Übersicht

Chemilumineszenz am Rande der Jahrtausendwendevon der Jahrmarktskuriosität zürn unentbehrlichenWerkzeug der Laboratoriurnsdiagnostik1

Chemiluminescence at the Turn of the Millenium - From Annual Fair Curiosity toIndispensable Tool of Laboratory Diagnostics

S. Albrecht2'3, T. Zimmermann4, H. Brandl5, H.-D. Saeger4, W. Distler2

Zusammenfassung: Am Rande der Jahrtausendwen-de ist eine moderne Labordiagnostik ohne den Einsatzvon Bio- und Chemilumineszenztechniken nicht mehrrealisierbar. In nahezu allen analytischen Bereichenaus Chemie, Biochemie und Medizin werden durchden Einsatz obengenannter Techniken größere Emp-findlichkeiten erreicht, was die präzise Bestimmungeiner ganzen Reihe von Analyten im nmol- und pmol-Bereich überhaupt erst ermöglicht. Gekoppelt mit völ-lig neuen gerätetechnischen Entwicklungen zur hoch-empfindlichen ein- oder zweidimensionalen Photonen-detektion, eröffnen sich neue interessante Möglichkei-ten - angefangen von Immunoassays über Trenn- undAmplifizierungsverfahren in der Molekularbiologie bishin zu Zellkulturuntersuchungen.

Schlüsselwörter: Lumineszenz; Chemilumineszenz;Chemie, Analytische.

Summary: At the end of this millenium modern labo-ratory diagnosis will be no longer feasible without uti-lization of bio- or Chemiluminescence techniques. Inalmost all analytical fields of chemistry, biochemistryand medicine higher sensitivity has been attained bythese techniques that now enable precise measure-ments in the nano- and picomole ränge. Together withthe very recent evolution of-measuring devices forhighly sensitive uni- or two-dimensional detection ofphotons, interesting new analytical possibilities areemerging. These include methods such äs immuno-assays, Splitting and amplification procedures in mole-cular biology and also the observation of cell growthin tissue culture.

1Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. Waldemar Adam, Universität Würzburg,zum 60. Geburtstag gewidmet ' '2Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe, Uni-versitätsklinikum Dresden -3Korrespondenzadresse: Priv.-Doz. Dr. habil. Steifen Albrecht,Universitätsklinikum Carl Gustav Carus der Technischen Univer-sität Dresden, Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Ge-burtshilfe, Endokrinologisches Speziallabor, Fetscherstraße 74,D-01307 Dresden. Fax: +49-351-45853344Klinik für Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie, Universitätsklini-kum Dresden5Gymnasium Kaltenkirchen " ·Eingegangen: 6. Dezember 1996

Keywords: Luminescence; Chemiluminescence; Che-mistry, Analytical.

1 Einleitung

Man kann sich heute kaum vorstellen, daß noch vor 20Jahren der Begriff Chemilumineszenz (CL) für aktivtätige LaT}ormediziner, Biochemiker oder Humangene-tiker keinerlei praktische Relevanz besaß. Systemestarker Lumineszenz fand man nur in Notlichtvorrich-tungen oder als Show-Effekt bei Großveranstaltungen.Lediglich ein sehr empfindlicher ATP-Nachweis aufder Basis der/7/2ö///2ws/?)Ttf//s-Biolumineszenz und einchemiluminometrischer Nachweis von Blutspuren inder forensischen Medizin waren schon einige Zeit be-kannt.

Ende der 70er/Anfang der 80er Jahre begann aller-dings ein wahrer Wettlauf zürn Einsatz von Lumino-phoren in der biochemischen, biomedizinischen undmolekularbiologischen Analytik, maßgeblich verur-sacht durch einen deutlich erhöhten Anspruch an Emp-findlichkeiten und die bekannten arbeitstechnischenProbleme beim Einsatz radioaktiver Isotope. Begut-achtet man die wissenschaftlichen Beiträge der beidenletzten großen klinisch-chemischen Kongresse imSommer 1996 (IFCC, London; AACC, Chicago), sofällt auf, daß ca. 20 % (!) aller Beiträge direkt oder in-direkt mit Bio- oder Chemilumineszenzmessungenverbunden waren.

Der folgende Aufsatz soll - ausgehend von der Be-sprechung der wichtigsten Luminophorsysteme - mo-derne Trends spezieller Anwendungen der CL/BL inder Labormedizin, der Klinischen und der Biochemiesowie der Medizinischen Chemie und der Molekular-biologie aufzeigen.

2 Kurzer Abriß der Grundlagen derChemi- und der Biolumineszenz

Begriff der ChemilumineszenzEmittieren Atome oder Moleküle, die sich als direkteFolge einer stark exergonen Reaktion in einem elek-tronisch angeregten Zustand befinden, eine elektroma-

© 1997 Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin J Lab Med 1997; 21 (4): 191-204 191

S Albrecht et al. Chemüumineszenz

gnclischc Strahlung, so spricht man von CL. Die emit-tierte Strahlung kann im LTV-, im IR- oder im sichtba-ren Spekiralbereich ( = 400 - 700 nm) liegen. Füranalyiische Zwecke spielen jedoch fast ausschließlichCL-Systeme eine Rolle, die im sichtbaren (VIS-) Be-reich emittieren. Da bei CL-Einissioncn die Reakti-onstemperatur deutlich unterhalb des heißen (thermi-schen) Lcuchlcns (beginnende Rotglul bei ca. 450 °C)liegt, spricht man auch von „kaltem Licht" ( 1 1 . EineEinte i lung der Lumineszenz nach Art der Anregungs-energie ist Tab. l zu entnehmen.

Speziell von Biolumineszenz spricht man, wenn inder belebten Natur vorhandene Enzyme (z. B. Luci-fcrasen) und Cofaktorcn bei der lichterzeugendcn Re-aktion eine essentielle Rolle spielen.

