ISOLASI DNA

Oleh :

Sonia Tambunan 105040201111171

DNA

2 Benang

TAHAPAN UMUM ISOLASI

DNA

Perusakan Dinding Sel

• Penggunaan Nitrogen Cair

Lisis Membran Sel

• Penggunaan Detergen Kationik (CTAB)

Pemurnian

• Beberapa Kontaminan Seperti Senyawa Sekunder

Presipitasi (Penggumpulan DNA)

• Menggunakan isopropanol dingin

ALAT YANG DIGUNAKAN

Mortar dan Pestle Tabung Nitrogen Tube Eppendorf 1,5 ml atau 2 ml

Mikropipet

Oven Freezer Mesin

Elektrofotometer Mesin

Spektrofotometer

Mesin Sentrifuse Pipet tip 1000 µl

dan 20 µl

METODE

• Doyle and Doyle, 1987 1.

• Fatchiyan 2.

• Karsian, et al, 2002 3.

LANGKAH KERJA

Timbang daun 0,5 gram. Gerus ( + Nitrogen Cair dan PVP)

+ Buffer CTAB 1 ml + betq mertcaptoethanol 5 µl

Vortek, inkubasi T = 65°C 30 menit + chisam/CIA 700 µl, vortek

Sentrifuse 6000 rpm, 10 menit diambil supertan + CHISAM 100 µl

Sentrifuse 6000 rpm . 10 menit ambil supernatan + isopropanol dongin inkubasi freezer 30 menit

Sentrifuse 6000 rpm. 10 menit. Ambil pellet dan buang supernatannya

+ 200 µl buffer pencuci (2x) endapan dikeringkan

+ 500 µl TE (resuspensi DNA) + 1 µl RNAase, inkubasi T = 35°C, 30 menit

Setelah dingin + ethanol dingin, inkubasi dalam freezer 30 menit

Sentrifuse 6000 rpm, 10 menit, endapan dikeringkan

Resuspensi 200 µl buffer TE

Elektroforensis

UJI KUALITAS DNA E

lektr

ofo

ren

sis

den

gan

gel

agar

ose

• Prinsip kerja

• Visualisasi dengan sinar UV

• DNA bergerak mengikuti aliran listrik

• Ethidium Bromida

• Smear

• Fire type

Kual

itas

Has

il I

sola

si

• Besar DNA total hasil isolasi

• Semakin besar maka semakin tebal dan dekat dengan sumur

• Kontaminan

Sp

ektr

ofo

tom

eter

• DNA : 260 dan Protein : 280

• 1,8 – 2,0 = DNA murni

• < 1,8 = kontaminan protein

• > 2,0 = kontaminasi fenol, kloroform, RNA (RNAase)

PCR

Polimerase Chaine Reaction

KOMPONEN PCR

MgCl2

Buffer

dNTP

Primer Enzim DNA Template

TAHAPAN PCR (SIKLUS PCR)

Denaturas

• Proses pemecahan ikatan hidrogen dari double strand menjadi singlestrand

• Suhu 94°C – 95°C

Annealing

• Proses penempelan primer pada DNA template yang komplemen dengan urutan basa primer

• Suhu 50°C – 55°C

Elongation

• Proses pemanjangan daerah yang komplemen dengan primer

• Suhu 72°C

MANFAAT PCR Sat

u

Keragaman genetik tanaman kekerabatan

Dua Seleksi

Tig

a Uji kemurnian benih

DOKUMENTASI

PRAKTIKUM

ALAT DAN BAHAN