LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI“ISOLASI DNA”

Disusun Oleh:

Nama : Ahmad Idhan RifaldiNIM : 135040201111345Kelompok : O2 Senin, 15.05-16.45 WIBAsisten : Havinda

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDalam sel makhluk hidup terdapat dua jenis asam

nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA merupakan materi genetik yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organism. DNA ada dua macam, yaitu DNA kromosomal dan DNA ekstrakromosomal.DNA ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, DNA kloroplas dan DNA plasmid.

Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu DNA yang tidak terkontaminasi oleh protein, RNA atau sel dari suatu jaringan. Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik dan enzimatis. Hal ini disebabkan membran sel dari membrane inti sebagian besar tersusun atas lipida.

1.2 Tujuan Untuk mendapatkan DNA murni dengan

memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.

1.3 ManfaatAgar mahasiswa dapat mengetahui tahapan isolasi

DNA, metode yang digunakan serta dapat mengetahui bentuk dari DNA.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNAIsolasi DNA merupakan mengeluarkan materi

DNA dari inti yang sebelumnya dinding sel harus dipecahkan terlebih dahulu dengan cara mekanik ataupun enzimatik (Kartini, 2012).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung(Mader, 1993).

DNA isolation is the use of DNA for analysis or manipulation usually requires that it is isolated and purified to a certain extend (Wilson, 2010).

Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisis atau dimanupilasi sehingga harus diisolasi terlebih dahulu agar kandungannya murni.

2.2 Macam Metode Isolasi DNA2.2.1Metode dengan Menggunakan Kit Ekstraksi DNA

(Wizard Genomic DNA Purufucation Promega)

Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan oleh Promega Corporation dan telah teruji hasilnya, namun disisi lain biaya yang dibutuhkan cukup besar (Mulyani, 2013).

2.2.2 Metode CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Amonium Bromide) dengan Phenol

Metode ini memiliki waktu pengerjaan cukup singkat dimana pada proses presipitasinya digunakan penambahan P : C : I untuk memisahkan DNA dengan materi ikutan lainnya (Mulyani, 2013).

2.2.3 Metode Modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Amonium Bromide)Metode ini memaksimalkan presipitasi DNA dengan menggunakan C : IAA secara berulang yakni dua kali untuk mendapatkan DNA yang bebas dari pengotor. Nilai konsentrasi DNA yang didapat relatif tinggi namun didalam pengerjaannya dibutuhkan waktu yang relatif lebih lama (Mulyani, 2013)

2.2.4 Metode Ekstraksi DNA dengan Thermal LysisMetode ini memiliki waktu pengerjaan yang sangat singkat. Namun dalam pengerjaannya tidak melibatkan proses presipitasi dan pencucian DNA melainkan hanya melakukan proses ekstraksi saja (Mulyani, 2013).

2.2.5 Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimofisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunkan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan

secara acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu annealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18-28 susunana basa dengan presentase G + C 50-6-% (Subandiyah, 2006).

2.2.6 Slating OutTeknik ini mneggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6M), untuk mendenaturasi protein menggunakan proteinasi K untuk denaturasi protein (Barnum, 2005).

2.2.7 Guanidine IsothiocyanateMetode ini lenih cepat dibandingkan dua metode sebelumnya. Thyocyanate bersifat toksik yang berfungsi dalam melisis dinding sel. Juga memerlukan chloroform untuk denaturasi protein (Barnum, 2005).

2.2.8 Silica GelSilica gel dapat mengikat DNA dengan perantara garam/buffer tertentu.Metode ini berlangsung cepat, tetapi recovery DNA kurang(Barnum, 2005).

2.2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction)Metode ini merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang dgunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya

komplemen dengan DNA templatenya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004).

2.3 Tahap Isolasi DNA2.3.1 Isolasi Jaringan

Tahap pertama yang dilakukan adalah mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

2.3.2 Pelisisan Dinding dan Membran SelTahap kedua yaitu melisiskan dinding dan

membrane sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

2.3.3 Pengekstrasian Dalam LarutanSelanjutnya supernatan yang terbentuk

dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan.Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

2.3.4 PurifikasiTahap purifikasi ini bertujuan untuk

membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat lainnya.Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada

suhu 65oC.Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperature.Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

2.3.5 PresipitasiPresipitasi merupakan tahap terakhir.

Tahap ini bertujuan untuk mengendapkan protein histon sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA dapat terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas ammonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap.Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Fauziah, 2010).

2.4 Manfaat Isolasi DNA2.4.1 Dalam program pemuliaan tanaman, diperlukan

identifikasi baik karakter morfologi maupun molekuler untuk menguji keragaman genotip klon-klon yang akan dipilih untuk tetua persilangan.