Tabelle 1 Einteilung der Lumineszenz nach Art derAnregungsenergie

ENERGIEART LUMINESZENZ

chemische

thermische (bis 400 °C)a-, ß-, -Strahlung

RöntgenstrahlungUV-VIS-Strahlung

elektrische

mechanische

UltraschallKathodenstrahlung(Elektronenstrahlung)

Chemilumineszenz, Biolumi-neszenzThermolumineszenzRadiolumineszenz, Szintilla-tionRöntgenlumineszenzPhotolumineszenz (Fluores-zenz, Phosphoreszenz)Elektrolumineszenz (Elektro-chemilumineszenz)Tribolumineszenz, Kristallo-lumineszenzSonolumineszenzKathodolumineszenz (TV-Bildschirm, Oszillograph)

Voraussetzungen für effiziente CLUm eine relativ starke, zu Analysezwecken nutzbareCL zu erzeugen, sollte ein chemisches Reaktionssy-stem folgenden Ansprüchen genügen: Damit einesichtbare Lichtemission erfolgen kann, muß dem Sy-stem ein exergoner Prozeß zugrunde liegen, der eineReaktionsenthalpie zwischen 168 und 294 kJ/Mol lie-fert. Soll bei einer chemischen Reaktion beispielswei-se blaues Licht der Wellenlänge 450 nm emittiert wer-den, so sind gemäß der Einsteinschen Gleichung

E = h - v bzw. E = k-^

ca. 254 kJ/Mol = ca. 2,75 eV erforderlich.

Nicht standardisierte Abkürzungen: AACC, American Associa-tion of Clinical Chemistry; AMPPD, 3-(2'-spiroadamantyl)-4-me-thoxy-4-(3"-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetan; BL, Biolumines-zenz; CAT, Chloramphenicol-Actyltransferase; CL, Chemilumines-zenz; EIA, Enzymimmunoassay; ELISA, enzyme-linked immuno-sorbent assay; IFCC, International Federation of Clinical Chemi-stry; ILMA, immunoluminometrischer Assay; LIA, Lumineszenzim-munoassay; LUC, Luciferase; MPO, Myeloperoxidase; PSA,Prostata-spezifisches Antigen; SOD, Superoxiddismutase; TNF,Tumor-Nekrose-Faktor; TPA, Tripropylamin.

Grünes Licht ( = 500 nm) erfordert ca. 228 kJ/Mol= ca. 2,48 eV, rotes Licht ( = 600 nm) hingegen nurca. !90kJ/Mo) = 2,07eV[2].

Nach Chandross und Sonntag \3] muß die erforder-liche Reaktionsenthalpic in einem einzigen Reaktions-schritt freigesetzt werden, und zwar in möglichst kur-zer Zeit und in einem möglichst kleinen Reaktionsvo-lumen, so daß eine Löschung durch Sekundärreaktio-nen möglichst gering gehalten werden kann. Aus die-sem Grund muß bei einer Beteiligung mehrerer Bin-dungen am Ausgangsschritt die Lösung bzw. Knüp-fung dieser Bindungen in einem konzentrierten Reak-tionsschritt erfolgen [4J.

Ein Maß für die Effizienz einer chemilumineszentenReaktion ist ihre Quantenausbeute OCL, das ist die An-zahl der emittierten Lichtquanten pro reagierendemMolekül. Für die direkte CL gilt:

<*>CL = · $ES ·= Ausbeute an Reaktionsprodukt

$ = Ausbeute an Reaktionsprodukt im elektronisch angeregtenZustand (excited state)

= Fluoreszenzquantenausbeute

Für sensibilisierte CL-Prozesse vgl. [6].

3 Systeme starker LumineszenzEine Übersicht zur OCL wichtiger und praxisrelevanterCL-Systeme kann Tab. 2 entnommen werden. Die zubesprechenden Systeme sind in Abb. l unter Angabeder energiereichen Zwischenstufe und des primär elek-tronisch angeregten Produkts zusammenfassend darge-stellt. Es sind alle für die biochemische Analytik wich-tigen Systeme erfaßt worden. Insgesamt macht es einemoderne und hochempfindliche Meßtechnik allerdingsheutzutage auch möglich, mit Systemen schwacherLumineszenz zu arbeiten.

4 Spezielle Anwendungen der Chemi-und Biolumineszenz in der Biochemie,der Laboratoriumsmedizin und derMolekularbiologie

Gegenwärtig erscheinen in der internationalen Fachli-teratur weit über 1000 Originalarbeiten pro Jahr zuFragestellungen der Chemi- und Biolumineszenz,wobei der Anteil der Arbeiten über Anwendungen inder biochemischen Analytik und Labordiagnostik ex-ponentiell ansteigt.

Tab. 3 faßt die wichtigsten Anwendungsgebiete dermodernen Lumineszenztechnik zusammen. Dabeikommen unterschiedlichste CL-Systeme von strong(4>CL ca. 0,9...0,01 Einstein/moi) bis ultra weak (<i>CLca. l O"15 Einstein/mol) zum Einsatz.

4.1 MeßgeräteZur Detektion des Chemi- oder Biolumineszenzlichtswurde in den letzten Jahren eine breite Palette von Lu-minometern entwickelt. Neben der parallelen Entwick-

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S. Albrecht et al.: Chemilumineszenz

Tabelle 2 Zusammenstellung von

Luminophor

LuminolIsoluminolLucigeninAryloxalate + Fluorescerp-Chlorphenylmagnesiumbromidbakterielle Luciferine/LuciferasenAequorinPholasinFirefly Luciferin/LuciferaseAdamantand ioxetane

*) Ca.-Angaben, da von konkreten

. für ausgewählte Systeme

Xmax [Emiss.-max. in nm]

424425 .530-475460 - 480469495565477

Reaktionsbedingungen abhängig

. [Einstein/mol]*)

0,010,0010,020,05 - 0,50

10-6-1 0'80,05 - 0,300,15 - 0,200,100,90

10-4 (in DMSO bis 0,20)

Tabelle 3 Die wichtigsten Anwendungsgebiete auf einen Blick

chemisch-analytischeTechniken• Nachweis toxischer

Spurenelemente• Nachweis toxisch-

aromatischer Verbindungen• Nachweis von Aminosäuren• Nachweis von NOX• Nachweis von SOX

Chemi- oder Biolumineszenzmessungen

biochemische Techniken

1 Immunoassays1 Ligandenbindungsassays1 Zellstoffwechseluntersuchungen'• Lipidperoxidationsuntersuchungen• enzymkatalysierte Reaktionen"• Nachweis kleiner Biomoleküle• Western-Blot

molekularbiologischeTechniken

DNA-HybridisierungsassaysNorthern-BlotNachweis von PCR-ProduktenSouthern BlotMutationssucheReportergenassays einschl. Lumi-nographie transfektierter Zellen

lung von Röhrchen- und Mikrotiterplatten-Luininome-tern ersetzen als jüngste Entwicklungen jetzt auchzweidimensionale Luminographen die alte Filmbelich-tungstechnik. Einen Überblick der Markt-situation gibtStanley [5]. Die Empfindlichkeit der Meßgeräte reichtbis zur Detelction von Einzelphotonen, was ein Arbei-ten in sehr niedrigen Konzenträtionsbereichen erlaubt.Die meisten Luminometer gestatten mehrere Injektio-nen von Reagenzien unmittelbar vor dem Meßprozeß,variable Meßzeiten und Temperierbarkeit. Speziell fürvollautomatisierte Immunoassays wurde eine Reihevon Meßgeräten entwickelt, die dort zu besprechensind.

