Laporan DNA

37
BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik untuk kepentingan manusia. Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme , mulai dari bakteri , fungi , hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh- tumbuhan . Rekayasa genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan yaitu bidang kedokteran dan farmasi , ilmu pangan , kedokteran hewan , pertanian (termasuk peternakan dan perikanan ), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa genetika sendiri merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat) untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang diinginkan (Chang, 2009). Mempelajari DNA bukanlah hal yang mudah karena DNA itu terlalu kecil (tidak mungkin bisa dilihat dengan mata telanjang) dan konsep-konsep mengenai DNA cukup abstrak. Kerja laboratorium berikut ini memungkinkan anda untuk bekerja dengan DNA secara kongrit dengan mengisolasi DNA total dengan menggunakan peralatan

description

vjhhm

Transcript of Laporan DNA

BAB I. PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang

Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik untuk kepentingan manusia. Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan yaitu bidang kedokteran dan farmasi, ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanian (termasuk peternakan dan perikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa genetika sendiri merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat) untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang diinginkan (Chang, 2009).

Mempelajari DNA bukanlah hal yang mudah karena DNA itu terlalu kecil (tidak mungkin bisa dilihat dengan mata telanjang) dan konsep-konsep mengenai DNA cukup abstrak. Kerja laboratorium berikut ini memungkinkan anda untuk bekerja dengan DNA secara kongrit dengan mengisolasi DNA total dengan menggunakan peralatan dasar dan juga metode yang sama dengan yang digunakan para Ilmuwan (Campbell, 2002).

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA.

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan aleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektroda. Elektroforesis melalui gel agarose atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA (Sudjadi, 2008).

Hal tersebut sangat berkaitan dengan praktikum kali ini dimana berkaitan dengan isolasi DNA kromosom dan plasmid dimana untuk mengetahui berat molekulnya serta untuk membedakan keduanya.1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Bagaimana cara mengisolasi DNA kromosom dan plasmid ?

1.2.2 Bagaimana cara menentukan berat molekul DNA kromosom dan plasmid1.2.3 Bagaimana cara membedakan antara DNA kromosom dan plasmid ?1.3 Tujuan

1.3.1 Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA kromosom dan plasmid.1.3.2 Memahami dan mengetahui berat molekul DNA kromosom dan plasmid1.3.3 Membedakan DNA kromosom dan plasmid1.4 Manfaat

Manfaat praktikum analisis kali ini adalah kita dapat mengisolasi DNA kromosom serta plasmid dari suatu bakteri sehingga kita dapat mengetahui teknik dasar yang dipakai untuk rekayasa genetika.

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 DNASemua makhluk hidup memiliki materi genetik untuk mempertahankan kelangsungan struktur, sifat, fungsi dan aktivitas-aktivitas kimia dalam selnya. DNA merupakan salah satu jenis asam nukleat yang berperan sebagai materi genetic yang menurunkan sifat tertentu dari satu generasi ke generasi turunannya. Materi ini mengarahkan pembentukan protein dan RNA tertentu yang penting dalam sel makhluk hidup. DNA juga mengatur pertumbuhan dan pembelahan sel, termasuk informasi untuk diferensiasi sel sehingga terbentuk tumbuhan, hewan, manusia dan mikroorganisme lainnya. Begitu pentingnya DNA ini sehingga disebut sebagai molekul utama kehidupan (Wirahadikusumah, 1985).

DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organism (Jamilah, 2005).

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang berhubungan. Molekul molekul yang berisi ikatan demikian itu mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah struktur kimia yang berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu. Misalnya saja satu atom hidrogen dapat berpindah dari suatu gugusan asam amino (-NH2), dengan meninggalkan gugusan asam amino (-NH) dan muatan negatif netto yang diserap oleh sistem cincin molekul yang berkonjugasi. Fluktuasi kimia semacam itu disebut pergeseran tautomer, dan struktur molekul berbeda yang dihasilkannya disebut tautomer (Goodenough, 1988).

DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan phospat. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. Ikatan-ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat ( PO4-) sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga diberi nama asamnukleat (Goodenough. 1988).

DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu. DNA alami terdiri dari dua rantai anti parallel dalam suatu rangkaian heliks ganda. Basa A-T dan G-T yang saling komplementer tersusun berpasangan melalui ikatan hydrogen pada heliks (Lehninger, 1982).