2.4.2 Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan dan mengindentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu dalam mendetekdi gen dan sifat-sifat tertentu, evaluasi keragaman dan evolusi pada tingkat genetik. Beberapa teknik penanda DNA tersebut adalah Restriction Fragment Length Polymorphism dan Random Amplified Polymorphic DNA(Agus, 2010).

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan3.1.1 Alat

1. Timbangan : untuk menimbang bahan2. Tubes 1,5 dan 2 ml : untuk tempat larutan3. Tip 1 ml :menampung larutan

pada micro pipet4. Mikro pipet : untuk mengambil larutan5. Vortex : untuk menghomogenkan

larutan6. Oven : untuk menginkubasi pada

suhu 65oC7. Centrifuge : untuk memisahkan DNA

dari zat lain dalam selberdasarkan beratmolekulnya

8. Frezer : untuk menggumpalkansupernatan

3.1.2 Bahan

1) Daun jagung : sebagai bahan isolasiDNA

2) Daun kacang tanah : sebagai bahan isolasiDNA

3) PVP (polivinil pirolidon): mencegah terjadinyabrowning dan kontaminasifenol

4) Nitrogen Cair : untuk merusak dindingsel

5) Chisam : menghilangkan etanol

dan flafanoid6) Isopropanol dingin : menggumpalkan DNA7) Buffer pencuci : untuk menghindari

kontaminasi8) Buffer TE 20 ml : melarutkan DNA9) Buffer ekstraksi : melindungi DNA ketika

terjadi reaksi kimia10) Mercaptoethanol : mencegah terjadinya

browning dan kontaminasipolisakarida

11) Karbon : untuk menghindarikerusakan saatpenggerusan

3.2 Langkah Kerja

Menyiapkan alat dan bahan

Mencampur buffer ekstraksi dengan karbon dan mercaptoethanol 4 µl ke dalam tube 1,5 ml

Menimbang daun tanpa tulang daun 0,1 gr dan menggerusnya di mortar menambahkan nitrogen cair dan PVP 1 gr

Memasukkan ke tube 1,5 ml

Vortex tube dan inkubasi dalam oven dengan suhu 65oC selama 10 menit lalu dinginkan sebentar

Setelah dingin, tube di sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit

Memindahkan supernatant ke tube 2 ml dan menambahkan chisam 500 µl, vortex kembali dan sentrifuge 10000 rpm selama 5 menit (melakukan sebanyak 2x)

Memindahkan supernatan ketube baru (1,5 ml) dan menambahkan 300 µl isopropanol dingin

Membolak-balik tube secara perlahan jamngan dan inkubasi dalam freezer selama 15 menit

Sentrifuge pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit,

Membuang supernatan dan menambahkan buffer pencuci 500 µl pada pellet dalam tube lalu vortex

Sentrifuge pada kecepatan 9000 rpm selama 5 menit

Membuang supernatan dan kering anginkan pellet selama 10 menit

Menambahkan buffer TE sebanyak 50 µl dan larutkan pellet DNA dengan cara mengetuk ngetuk tube secara perlahan

Mengamati DNA

Dokumentasi

3.3 Analisis PerlakuanPertama menyiapkan alat dan bahan yang

dibutuhkan dalam percobaan. Mencampur buffer ekstraksi 1 ml, karbon dan mercaptoethanol 4 µl. buffer ekstraksi berfungsi untuk melindungi DNA

ketika terjadi reaksi kimia, karbon berfungsi untuk menghindari kerusakan saat penggerusan, sedangkan mercaptoethanol berfungsi untuk mencegah terjadinya browning dan kontaminasi polisakarida, kemudian memasukkan campuran tersebut ke tube 1,5 ml. Setelah itu menimbang daun jagung dan daun kacang tanah masing-masing 0,1 gram tanpa tulang daun, memasukkan ke mortar lalu menambahkan nitrogen cair dan PVP.

Daun segera digerus sampai halus dan jangan mencair.Penambahan nitrogen berfungsi untuk merusak dinding sel agar mudah digerus, sedangkan PVP berfungsi untuk mencegah terjadinya browning dan kontaminasi fenol. Setelah itu memasukkan ke dalam tube 1,5 ml tadi, dan vortex larutan agar homogen. Lalu diinkubasi dalam oven dengan suhu 65oC selama 10 menit.Setelah dioven, mendinginkan larutan sebentar.Langkah berikutnya, larutan di sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Centrifuge berfungi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam sel berdasarkan berat molekulnya. Setelah itu, mengambil supernatan dan memindahkannya ke tube (2ml) baru.Supernatan adalah larutan yang berada diatas dan berwarna lebih bening. Lalu menambahkan 500µl chisam dan vortex lagi agar larutan homogen. Chisam: berfungsi untuk menghilangkan etanol dan flafanoid. Setelah homogen, larutan di sentrifuge lagi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.Selanjutnya, memindahkan supernatan ke tube (2ml) baru, menambahkan chisam lagi dan vortex lagi, lalu sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5

menit. Berikutnya memindahkan supernatantke tube (2ml) baru dan menambahkan 300 µl isopropanol yang berfungsi untuk menggumpalkan DNA.