4.2 ATP- und NAD(P)H-abhängige SystemeMit Reaktionen, die den beiden ersten Beispielen inAbbildung l entsprechen, lassen sich ATP undNAD(P)H in biologischen Medien bis zu einer Grenz-konzentration von l O'12 bzw. 10"9 mol l"1 bestimmen.Für etwa 100 Substrate und Enzyme, die mit ATP oderNAD(P)H in Zusammenhang stehen, wurden bis datoempfindliche Nachweissysteme (Assays) beschrieben,darunter solche für

ADP, ATPase, Coenzym A, Kreatin, Glucose, Glucose-phosphate, Glycerin, Triglyceride, Kreatinkinase, Eno-lase, Hexokinase, Pyruvatkinase [Firefly-Luciferase-System] bzw. Androgene, Aldehyde, Ammoniak, Etha-nol,· Flavin-adenin-dinucleotid (FAD);Flavinmononu-cleotid (FMN), freie Fettsäuren, Harnstoff, Lactat, Ma-lat, Estrogene, Fumarat-Hydratase, Lactatdehydrogen-ase und Malatdehydrogenase [bakterielle NAD(P)H-abhängige Luciferase] [6].

Das biolumineszente Prinzip der ATP-Messung läßtsich auch zum mikrobiologischen Bakterien-Screeningnutzen. Dabei wird die Empfindlichkeit der Bakteriengegen Antibiotica bestimmt, indem die Änderung ,derATP-Konzentration mit der Zeit - als Maß für das Ab-sterben der Bakterien - gemessen wird. Durch intrazel-luläre ATP-Messung können auch die Aktivität unddas Alter von Erythrocyten und Spennatocyten be-stimmt sowie die thrombin-induzierte Freisetzung vonATP aus Thrombocyten und das Muster des Erythro-cytenabbaus untersucht werden. Die Anwendung derSysteme für genetische Proben wird in den Abschnit-ten 4.5 und '4.6 beschrieben.

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S Albrecht et al Chemilumineszenz

Lumlnophor Zwischenstufeprim r angeregtes Φ c\_

Produkt [Einstein/mol ]

0-Luciterin aus Phodnut pyrgHs(nmenk LeuclitkAfer)•FiroftyLucifertn"

ÁÔÑ/ÌÏ?Ö

Oa, Flrefly.luctfere*«

NAD(P)H/ Oa

CHafCH^ioCHO

CH3

NOArAcridiniumester

'N HH

NH2

Luminollv,__ 0 O < RC\^—o-c-c-o—?/$

R = C l , NO2, HsCiCHj.) OCO—

OCH3

OR

spezielle Olefine

Coelenterazin aus Aequorea victoria

[Ru(bipy)3]S

Luclferase^Oxidoreduktaseaus Photobactertumflschcri

H202/OH®

H202

Singulett-Sauerstoff

y° _

?H^ *-C02

i^V^o^o

NH2 00 NH2

O O

USensibilisatorbis 0.50

1co2*

>-OOCH3· enzymatAb-Spaltung von R

rC^nruf SensibilisatorOCH3 0.10 0.30

^IRu(bipy)3|®® *

Ca Coelenteramid*Cofaktoren oder fluoreszente

. Proteine, z.B. -0.30GFP*(greenfluorescent protein)

(Ru(bipy)3l+ hu

Abbildung 1 bersicht von Systemen starker Lumineszenz unter Angabe der energiereichen Zwischenstufe des prim r elektronischange/egten Produkts und der Öá.

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4.3 H2O2-abhängige SystemeWie aus Abbildung l hervorgeht, kann für die Mehr-zahl der Luminophore Wasserstoffperoxid als Reakti-onspartner (Oxydationsmittel) dienen. Eine F^C^-Be-stimmung ist mit verschiedenen Luminophoren bis zueiner Grenzkonzentration von ca. 10'10 mol l'1 mög-lich. Da sehr viele biochemisch relevante Reaktionenin direktem Zusammenhang mit Wasserstoffperoxidstehen - alle enzymkatalysierten Systeme unter Betei-ligung von Oxidasen, Peroxidasen, Pseudoperoxidasen(Hämine, Hämoglobin) oder Katalasen, ist die Anzahlder durch chemiluminometrische H2O2-Messung be-stimmbaren Substrate und Enzyme gegenwärtig kaumnoch überschaubar; erwähnt seien hier die Bestim-mungen von Hexosen, Acetylcholin, Cholin, L-Ami-nosäuren, Chotesterin, Ferritin, Hämoglobin, Hypo-xanthin, Myoglobin, Harnsäure, Lactatdehydrogenase,Proteinasen, Superoxiddismutase (SOD), Oxalat,Citrat und Vitamin Bi2. Die durch Reaktion mit Was-serstoffperoxid ausgelöste Luminol-Chemilumines-zenz (vgl. Abb. 1) wird dabei durch eine Reihe vonEnzymen direkt katalysiert, die als prosthetische Grup-pe komplexgebundene Übergangsmetalle (Eisen, Co-balt. Kupfer, Chrom, Mangan) enthalten, woraus sicheine wichtige Anwendung für die Immunoassaytech-nik ergibt.