DNA akan mengalami denaturasi dan renaturasi. Jika suatu larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau diberi alkali kuat, maka hubungan hydrogen menjadi labil dan putus. Dua pita spiral dari molekul DNA itu membuka. Proses ini disebut denaturasi DNA. Jika larutan tersebut kemudian didinginkan kembali atau dinetralisis secara perlahan-lahan maka terbentuklah pasangan-pasangan basa itu kembali. Peristiwa ini dinamakan renaturasi. Molekul DNA juga dapat mengalami replikasi. Ada tiga cara replikasi molekul DNA, yaitu secara:1. Semi konservatif yaitu dua pita spiral dari `double helix` memisahkan diri. Tiap pita tunggal dari 'doublehelix' parental ini berlaku sebagai pencetak (model) untuk pembentuk pita pasangan yang baru.

2. Konservatif Double helix parental tetap utuh, tetapi keseluruhannya dapat mencetak double helix baru.

3. Dispersif Kedua buah pita dari double helix arental terputus-putus. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA yang dibentuk baru saling bersambungan dan menghasilkan dua double helix baru (Jack, 1995).

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah. DNA plasmid berukuran lebih kecil dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi sendiri. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim (Alatar, 2012).

Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu replication origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar. Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :

a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi

b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia

c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi

d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi

e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999).

Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).2.2 Isolasi DNAIsolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA ( Glick, 2005). Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel (Murray, 2000).

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Alberts et al, 2000).

Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Harth et al, 2000).

2.3 Isolasi DNA Kromosom

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Cooper, 2000).2.4 Isolasi DNA Plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol (Cooper, 2000).2.5 Elektroforesis Gel Agrosa

Metoda ini didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar.

Gambar 2.5 Foto produk PCR pada gel agrosa

(Smith,J.E, 1996).

BAB III. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Gelas ukur

Alat sentrifugasi

Tabung reaksi

Beaker gelas

Erlenmeyer

Pipet volume

Ball pipet

Waterbath Shaker incubator

Penangas air

Set alat elektroforesis

Power supply

Spektrofotometer

Tabung eppendorf

3.1.2 Bahan

- Koloni tunggal isolat A

- Buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA)

- Pecahan kaca steril

- Larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K)

- Larutan fenol jenuh

- Larutan natrium asetat 0,3 M

- Etanol absolut

- ddH2O

- Koloni tunggal transforman E.Coli

- Glukosa

- Tris-Cl 2.5 mM pH 8

- Na2EDTA 10 mM Ph 8

- NaOH 0.2 N

- SDS 1%

- Aquades - Kaliaum asetat 5M

- Asam asetat glasial- Fenol

- Kloroform

- Isoamil alkohol

- Gel Agarosa 1%

- Bromofenol biru 0,25%

- Sukrosa 40%

- Larutan EtBr

3.2 Alur Percobaan

3.2.1 Isolasi DNA kromosom

diinokulasikan ke dalam 5 mL media cair

diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 30oCdengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam

disentrifugasi selama 2 menit 5 mL suspensi sel dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC

dibuang supernatan dan pellet sel diresuspensi dengan 250 uL buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA)

ditambahkan 0,2 gram pecahan kaca steril kemudian dikocok selama 15 menit

ditambahkan larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50 uL ke dalam susupensi dan dicampur rata

dipanaskan campuran dalam waterbath pada suhu 50oC selam 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan

ditambahkan 300 uL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai terbentuk emulsi

disentrifugasi campuran pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit selama terpisah 2 lapisan

dipipet lapisan atas secara berhati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung eppendof yang steril

ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total hasil pemipetan DNA , lalu dicampur pelahan

ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan

diinkubasi campuran pada suhu -20oC selam 2 jam sampai semalam

disentrifugasi campuran pada 12000 rpm selama 5 menit

dibuang supernatan dan dicuci pellet dengan 0,6 mL etanol 70%

disentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit

diambil pelet dan ditambahkan 30 uL ddH2O

3.2.2 Isolasi DNA plasmid Pet-endo

diinokulasikan ke dalam 5 mL media LB cair yang mengandung 2,5 uL kanamisin

diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan 150 rpm selam 16 jam

disentrifugasi 5 mL suspensi sel selama 2 menit dengn kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC

disuspensi pellet dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 uL dan dihomogenkan lalu di diamkan 5 menit

ditambah 200 uL larutan II (NaOH o.2 N 20 uL, SDS 1% 100 uL, aquades steril 880 uL)

dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung Eppendorf

diinkubasi larutan selama 15 menit

ditambah 150 uL larutan III (kaliaum asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)

dipindahkan supernatan secara perlahan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril

