Isolasi DNA - blog.ub.ac.idblog.ub.ac.id/sonianeh/files/2012/03/Isolasi-DNA.pdf · UJI KUALITAS DNA...
Transcript of Isolasi DNA - blog.ub.ac.idblog.ub.ac.id/sonianeh/files/2012/03/Isolasi-DNA.pdf · UJI KUALITAS DNA...
ISOLASI DNA
Oleh :
Sonia Tambunan 105040201111171
DNA
2 Benang
TAHAPAN UMUM ISOLASI
DNA
Perusakan Dinding Sel
• Penggunaan Nitrogen Cair
Lisis Membran Sel
• Penggunaan Detergen Kationik (CTAB)
Pemurnian
• Beberapa Kontaminan Seperti Senyawa Sekunder
Presipitasi (Penggumpulan DNA)
• Menggunakan isopropanol dingin
ALAT YANG DIGUNAKAN
Mortar dan Pestle Tabung Nitrogen Tube Eppendorf 1,5 ml atau 2 ml
Mikropipet
Oven Freezer Mesin
Elektrofotometer Mesin
Spektrofotometer
Mesin Sentrifuse Pipet tip 1000 µl
dan 20 µl
METODE
• Doyle and Doyle, 1987 1.
• Fatchiyan 2.
• Karsian, et al, 2002 3.
LANGKAH KERJA
Timbang daun 0,5 gram. Gerus ( + Nitrogen Cair dan PVP)
+ Buffer CTAB 1 ml + betq mertcaptoethanol 5 µl
Vortek, inkubasi T = 65°C 30 menit + chisam/CIA 700 µl, vortek
Sentrifuse 6000 rpm, 10 menit diambil supertan + CHISAM 100 µl
Sentrifuse 6000 rpm . 10 menit ambil supernatan + isopropanol dongin inkubasi freezer 30 menit
Sentrifuse 6000 rpm. 10 menit. Ambil pellet dan buang supernatannya
+ 200 µl buffer pencuci (2x) endapan dikeringkan
+ 500 µl TE (resuspensi DNA) + 1 µl RNAase, inkubasi T = 35°C, 30 menit
Setelah dingin + ethanol dingin, inkubasi dalam freezer 30 menit
Sentrifuse 6000 rpm, 10 menit, endapan dikeringkan
Resuspensi 200 µl buffer TE
Elektroforensis
UJI KUALITAS DNA E
lektr
ofo
ren
sis
den
gan
gel
agar
ose
• Prinsip kerja
• Visualisasi dengan sinar UV
• DNA bergerak mengikuti aliran listrik
• Ethidium Bromida
• Smear
• Fire type
Kual
itas
Has
il I
sola
si
• Besar DNA total hasil isolasi
• Semakin besar maka semakin tebal dan dekat dengan sumur
• Kontaminan
Sp
ektr
ofo
tom
eter
• DNA : 260 dan Protein : 280
• 1,8 – 2,0 = DNA murni
• < 1,8 = kontaminan protein
• > 2,0 = kontaminasi fenol, kloroform, RNA (RNAase)
PCR
Polimerase Chaine Reaction
KOMPONEN PCR
MgCl2
Buffer
dNTP
Primer Enzim DNA Template
TAHAPAN PCR (SIKLUS PCR)
Denaturas
• Proses pemecahan ikatan hidrogen dari double strand menjadi singlestrand
• Suhu 94°C – 95°C
Annealing
• Proses penempelan primer pada DNA template yang komplemen dengan urutan basa primer
• Suhu 50°C – 55°C
Elongation
• Proses pemanjangan daerah yang komplemen dengan primer
• Suhu 72°C
MANFAAT PCR Sat
u
Keragaman genetik tanaman kekerabatan
Dua Seleksi
Tig
a Uji kemurnian benih
DOKUMENTASI
PRAKTIKUM
ALAT DAN BAHAN