Die Anwendung von Oxalestern oder Oxamiden inprotischen Lösungsmitteln, die bei biochemischen Un-tersuchungen üblich sind, ist wegen ungenügenderSolvolysebeständigkeit oder Löslichkeit der Verbin-dungen nicht unproblematisch. Sie erfordert z. T. diezusätzliche Einführung hydrophiler Substituenten(organ. Ammonium- bzw. Sulfonsäuregruppen), waswiederum die Quantenausbeute der Chemilumineszenz

herabsetzt. Dagegen läßt sich freie Oxalsäure auch inprotischer Lösung (Ethanol/Wasser) problemlos in Ge-genwart von Carbodiimiden durch H2O2 oxidieren:

HOOC - COOHOxalsäure

Carbüdiimid/H+/H2O2> 2 CO2 + 2 H2O + F*

-» F + hv

F = Fluoreszenzfarbstoff (z. B. 9,10-Diphenylanthracen),F* = Fluoreszenzfarbstoff im elektronisch angeregten Zustand

Diese Reaktion kann zur quantitativen Bestimmungvon Oxalat und anderen organischen Säuren, die sichleicht (z. B. enzymatisch) in a-KetocarbonylVerbin-dungen und diese wiederum durch Oxidation untermilden Bedingungen '(z. B. mit KClO2/OsO4 bei37 °C) in Oxalat überführen lassen, genutzt werden[7]. Die hohe Spezifität und Sensitivität der Methodeerlaubt die Bestimmung von Oxalat in Körperflüssig-keiten (Blut, Serum, Urin, Liquor cerebrospinalis,Muttermilch) sowie in Blut- und Gewebezellen [8, 9].Die gute Sensibilisierbarkeit dieser Reaktion durch In-doxyl gestattet des weiteren die Bestimmung toxischerphosphororganischer Verbindungen [10] und über In-doxylphosphat die Bestimmung von Prostataspezifi-schem Antigen (PSA) [11, 12].

In der Literatur wird eine Vielzahl von chemilumi-nometrischen Bestimmungsmethoden für essentielleSpurenelemente beschrieben, die wegen ihrer ofthohen Spezifität und Empfindlichkeit auch für Harn-oder Serumproben eingesetzt werden können. Dabeiwerden die Abhängigkeit der Luminol-Chemilumines-zenz von spezifisch komplexierten Übergangsmetallenoder deren katalytische oder inhibierende Wirkung auf

t

Schema 1 Übersicht und Einteilung von Immunoassays mit CL-BL-Detektion

Kompetetiver oder immunometrischer Assay mit CLVBL-Detektion

^^direkter LIA, ILMA

• AG oder AK sind direktmit einem Luminophormarkiert (z, B. Luminol-od. Acridiniumester-,Phenanthridinium- undDioxetanderivat,Aequorin)

\lumin.-verstärkter EIA,ELISA• AG oder AK sind en-

zymmarkiert• das Enzym katalysiert

eine CL/BL-Reaktion· ·oder

• das Enzym katalysiert ·die Bildung eines Chro-mophors, welcher eineCL/BL-Reaktion sensibi-lisiertoder

• das Enzym, katalysiertdie Bildung eines Reak-tionsproduktes,· welcheschemiluminometrisch di-rekt oder indirekt nach-gewiesen werden kann(z. B. Oxalat)'

\lumin.-verstärkter FIA• AG oder AK sind mit

einem Fluoreszenzfarb-stoff markiert

• der Fluoreszenzfarbstoffsensibilisiert eineCL/BL-Reaktion

^^^andere Varianten• AG oder AK sind mit

einem Cofaktor (z. B.NAD(P)H, ATP, Hämin)markiert

• der Cofaktor ist Be-standteil einer CL/BL-Reaktionoder

• der Cofaktor führt zuReaktionsprodukten ,welche chemiluminome-trisch nachgewiesenwerden können (z. B.H202)

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S Albrecht et al Chemilumineszenz

Antigen

„aktive H2O2Sauerstoff-Spezies"

Lumino1 l Signalverstärker l Aminophthal-l - . - l eäiiro

F |

Rb i

"2 Lumigen PS-2 1-OCH3 6-OCH3Lumigen PS-3 H H

b)

Abbildung 2 Zwei Arten peroxidasekatalysierter chemilumeneszenter Reaktionen, welche wichtige biochemische Anwendungen ge-funden habena) signalverstärkte Luminol-CLb) peroxidasekatalysierte Acridan-Acridinium-Reaktion mit anschließender Acridiniumester-CL [57]

Systeme mit „schwacher Chemilumineszenz" ausge-nutzt. Es wurden Bestimmungsmethoden für Eisen,Nickel, Cobalt, Mangan, Zink, Arsen, Kupfer, Queck-silben Chrom und Vanadium nach diesem Prinzip be-schrieben.

Der biologische Abbau von Purinbasen (z. B.Adenin) läuft enzymkatalysiert über viele Zwi-schenstufen, wobei letztlich über Hypoxanthin undXanthin als Endprodukt Harnsäure gebildet wird.Durch intermediäre Ein-Elektron-Reduktionsschritteentstehen Superoxid-Radikalanionen, die Folgereak-tionen eingehen. Die entstehenden Produkte Wasser-stoffperoxid, Hydroxyradikale und Singulett-Sauer-stoff können in bekannter Weise mit Luminol unterLichtemission zu o-Aminophthalat reagieren. A. Baretet al. fanden, daß die Chemilumineszenz des Luminolsin Gegenwart von Hypoxanthin, Luftsauerstoff undXanthinoxidase durch Fe2+/3+-EDTA-Komplexe(EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure) deutlich ver-stärkt wird [13].

Die Reaktion ist hochempfindlich auf Xanthinoxi-dase und erzeugt einen lang anhaltenden Lichtstrom.Koppelt man nun die Xanthinoxidase an ein entspre-chendes Antigen oder, einen Antikörper, läßt sich dar-aus ein empfindlicher Immunoassay mit Chemilumi-neszenz-Detektion aufbauen, wie ihn Baret et al. zumBeispiel für die Schilddrüsendiagnostik anhand derHormone T4 und TSH beschreiben [13]. Vom gleichenArbeitskreis werden auch Anwendungen des Systemsauf die DNA-Analytik und Protein-B lotting-Technikenbeschrieben, und mit anderen Lumineszenz-Methodenverglichen [14].

4.4 Immunoassay sDer Immunoassay wird seit der ersten Beschreibungeines Radioimmunoassays vor fast 40 Jahren sehr viel-fältig für die Bestimmung geringer Konzentrationenvon Hormonen, Eiweißen, Medikamenten, Antikör-pern und Rezeptoren im klinisch-chemischen Labora-torium angewandt. Mitte der 70er Jahre begann dieEntwicklung von Chemi- und Biolumineszenz-Immu-noassays, wobei entweder der Luminophor (Luminol,Acridiniumester) oder ein die Chemilumineszenz-Re-aktion katalysierendes Enzym (Peroxidase bzw. einCofaktor) zur Markierung dienten. Schema l verdeut-licht die gegenwärtig gebräuchlichen Varianten vonImmunoassays mit CL/BL-Detektion.

