulkanIV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (Dokumentasi dan Keterangan)

NoGambarKeterangan

1Sampel yang digunakan adalah daun bayam

Hasilnya :

DNA tidak terlihat

2Sampel yang digunakan adalah daun belimbing

Hasilnya :

DNA terlihat

3Sampel yang digunakan adalah daun sawi hijau

Hasilnya :

DNA tidak terlihat

4.2 Pembahasan di banding dengan literature

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa dari ketiga hasil yang didapat dapat dilihat bahwa benang-benang yang terlihat jelas hanya di sampel no dua (daun belimbing), hal ini dikarenakan untuk sampel daun belimbing baru saja dipetik dan masih muda. Sehingga memungkinkan untuk lebih terlihat DNA nya Sedangkan pada kedua sampel lainya , DNA tidak terlihat, hal ini dikarenakan kedua sampel lainya merupakan sampel dari kelompok sebelumnya yang diambil lebih dahulu dibanding sampel daun belimbing. Selain itu kegagalan isolat lainnya pada kedua sampel ialah pada saat diletakkan pada freezer dan adanya human error. Human error pun dapat disebabkan oleh adanya kesalahan saat pengambilan supernatant atau saat pemberian larutan lainnya.Hal ini sesuai literatur yang didapat, menurut Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.Selain itu disebabkan adanya faktor internal dan eksternal.V. PENUTUP5.1 Kesimpulan

Dari hasil praktikum dapat di simpulkan bahwa pada pengamatan bahwa DNA terlihat pada sampel daun belimbing. Hal ini dikarenakan untuk pengambilan sampel daun belimbing dipetiknya baru mendekati saat pratikum dibandingkan pengambilan sampel lainnya

5.2Saran

Untuk praktikum

Alat yang digunakan perlunya pembaharuan mengenai jenis alat yang digunakan.

Waktu untuk pratikum lebih diperhatikan lagi, agar pratikan bisa mengikuti sampai tahapan terakhirUntuk assiten :

Sudah baik, lebih ditingkatkan lagi penjelasannya mbak , biar kita tidak bingungDAFTAR PUSTAKAArdiana, Dwi Wahyuni.2009.Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Teknisi Litkayasa Nonkelas pada Balai Penelitian Tanaman Buah Tropika, Sumatera Barat.B uletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16.5halArumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan

Giri, Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UMJamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri MalangListanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. BogorMader,S.S.1993.Biology.Wm.C Brown Publishers: LowaPrasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan)Barnum, 05 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole.Utami, Annisa.dkk .2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada University Press. YogyakartaZubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans.Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.