ditambah campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total

dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit

dipindahkan fasa cair dengan cara mempipet secara hati-hati kedalam tabung eppendorf baru yang steril

dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam

disentrifugasi campuran 12.000 rpm selama 5 menit

dicuci pellet dengan etanol dingin 70%

disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf dikeringkan dari etanol 5 menit

dilarutkan pellet dalam 30 uL ddH2O

3.3.3 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

dibuat dengan melarutkan 0,4 g agarosa dalam 40 mL buffer TAE (40 mM Na2EDTA pH 8/stok buffer TAE 5x : 24,2 gr, 5,72 mL asam asetat glasial dan 10 mL dengan pemanasan

dilarutkan agarosa dan didinginkan sampai kira-kira temperatur 45oC

dituangkan gel pada cetakan dan dibiarkan memadat

dicampur dengan buffer pembeban 1x ( bufer pembeban 6x bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)] pada sel yang dielektroforesis

dilakukan elektroforesis dalam bufer TAE pada tegangan 70-100 volt

dihentikan elektroforesis ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel

direndam gel agrosa dalam larutan EtBr 250 ug/mL selama 3-5 menit

direndam dalam bufer TAE selama 5-10 menit atau aquades

diamati Pita-pita DNA dengan sinar UV.

3.3 Prosedur Kegiatan3.3.1 Isolasi DNA kromosomKoloni tunggal isolat A diinokulasikan ke dalam 5 mL media cair dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 30oCdengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 mL suspensi sel disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah, supernatan dibuang kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 uL buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA), kemudian ditambahkan 0,2 gram pecahan kaca steril kemudian dikocok selama 15 menit. Lalu menarmbahkan larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50 uL ke dalam susupensi dan dicampur rata. Campur an ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 50oC selam 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian ditambahkan 300 uL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai terbentuk emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit selama terpisah 2 lapisan. DNA yang diinginkan berada pada lapisan atas. Lapisan atas dipipet secara berhati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung eppendof yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total hasil pemipetan DNA , lalu dicampur pelahan. Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian tabung bolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu, campuran diinkubasi pada suhu -20oC selam 2 jam sampai semalam. Campuran disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 mL etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit. Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 uL ddH2O.3.3.2 Isolasi DNA plasmid pE-endo

Koloni tunggal transforman E.Coli diinokulasikan ke dalam 5 mL media LB cair yang mengandung 2,5 uL kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan 150 rpm selam 16 jam. Kemudian sebanyak 5 mL suspensi sel di sentrifugasi selama 2 menit dengn kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 uL dan dihomogenkan lalu di diamkan 5 menit. Ditambah 200 uL larutan II (NaOH o.2 N 20 uL, SDS 1% 100 uL, aquades steril 880 uL) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung Eppendorf, larutan di inkubasi selama 15 menit, setelah 15 menit ditambah 150 uL larutan III (kaliaum asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), di inkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut disenfrugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C, supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambah campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah fasa emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair dipindah dengan cara mempipet secara hati-hati kedalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol dingin 70% sentrifugasi lagi dan tabung eppendorf di kkeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 30 uL ddH2O.

3.3.4 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Gel agarosa 1%ndibuat dengan melarutkan 0,4 g agarosa dalam 40 mL buffer TAE (40 mM Na2EDTA pH 8/stok buffer TAE 5x : 24,2 gr, 5,72 mL asam asetat glasial dan 10 mL dengan pemanasan. Setelah agarosa terlarut dan didiginkan sampai kira-kira temperatur 45oC, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan buffer pembeban 1x ( bufer pembeban 6x bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)]. Elektroforesis dilakukan dalam bufer TAE pada tegangan 70-100 volt. Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agrosa kemudian direndam dalam larutan EtBr 250 ug/mL selama 3-5 menit, selanjutnya direndam dalam bufer TAE selama 5-10 menit atau aquades. Pita-pita DNA dapat diamati dengan sinar UV.BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN1.1 Hasil

4.1.1 Isolasi DNA plasmid

No.PerlakuanHasil

1.Suspensi disentrifugasi dengan suhu 40CDihasilkan pellet dan supernatan

2.