Insgesamt hat sich bei den Lumineszenz-Immuno-assays das Prinzip des Festphasenassays durchgesetzt,bei dem die Zentrifugation und die teilweise bei derBestimmung von Steroidhormonen aufwendigen Ex-traktionsschritte entfallen. Beschichtete Röhrchen, Kü-gelchen, Magnetpartikel oder Mikrotiterplatten sindfür die einzelnen Parameter parallel im Angebot. ZweiBeispiele der signalverstärkten Lumineszenz sind inAbb. 2 dargestellt. Antigen oder Antikörper sind miteiner Peroxidase markiert.

Grundlegende Arbeiten zur Entwicklung und Te-stung verschiedener Spielarten des Lumineszenz-Im-munoassays, insbesondere auf Routinetauglichkeit,stammen aus dem Arbeitskreis von Wood [15]. SeitMitte der 80er Jahre testet man stabile Dioxetane,deren enzymatische Zersetzung mit hoher AusbeuteChemilumineszenz liefert, als Luminophore für Im-munoa^says. Vorteilhaft bei diesen substituierten Di-

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S. Albrecht et al.: Chemilumineszenz

Abbildung 3 Nachweisgrenze der Im-munoassays mit verschiedenen Tra^cern. Bei den mit Stern gekennzeich-neten Tests handelt es sich um Flu-oreszenz-lmmunoassays mit speziellenEuropium-Chelatkomplexen, was zugünstiger, zeitverzögerter Phosphores-zenzstrahlung führt.

jQ-15 10-16 IQ'19 K)'2

Nachweisgrenze [Mol]

a)hi/ in DMSO: 0,20 bia 0.25

Energie

Stabilität Fluoreszenz

Wasserlöslichkeit

R1 = AUcylR2 = PO3Na2, GalactosylR3= H, Halogen b)

Abbildung 4 a) Neue, von A. R Sc/?aap et al. synthetisierte Dioxetane, die sich als Label für die biochemische Analytik eignen undderen chemilumineszierender Zerfall sehr effizient durch Fluoridionen initiiert.werden kann,b) Für die biochemische Analytik wesentliche Struktureigenschaften von AMPPD

oxetanen im Vergleich zu anderen Luminophoren ist,daß zur Lichterzeugung kein zusätzliches Oxidations-mittel in das System eingebracht werden muß. Das Di-natriumsalz des 3-(2'-Spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)-phenyl-l,2-dioxetans (AMPPD,Formel in Abb. 4 b) wird bereits als hocheffizienteschemilumineszentes Enzymsubstrat für AlkalischePhosphatase (AP) kommerziell angeboten, das prinzi-piell für alle Chemilumineszenz-Immunoassays ein-setzbar ist, bei denen sich Antigen oder Antikörper mitAlkalischer Phosphatase markieren lassen. DieLichtintensität bleibt etwa eine Stunde lang konstant;die Nachweisgrenze für Alkalische Phosphatase liegtbei 0,001 attomol (das sind nicht mehr als 600 Mo-leküle!) - eine phantastische Empfindlichkeit, die bis-her ihresgleichen sucht (Abb. 3).

Ausgehend von Spiroadamantan-substituierten Di-oxetanen (z. B. AMPPD) als Enzymsubstrate, berich-teten Schaap et al.über neusynthetisierte Moleküle die-ser Art, die eine „Linker"-Gruppe, z. B. einen akti-vierten Alkansäureester, enthalten. Dieser kann genutztwerden, um das Dioxetan direkt z. B. an Proteine zuknüpfen (durch Reaktion mit deren freien Aminogrup-pen) und damit eine Luminogenmarkierung zu errei-chen [16] (Abb. 4a). Die Verbindungen sind an derHydroxygruppe des Phenylrings silyliert und recht hy-drolysestabil.. In Gegenwart starker Nucleophile (z. -B. Fluorid-

ionen) wird der Silylrest abgespalten und der Zerfalldes Dioxetans mit Chemilumineszenz ausgelöst. DieseFluorid-induzierte Dioxetanspaltung hat neben der vonHummelen et al. [17J untersuchten thermischen und

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S. Albrecht et a l : Chemilumineszenz

Sellcncrdkomplex-katalysierten Fragmentierung stabi-ler Dioxcumc grolle Chancen, eine brauchbare nich-ten/.ymatischc Alternative für die biochemische Analy-tik zu werden.

Ein von der Logistik her den Dioxetanen vergleich-bares System entwickelten Miska und Geiger [18]durch Synthese und Applikation entsprechender P. py-rii//.v-Luciferin-Derivale. Dabei wird die Tatsache aus-genutzt, daß die cn/ymkatalysicrte chcmilumincszenleÖxidation des />/;vrtf//,9-Luciferins eine hochspezifi-sche Reaktion ist und deshalb geringste chemischeModifizierungen am Luciferin-Molckül die Aktivitätder R /7vw//j-Luciferase drastisch senken. Mit ent-sprechenden, an der aromatischen Hydroxygruppeoder an der Carboxygruppe des Luciferins substituier-ten Molekülen kommt die Luciferin-Biolumineszenzerst nach Inkubation mit dem entsprechenden Enzymdurch Freisetzung des „aktiven" Luciferins zustande:

o o.C-OH

Luciferin-O-PhosphatR' = POgNaz, R2 = H

Synthetisiert wurden neben dem D-Luciferin-O-phosphat auch D-Luciferinmethylester (R1 = H, R2 =CH3), D-Luciferin-L-phenylalanin (R1 = H, R2 = Phe-nylalanin) und D-Luciferin-L-Na-arginin. All dieseDerivate sind keine Substrate für die R pyralis-Luci-ferase und liefern bis herauf zu einer Konzentrationvon einem Millimol pro Liter keine nachweisbareLichtemission. Eine direkte Nutzung von AlkalischerPhosphatase für die sonst nicht enzymkatalysierte che-milumineszente Öxidation von Acridiniumderivatenwird zur Zeit von Schaap et al. [19] nach der folgen-den Gleichung getestet:

.ZPh ,ZPh

AP

Lumigen APS - l Z = O

Lumigen APS - 2 Z = S

+ Licht

In allen Fällen, in denen sich ein Antigen oder An-tikörper, ein Rezeptorprotein oder ein bestimmterDNA-Abschnitt mit dem entsprechenden Enzym (z. B.Alkalische Phosphatase oder Galactosidase; markierenlassen, sind der Anwendung von Luc i ferase-Derivatenkaum Grenzen gesetzt. Das gilt auch für Moleküle, diesekundär eine Antigen-Antikörper-Reaktion initiierenkönnen, z. B. das verstärkend wirkende Avidin-ßiotin-System oder sehr günstig Dig-oxigenin im Falle derDNA-Analytik. Beschrieben wurde bisher die Anwen-dung dieses Systems u. a. zur Bestimmung von huma-nem Immunglobulin E [18], humanem Urin-Kalli-krein, Bradykinin und Kallikrein-Antikörpern [20]sowie für Protein-Blotting und DNA-Hybridisierungs-assays [21]. Tabelle 4 faßt noch einmal übersichtsartigwichtige Luminophore und deren Anwendung für Im-munoassays zusammen.