Membolak-balikkan tube secara perlahan, lalu diinkubasi dalam freezer selama 15 menit.Sentrifuge kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit.Langkah berikutnya adalah membuang supernatan, lalu menambahkan buffer pencuci 500 µl pada pellet dalam tube dan vortex kembali.Buffer pencuci ditambahkan untuk menghindari kontaminasi.Kemudian sentrifuge dengan kecepatan 9000 rpm selama 5 menit.Lalu mengamati DNA yang muncul. DNA akan tampak seperti titik-titik putih dalam larutan.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HasilBerdasarkan praktikum yang telah dilakukan

didapatkan hasil bahwa DNA yang berasal dari daun tanaman kacang tanah terlihat dengan jelas, karena ukuran DNA yang hanya seperti garis melingkar putih dan menempel disekitar tube. Hal ini tidak terlihat pada daun tanaman jagung, pada daun jagung DNA tidak terlihat.

Pada Kacang tanah

Pada Jagung

4.2 PembahasanDNA yang berasal dari daun tanaman kacang

tanah terlihat jelas karena saat pengambilan sample tidak terkontaminasi dengan endapan yang dibawahnya. Sedangkan DNA yang berasal dari tanaman jagung tidak terlihat. Hal tersebut karena daun jagung yang digunakan untuk isolasi DNA adalah jagung yang berwarna hijau tua atau daun jagung yang sudah tua. Pernyataan ini sesuai dengan literatur Langga (2012) mengatakan bahwa perlakuan pada konsentrasi DNA ada tiga yaitu perlakuan suhu, lama inkubasi dan interaksi antara suhu dengan lama inkubasi, dari ketiga faktor tersebut, suhu berpengaruh nyata terhadap konsentrasi DNA begitu juga dengan lama inkubasi, sedangkan interaksi antara lama suhu dan inkubasi tidak berpengaruh nyata terhadap konsentrasi.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa pada tanaman jagung dan kacang tanah terlihat pita DNA nya, semua bahan yang digunakan saat pengamatan masih segar dan muda, hal ini berpengaruh kuat untuk terlihat atau tidaknya pita DNA pada praktikum kali ini.

5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran Untuk Praktikum Tahun Depan

Estimasi waktu sangat mempengaruhi kerja pada praktikum, karena praktikum Bioteknologi membutuhkan waktu yang cukup lama, sehingga asisten maupun praktikan harus on time agar tidak terjadi pengunduran waktu karena bisa merugikan jam praktikum selanjutnya.

5.2.2 Kritik dan Saran Untuk AsistenMbak Havinda sudah sangat baik dalam

membimbing praktikannya pada saat praktikum. Semoga bisa mempertahankan bahkan lebih baik dalam saat membimbing praktikannya.

DAFTAR PUSTAKA

Agus dan Maftuchah. 2010. Pengembangan Metode Isolasi DNA Genom Pada Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas). Malang: UMM.

Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction 2nd Edition. USA: Thomson Brooks/Cole.

Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 22 Desember 2014.

Giri, Rahman EA. 2004.Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri.Bandung:KPP Bioteknologi Bandung.

Kartini, Rizki Ayu. 2012. Karakterisasi Molekuler Padi Transgenik dengan Bebrapa Metode Isolasi DNA.Bogor: IPB Repository.

Langga, Indah F., Restu dan Tutik Kuswinanti. 2012. Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reins) Serta Analisis Keragaman Genetik Dengan Teknik RAPD-PCR. Vol.12 No.3:265-276. Program Studi Sistem-sistem Pertanian, Program Pascasarjana, Universitas Hasanuddin.

Mader, S.S. 1993. Biology.Lowa: Wm.C Brown Publishers.

Mulyani, Yuniar, dkk. 2013. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi DIni Koi

Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). FPIK Universitas Padjajaran Jatinagor.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan.Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR.Malang: Hlm. 43-50.

Wilson, Keith and John Wlker. 2010. Principles and Techniques of Biochemistry and Molekuler Biology. New York: Cambrige University Press.