Pelet +100(L larutan IWarna kekuning

Dihomogenkan (disentil) dalam es, diamkan 5 menitHomogen

+200(L larutan IIWarna kekuningan

Dihomogenkan (dibolak-balik)Homogen

Diinkubasi Warna kekuningan

3.+larutan III 150(L, diinkubasi 10 menit, disentrifugasi (I)Terbentuk supernatan dan pelet

4.Supernatan diambil 0,15mLTidak berwarna

+larutan IV dengan perbandingan 1:1 (150(L), dikocokTidak berwarna

Sentrifugasi (II)Terbentuk 2 fase (atas: tidak berwarna, bawah: keruh)

5.Bagian atas diambil (0,1mL), +200(L etanolTidak berwarna

Diinkubasi 1 jamTidak berwarna

Disentrifugasi (III)Didapat pelet dan supernatan

6.Pelet ditambah etanol dingin 70%, disentrifugasiDidapat pelet dan supernatan

4.2.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

No.Perlakuan Gambar

1.Dielektroforesis menggunakan agarosa pada tegangan 70-100 volt dan hasilnya diamati dengan sinar UV

1.2 Pembahasan

Praktikum kali ini berkaitan dengan isolasi DNA plasmid. Dimana dalam praktikum kali ini yang digunakan adalah bakteri Escherchia coli, dikarenakan bakteri ini mudah didapatkan, menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat dan memiliki jumlah plasmid yang banyak. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler yang berukuran relatif kecil yang berada di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, terutama pada bakteri. Gen yang berada di dalam plasmid tidak esensial bagi kelangsungan dan pertumbuhan bakteri, namun gen tersebut sering menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut kemudian akan menghasilkan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Secara garis besar prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA plasmid adalah sama dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Prinsip yang digunakan adalah melakukan isolasi plasmid yaitu dengan melakukan sentrifugasi dan presipitasi. Hal ini dilakukan dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung plasmid (Blackwell 1997).Perlakuan pertama dalam praktikum ini yaitu pada sampel, dimana sampel didapatkan dari bakteri Escherchia coli. Dalam hal ini sampel kemudian di sentrifugasi denan 10.000 rpm selama 2 menit dengan suhu 4oC. Proses ini akan terbentuk supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih tinggi. Posisinya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Sel dari bakteri Escherichia coli akan berada pada pelet sehingga supernatan harus dibuang. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Selanjutnya supernatan di simpan dan hasil peletnya diambil. Pelet yang diambil kemudian ditambahkan dengan larutan I , dimana larutan I adalah campuran dari glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na-EDTA 10 mM pH 8 sebanyak 100 mL, dimana larutan ini berfungsi untuk untuk memecah dinding sel dan mensuspensikan pelet sampai larut. EDTA dapat menghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA sebagai pengkelat Mg2+ yang berperan merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu, Tris-Cl juga berfungsi untuk menjaga pH larutan. Kemudian dihomogenkan dengan cara di ketuk-ketuk dan dididamkan.Tahap selanjutnya yaitu ditambahkan larutan II 200 uL dimana terdiri dari NaOH 0,2 N 20 uL, SDS 1% 100 uL, aquades steril 880 uL. Larutan 2 digunakan untuk mengendapkan dinding sel bakteri. SDS dalam larutan ini berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein, sedangkan NaOH berfungsi untuk mendenaturasi DNA genomik. Kemudian dihomogenkan dengan cara di bolak balik dan kemudian diinkubasi selama 15 menit, inkubasi pada tahap tersebut berfungsi untuk melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme.

Tahap selanjutnya yaitu ditambahkan dengan larutan III 150 uL, dimana larutan III ini terdiri dari kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin. Kalium asetat akan mengakibatkan terjadinya renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam yang tinggi. Penambahan Larutan III juga berfungsi untuk mempertahankan pH agar DNA plasmid tidak rusak. Setelah itu, diinkubasi selama 10 menit.

Selanjutnya yaitu disentrifugasi kembali dengan 12000 rpm pada suu 40oC selama 5 menit, dan dilakukan setelah penambahan ketiga larutan di atas sehingga diperoleh pelet dan supernatan. Praktikum kali ini diambil supernatan dan peletnya disimpan. Supernatan yang diperoleh tidak berwarna, menunjukkan bahwa sama-sama sudah terendapkan dengan sempurna sehingga tidak mencemari supernatan. Supernatan dipindahkan, dan ditambahkan larutan IV, dimana larutan IV tersebut terdiri dari campuran pelarut organik (fenol, kloroform) 1:1, dimana berfungsi untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor lain dalam larutan. Pelarut organik akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA (Sambrook & Russell 2006). Setelah disentrifus, terlihat akibat dari penambahan pelarut organik tersebut, yaitu DNA plasmid berada pada lapisan atas. Setelah itu kemudian dikocok atau dibolak balik.