Die auf dem internationalen Markt angebotenenKits zur Bestimmung von Biomolekülen auf immuno-logischer Basis mit Chemilumineszenzmarkernund/oder mit CL-Detektion sind nur noch schwerüberschaubar. Die meisten der in Tab. 4 aufgeführtenSubstanzen sind als kommerzielle LIAs erhältlich.Stellvertretend seien einige wichtige Kithersteller ge-nannt: BYK SANGTEC, CHIRON Diagnostics, DPCBiermann, Nichols Diagnostics, Brahms GmbH, Boeh-ringer Mannheim, MILLIPORE, Celsius Limited undBiotrace Ltd. Dominierend dabei ist die coated tubes-oder coated beads-Technik, wobei die CL-Messung ineigens entwickelten Geräten oder mit Luminometernder Fa. EG & G Berthold (Wildbad, Deutschland) oderStratec (Birkenfeld, Deutschland) erfolgt.

Vollautomatische Systeme auf der Basis von Fest-phasenassays (coated tubes bzw. Magnetpartikel) mitCL-Detektion werden gegenwärtig von verschiedenenFirmen angeboten - andere sind in Entwicklung (vgl.Tab. 5).

4.5 Blot-Techniken und DNA-AnalytikDie moderne Labordiaghostik von Erb- und Infekti-onskrankheiten (Hepatitis, Aids) ist heute ohne DNA-und Protein-Blottechniken sowie DNA-Hybridisie-rungs-Assays (Bestimmung des Ausmaßes der Bildungeiner DNA-Doppelhelix aus zueinander passendenDNA-Einzelsträngen) undenkbar. Mit chemilumines-zenten Substraten,wie AMPPD oder Luminol läßt sichdie Empfindlichkeit der Assays im Vergleich zu her-kömmlichen colorimetrischen oder radiometrischenMethoden deutlich steigern. Auch der Biolumines-zenznachweis bei der "Anwendung von D-Luciferin-O-phosphat und ATP oder Alkalische Phosphatase undNADP (evtl. verstärkt durch das Avidin-Biotin-Sy-stem) ist für diese Zwecke beschrieben worden. Dasprinzipielle Schema der Anwendung chemilumineszie-render Substrate geht aus Abb. 5 hervor [65 - 68].

Inzwischen sind konfektionierte Kits (z. B. von denFirmen Boehringer/Mannheim oder SERVA) im Ange-bot, welche direkt für den DNA- (Southern-Blot),RNA- (NorthernrBlot) oder Proteinnachweis (We-stern-Blot) einsetzbar sind. In letzter Zeit haben sich

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S. Albrecht et al.: Chemilumineszenz

Tabelle 4 Ausgewählte Anwendungen von CL und BL

Label

Acridiniumester

AequorinAlkalischePhosphatase

ATP

ß-Galactosidase, /-Cyclodextrin

Glucoseoxidase

Firefly LuciferaseFluorescinRhodaminGlucoseoxidase

Glucose-6-phosphat-dehydrogenaseHäminHorseradish-Peroxidase

Luminol- oder Iso-luminolderivateBacterielle LuciferaseNAD+Pyruvatkinase

Xanthinoxidase

DeteRtionsreaktion

^ 2 2/ - -» CL

+Ca2+ -> BL+AMPPD -» CL

Firefly Luciferin-Luciferase -> BLSensibilisierung derPeroxyoxalate-CLH2O2 durch Peroxyoxa-lat-CL in wäßr. LösungBLPeroxyoxalat-CLPeroxyoxalat-CLH2O2 durch Peroxy-oxalat-CLNAD(P)H-abhängigeBiolumineszenzKatalyse der Luminol-CLa) Katalyse der Luminol-CL

b) Katalyse der Acridan-oxidätion

-H202/Katalysator -» CL

BLBLATP-abhängige•Rrefly-BL ·

* H2O2-Generierung +Luminol -> CL

m Molekularbiologie und Immunologie

Analyt

T3l T4, TSH, FT3, FT4, CKMB, Ferritin,ßHCG, PSA, Vit. B12, Schilddrüsenauto-

, Folsr., LH, FSH, Prolactin, HGH,PTH, Cortisol .Progesteron, TransferrinAFP, CA 125, CA 19-9, CA 15-3, TSH,LH, HGH, Schilddrüsendiagnostik,Fertilität, AnämieT4, Myoglobin

T4

Glucose

MethotrexatIgGLDL1 7-Hydroxyprogesteron

Progesteron, LH, Prolactin, ÄFF3

ß2-MikroglobulinAFP, CEA, Ferritin, LH, FSH, Progesteron,T3, T4, FT3, FT4, TSH, TBG, Cortisol,Estrio, Estrad iolSchilddrüsendiagnostik, Blot-Techfiiken

Schilddrüsendiagnostik, Fertilität, Tumor-marker, Reproduktion, Cortisol, ProgesteronImmunglobulineEstriolTransferrin, Insulin

IgE, Prolactin, T4, TSH

Lit.

[20 - 27]

[29, 30][31 - 42]

[39, 43]

[44, 45]

[6]

[46, 47]]48][49][50]

[51 - 52]

[39, 54][22, 39,51,55,56][57]

[37,58,59, 60][61,62][63][39]

[13,51,64]

als Matrix für Blots bzw. Hybridisierungsassays spezi-ell entwickelte Nylonmembranen gegenüber der her-kömmlichen Nitrocellulose durchgesetzt. „Nylon plus"zum Beispiel eignet sich durch zusätzliche positiveLadungen im Polymer neben besserer Beständigkeitund intensiverer Haftung von Protein- oder Nucleotid-molekülen auch deshalb besonders gut, weil die Ar-beitstechnik insgesamt weniger Schritte erfordert. Do-minierend bei den hier beschriebenen Verfahren sindeindeutig die „enhanced luminescence"-Techniken. Essei allerdings auch darauf verwiesen, daß es Hybridi-sierungsassays gibt, welche mit direktem Luminophor-labeling (z. B. Acridiniumester) arbeiten [69 - 74].

4.6 ReportergenassaysWie bereits diskutiert, können gegenwärtig biogeneLuciferasen auf molekularbiologischem Wege in aus-reichender Menge produziert werden - eine Vorausset-zung für ihren Einsatz in der biochemischen Analytik.Im folgenden sollen ausgewählte Beispiele für solcheAnwendungen vorgestellt werden. Nebenbei sei er-wähnt, daß natürlich jeder (Mikro-) Organismus undjede Zellkultur, in denen Luciferase exprimiert werdenkann, im „neuen Licht" erscheinen: Lassen sich dochzum Beispiel mit dem synthetisch leicht zugänglichenR /7>'ra//s-Luciferin, das aufgrund seines geringen Mo-lekül arge wicHts leicht durch die Zellmembran diffun-

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S Albrecht et a i : Chemilumineszenz

r -~ — - ~Tabelle 5 Übersicht

LabetAcridiniumester

Acridiniumester

AlkalischePhosphataseAlkalischePhosphataseIsoluminol

Horseradish-PeroxidaseRutheniumorganyl-komplexeAequorin

zu immunologischen Vollautomaten

Gerät

ACS 180. ACS Centaur(Chiron Diagnostics)Advantage(Nichols)Immulite, Immulite 2000(DPC Biermann)Access(Sanofi Pasteur)LIAmat 300, Liason(Byk Sangtec)Amerlite, Vitros ECP .(Ortho-Clinical Diagnostics)Elecsys 1010, 2010(Boehringer Mannheim)SL-300-Analogon(ICN Pharmac. Inc.)

mit CL-Detektion

Parameter (Auswahl)

SD*), Fertilität, Allergene, Steroide, TumormarkerAnämieSD, Fertilität, Steroide, Wachstumshormone,KnochenstoffwechselSD, Fertilität, Steroide, Tumormarker, Zytokine,Knochenstoffwechsef und WachstumSD, Fertilität, Steroide, Anämie

SD, Fertilität, Steroide, Tumormarker

SD, Fertilität, Steroide, Tumormarker

SD, Fertilität, Steroide, Tumormarker, Immun-globulineSD, Fertilität

*) SD = Schilddrüsendiagnostik: TSH, T3, T4, fT3, fT4

/^«*

Einstrang-DNA-Analyt

Luminiszenz-Reagenz

DNA-Enzym-Konjugat

hybridisierterDNA-Komplex

Licht

jgand —£ j+ LigandLuminiszenz-Reagenz

fürUV-VIS-Strahlenempfindlicher Film

transferierteDNA- oder ProteinprobeaufNitrocellulose

ChemiluminiszenterBlot

Abbildung 5 Anwendung chemilumineszierender Substrate für die DNA-Analytik einschließlich Blot-Technik: a) DNA-Hybridisierungs-assay; b) Blot-Techniken

diert, ATP- und NADPH2-abhängige Prozesse derZelle auf ganz neue Weise untersuchen.

Eine erfolgreiche Klonierung z. B. der Luciferase-cDNA ist allerdings noch keine Garantie dafür, daß inden entsprechenden Wirtsorganismen-Zellen auch einehohe Luciferaseausbeute erzielt wird. Für eine guteExpression des gewünschten Proteins sind dem ent-

sprechenden Gen vorgelagerte Nucleotid-Sequenzen(sogen. Enhancer- und Promoterregionen) verantwort-lich. Die Effizienz dieser Regionen kann mit „Repor-ter-Genen" überprüft werden. Dabei geht man wiefolgt vor: Die DNA eines leicht nachweisbaren Pro-teins, das möglichst nicht im Wirtsorganismus vor-komrrien sollte, wird gemeinsam mit den zu untersu-

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S. Albrecht et al.: Chemilumineszenz

chenden Promotorregionen kloniert. Der dann folgen-de Expressionsversuch läßt anhand der Ausbeute die-ses Proteins Rückschlüsse auf die Promotoraktivitätzu. Bisher wurde für solche Tests oft die DNA derChloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) verwendetund zum Nachweis der Promotoraktivität die Ge-schwindigkeit des Chloramphenicol-Umsatzes mit*14C-markiertem Acetyl-CoA radiometrisch bestimmt:

H NH-C—CHCI2 o

•C—C—CH2OH + CH3-14C

HO H S—CoA

Chloramphenicpl

CAT ^- HS - CoA

Acetyl-CoA(radioaktiv markiert)

H NH-C—CHCI2

C—C-CH2-O-14C—CH3I I II

HO H O

Als nicht-radioaktive Alternative wird gegenwärtigdas P. pjTaZ/s-Luciferase-cDNA-Gen (LUC) genutzt,das auf analoge Weise wie das CAT-System kloniertwerden kann. Wesentliche Vorteile des LUC-Systemssind:• Die Empfindlichkeit ist bis zu lOOOmal höher, d. h,

man benötigt eine deutlich geringere Anzahl ent-sprechend modifizierter Zellen.

• Die Versuchsergebnisse liegen nach 24 Stunden vor.Dagegen benötigt man beim CAT-Assay wegen deraufwendigen Extraktionsprozedur und der chroma-tographischen Abtrennung von überschüssigem 14C-Acetyl-CoA zum quantitativen Nachweis des umge-setzten Chloramphenicols mindestens 110 Stundenbis zu den ersten Resultaten.

• Das Arbeiten mit radioaktiven Isotopen entfallt, dasentsprechende Arbeitsschutzvorschriften erfordertund zudem hohe Entsorgungskosten verursacht (dieHalbwertszeit von llCbeträgt 5736 Jahre).Mit dem LUC-System hat der Molekularbiologe

eine neue effiziente Möglichkeit, die Expression einesinteressanten Proteins durch Wahl der geeigneten Pro-motors zu optimieren. Genutzt wurde es bisher z. B.zur Optimierung der Expressionswirksamkeiten deslnterleukin-2-Genpromotors in Jurkat-J32-Zellkultu-ren, des frühen SV40-Promoiors (eines Affenvirus) inAffennieren-Zellkulturen und des Blumenkohlmosaik-virus-35S-RNA-Pro-motors in Karottenzellen [75, 76].