Metode lain yang biasa digunakan dalam deproteinase selain menggunakan fenol-klorofrom adalah metode pengikatan dengan silika. Prinsip kerja dari metode ekstraksi DNA dengan silika adalah menyerap DNA dengan menggunakan silika dan garam chaotropik. Garam chaotropik berfungsi untuk merusak jaringan ikatan hidrogen dalam air dan protein sehingga membuat protein-protein yang merupakan kotoran-kotoran pada DNA denaturasi atau lisis. Pada larutan asam (pH < 7,5), DNA akan diserap oleh silika , sedangkan pada pH basa dan konsentrasi garam rendah, DNA secara efisien adakn dipisahkan dari silika (Gregory & Funnell 2004).

Perlakuan selanjutnya yaitu disentrifugasi kembali 12000 rpm selama 2 menit. Hal ini dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair. Pada bagian atas tersebut merupakan supernatan, dan kemudian di pindah dengan cara memipet secara hati-hati dalam tabun eppendorf baru yan steril, kemudian dipekatkan dengan menamabakan etanol absolut. Penambahan etanol absolut bertujuan untuk mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan polaritas. Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan dingin dengan tujuan agar banyak DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan dengan menggunakan etanol absolut dingin, yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-asetat yang berfungsi sebagaineutralize charge pada gula fosfat DNA, maka ion-ion seperti kation Na+akan menyelimuti rantai DNAyang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif(Na+) dan negative (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Air memiliki konstanta dielektrik yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik seperti etanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi (Brown 2010).

Perlakuan selanjutnya setelah ditambahkan etanol absolut yaitu diinkubasi lai selama 1 jam. Langkah selanjutnya adalah melakukan sentrifugasi kembali dan diperoleh pelet dalam jumlah yang sangat sedikit. Supernatan dibuang dan dilakukan penambahan etanol 70% pada pelet. Tujuan penambahan etanol yaitu untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga diperoleh plasmid yang murni. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung. Kemudian membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama 5 menit. Setelah itu, menambahkan 50 mikrolit dH2O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak 8 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur. Langkah terakhir, memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

Perlakuan selanjutnya yaitu denan elektroforesis, dimana elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutb yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Yuwono 2005).Elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana, mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000 pb.

Selain itu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV. Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen. Gambar pada hasil pengamatan kami ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.

BAB V. PENUTUP5.1 Kesimpulan

Adapun kesimpulan untuk praktikum isolasi DNA kromosom dan Plasmid adalah sebagai berikut

a. Suatu DNA plasmid diisolasi dengan beberapa tahap yakni resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. b. Proses elektroforesis digunakan untuk menandai adanya suatu DNA yang berhasil diisolasi dan diindikasi dengan adanya suatu lekukan berwarna orange nyala api pada agarosa yang dianilasa menggunakan sinar ultraviolet5.2 Saran

Adapun saran dari praktikum kali ini adalah :1. Praktikan lebih teliti dalam mengamati perubahan-perubahan proses dalam plasmid isolasi DNA.

2. Praktikan lebih berhati-hati dalam melakukan praktikum agar alat-alat praktikum tidak mudah rusak.

3. Praktikan harus menjaga kesterilan alat-alat praktikum dan menjaga kesterilan tubuh sehingga tidak terkontaminasi dengan mikroba.

DAFTAR PUSTAKA

Alatar, et al.. 2012. Molecular Structure of Bacterial Plasmids. Bacteriological Reviews. New York : USA.

Brock, T. D., Michael T. Madigan, John M. Martinko and Paker. 1994.Biology of Microorganisms. New Jersey: Prentice Hall.Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta : Erlangga.

Chang W. 2009. Bioetika sebuah pengantar. Yogyakarta: Kanisius.Goodenough.1988. Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.

Glick. 2005. Understanding DNA. Amsterdam : Academic Press.Jamilah.2005. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: VI Press.

Mader.1993. Plasmid biology. Washington: ASM Press.

Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor :Pustaka Wirausaha Muda.

Radji, 2011. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler. Yogyakarta: Universitas Negeri Yogyakarta.

Saunders and Parkers.1999. The Condensed Protocols From Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Suharsono dan Widyastuti.2006. Analisis DNA. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Universitas Pangan dan Gizi IPB.Susanto.2012. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB.

Wirahadikusumah.1985. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda. Koloni tunggal isolat A

Hasil

Koloni tunggal transforman E.Coli

Hasil

Gel Agarosa 1%

Hasil