In all diesen Fällen dienten also das Luciferase-Genund die Expression der Luciferase mit anschließenderBiolumineszenz-Messung nach der Zugabe von Luci-ferin als „Informant" über die Promotorwirksamkeit.Die zukünftige breite Anwendung dieses genetischenReporters ist abzusehen. Ein .aktueller und ausführli-cher Literaturservice zur Problematik „Reportergen-

Assay" wird von der Fa. Berthold (Wildbad, Deutsch-land) allen Interessenten zur Verfügung gestellt. DerTrend in den 90er Jahren geht eindeutig in Richtung insitu-Arbeitsweise, wo in der intakten transferiertenZelle die Nachweisreaktion durchgeführt wird. Fürdiese Techniken (single cell imaging) kommen auf-grund des enormen Empfindlichkeitsanspruches nurnoch Fluoreszenz-, Chemi- oder Biolumineszenzde-tektionen in Frage. Schema 2 faßt etablierte Reporter-gen-Assay-Systeme und moderne Fragestellungenbzw. Arbeitsweisen zusammen.

Reportergen-Assay

Molekularbiologie

-» Promotoraktivität

-* Produktsynthese

.. ~~in der intaktentransferierten

Zelle

1

^̂Biochemie

(Analytische Chemie)

r— Enzyme* | Proteohormone

·— Zytokine

iNachweis

im Lysat nachZerstörung der

transferierten Zellen

single cell — * £A£C — * SoERmeffieimaging — * Fluoreszenz — >· CL/BL

sehr gute Selektionsmöglichkeiten

iTrend der 90er

Beispiele für• Reportergenprodukte

- Chloramphenicol Acetyl-Transferase (CAT)

- ß-Galaktosidase (ß-Gal)

- Alkalische Phosphatase (AP)

-ß-Glucuronidase(GUS)

- Luciferase

-Zytokine/Hormone

• gängige Nachweismethoden

- Radioaktivität (14C,3H)

-Colorimetrie, Lumineszenz

• Colorimetrie, Fluoreszenz, Lumineszenz

- Colorimetrie, Fluoreszenz

- Lumineszenz

- Immunoassay, Bioassay

Schema 2 Reportergen-Assays der 90er Jahre

4.7 ElektrochemilumineszenzDie bereits seit einigen Jahrzehnten bekannte Elektro-chemilumineszenz von organischen Übergangsmetall-Komplexen hat im Falle von Rutheniumverbindungenin letzter Zeit Eingang in die biochemische Analytik -namentlich als Immunoassayvariante - gefunden.

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S. Albrecht et ai.: Chemilumineszenz

Hercules und Lyile berichteten 1966, daß eineschwefelsaure Tris(2t2'-bipyridin)rutheniurn- (IJ)salz-Lösung (orangefarben), die mit Hilfe von Bleidi-oxid zur Tris(2,21-bipyndin)njthenium(IIi)saI/,-Lösung(smaragdgrüne Farbe) oxidiert wird, bei Zugabe einerstarken Base (Natronlauge, Hydrazin oder Natriumte-trahyclridoborat NaBH4) unter Emission einer hellorangefarbenen CL ( = 610 nm) wieder zumTris(2,2'-bipyridin)ruthenium(n)-KompIex reduziertwird [77].

Das orangegelbe [Ru(bipy)3]2+-Ion liegt im Grund-zusland im Singulett-Zustand vor. Das grüne[RiKbipybl3'1" befindet sich energetisch 1,2 eV überdem Gnmdzustand von [RuCbipyh]2"*". Der angeregteZustand des |Ru(bipy)3]2+* stellt einen Triplettzustanddar und liegt 2,2 eV über dem Grundzustand.

Um vom [Ru(bipy)3]3+-Ion zum angeregten Triplett-zustand [Ruibipyb]2"1'* zu gelangen, ist also eine zu-sätzliche Energie von ca. l eV nötig. Diese Energiekann entweder durch UV-Absorption oder durch einengeeigneten chemischen Prozeß bereitgestellt werden.Bei der Rückkehr vom angeregten in den Grundzu-stand wird im ersteren Falle die Energie in Form vonPhosphoreszenz, im zweiten Falle als Chemilumines-zenz emittiert. Wie spektroskopische Untersuchungengezeigt haben, entspricht das Spektrum des emittiertenorangefarbenen Lichtes exakt dem Phosphoreszenz-spektrum des [Ru(bipy)3]2+-Ions.

Tokel und Bard beobachteten 1972 als erste dieElektrochemilumineszenz des Ruthenium-Chelat-Komplex-Systems. In jüngster Zeit wurde die Anwen-dung der [Ru(bipy)3j2+-Elektrochemilumineszenz zurMarkierung von Haptenen, Proteinen und Nucleinsäu-ren beschrieben.

2+

Abbildung 6 Struktur eines elektrochemilumineszenten Markersauf Basis eines Tris(2,21-bipyridin)ruthenium(ll)-Chelates

Der in Abb. 6 gezeigte Marker zeichnet sich durchhohe Stabilität, die relativ niedrige Molmasse, die guteWasserlöslichkeit und die hohe Sensibilität (Nach-weisgrenze des Markers bei ca. 200 fmol/1) aus. Beider elektrochemischen Reaktion .wird zunächst[Ru(bipy)3]2+ an der Oberfläche der Elektroden zu[Ru(bipy)3]3+ oxidiert. Simultan wird ein großer Über-schuß zugesetztes TPA (Tripropylamin) zum Radikal-

kation TPA"1" oxidiert, das spontan deprotoniert wird.Bei der Reaktion des starken Oxidans [Rufbipy^]3"*"mit dem starken Reduktans TPA wird das|Ru(bipy)3]2Mon im elektronisch angeregten Zustandgebildet, das durch Emission eines orangefarbigenLichtquants (Xmax = 620 nm) in den Grundzustandzurückkehrt. Der Ruthenium(II)-Komplex kann wiederin den Kreisprozeß eintreten, wodurch eine Signalver-stärkung hervorgerufen wird [78] (Abb. 7).

TPA

Elektrode

Ru(bpy);

Ru(bpy)

Photon (620 n m)Abbildung 7 Die Reaktion an der Elektrodenoberfläche

Auf dem Prinzip obiger Ruthenium-Chelat-Kom-plex-Elektrochemilumineszenz arbeitet auch dasOPCT-System 5000 von Perkin Eimer. Mit ihm isteine PCR-amplifizierte DNA-Bestimmung in denamol-B.ereich hinein möglich.

Eine quasi homogene Testdurchführung eines Im-munoassays kann realisiert werden durch Verwendungeiner Durchflußmeßzelle und der- Streptavidin-Biotin-Festphasen-Technologie - eine Entwicklung von Boeh-ringer Mannheim, welche mit dem vollautomatischenimmunologischen Gerätesystem „Elecsys" als kleineoder große Variante (1010 oder 2010) auf dem Markterhältlich ist.

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