Pendahuluan

Asam nukleat merupakan salah satu biomolekular terbesar selain

karbohidrat, protein dan lemak. Asam nukleat adalah molekul yang membawa

informasi genetik. Asam nukleat merupakan polimer dari nukleotida. Nukleotida

terdiri dari gula pentosa, basa nitrogen, dan gugus fosfat. Asam nukleat dapat

dibedakan menjadi dua jenis yaitu DNA dan RNA. Kedua jenis asam nukleat ini

dibedakan berdasarkan penyusunnya. Gula pentosa pada DNA adalah

deoksiribosa, sedangkan pada RNA berupa ribose. Selain itu, basa pirimidin pada

DNA adalah sitosin dan timin sedangkan pada RNA basa pirimidinnya adalah

sitosin dan urasil (Ngili Y 2013).

Materi genetik sel tersusun dalam bentuk kromosom. Kromosom adalah

struktur-struktur linier berjumlah banyak yang terletak didalam nukleus. DNA

yang terdapat pada kromosom disebut dengan DNA kromosom. Selain itu pada

beberapa sel (seperti bakteri), materi genetik tidak hanya terdapat didalam

kromosom yang terdapat didalam nukleus. Materi tersebut disebut DNA ekstra

kromosom. Materi ini dapat berupa plasmid maupun episom (Yuwono T 2005).

Plasmid adalah molekul DNA sirkular kecil yang bereplikasi secara otonom dari

kromosom bakteri dan tidak mampu berintegrasi ke dalam kromosom bakteri.

Sedangkan episom adalah unsur genetik ekstrakromosomal yang bisa terintegrasi

didalam kromosom inang (Elrod S, Stnsfield WD 2007).

Sel dibedakan menjadi dua macam yaitu sel prokariotik dan sel eukariotik.

Perbedaan mendasar diantara kedua jenis sel ini yaitu letak materi genetik dari sel.

Materi genetik sel protkariotik tidak terbungkus oleh membran, tetapi terletak

pada suatu daerah nukleolid. Sedangkan pada sel eukariotik materi genetik

terletak di dalam suatu membran (inti sel) (Stansfield WD et al 2006).

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan

amplifikasi DNA secara in vitro. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu

pra-denaturasi DNA template, denaturasi DNA templat, penempelan primer pada

templat (annealing), pemanjangan primer (extension), dan pemantapan (post-

extension). DNA yang digunakan dalam proses PCR terlebih dahulu harus di

isolasi dari sampel. Terdapat dua metode isolasi yaitu metode lisis dan metode

isolasi DNA kromosom maupun DNA plasmid dengan metode standar. Prinsip

metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak DNA yang

dinginkan. Oleh karena itu, perusakan dinding sel umumnya menggunakan larutan

lisis seperti 5 mM Tris-HCl pH 8, 0,1 mM EDTA pH 8,5, 0,5% Tween-20, dan

100 µg/mL Proteinase. Metode lisis secara umum dibagi atas tiga tahap utama

yaitu pemecahan sel, pengekstrakan, dan pemekatan DNA. Prinsip isolasi DNA

kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel yang diikuti dengan

pemisahan DNA kromosom atau DNA plasmid dari komponen lain (Handoyo D,

Rudiretna A 2001).

Metode

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini yaitu pisau, kaca arloji, sudip,

neraca analitik, gelas piala, blender, pipet tetes, pipet Mohr, bulb, gelas ukur,

water bath, tabung reaksi, rak tabung, pipet mikro, tips, tabung appendorf,

sentrifuse mini, vortex, botol semprot, batang pengaduk, dan botol semprot.

Bahan yang digunakan yaitu umbi bawang merah, larutan lisis (tris HCl),

garam, SDS 10%, es batu, etanol 96%, larutan fenol kloroform, dan aquades.

Prosedur Percobaan

Sebanyak 25 g umbi bawang merah yang telah dipotong kecil ditimbang.

Umbi kemudian dicampur dengan 40 mL larutan lisis dan 1,5 g garam. Campuran

dihaluskan dengan blender selama 1 menit. Campuran yang telah diblender

dituang kedala gelas piala dan ditambahkan 10 mL SDS 10%. Campuran kemudia

diaduk dan di inkubasi pada suhu 37oC pada water bath. Campuran disaring

dengan tisu dan filtrate ditempatkan didalam penangas es.

Sebanyak 5 mL filtrat dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan

5 mL larutan fenol : kloroform (1:1). Campuran didiamkan selama 5 menit.

Lapisan atas yang terbentuk diambil dan dipindahkan kedalam tabung lainnya.

Larutan lapisan atas diambil dan ditambahkan 5 mL etanol 96%. Campuran

kemudian didiamkan selama 5 menit didalam penangas es. Lapisan atas yang

terbentuk (terdapat DNA yang mengambang), diambil sebanyak 1 mL dan

dipindahkan kedalam tabung appendorf. Tabung yang berisi larutan DNA tersebut

disentrifugasi selam 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Bagian etanol dari

larutan dibuang, dan bagian endapan ditambahkan 1 mL etanol 70%. Campuran

dihomogenkan dengan vortex, kemudian disentrifugasi kembali. Lapisan etanol

dibuang dan bagian endapan dibiarkan kering udara. Endapan yang tersebut

merupakan isolate DNA dari umbi bawang.

Hasil dan Pembahasan

Telah disebutkan pada bagia pendahuluan bahwa proses isolasi DNA

dengan metode lisis dibedakan menjadi tiga tahapan utama yaitu pemecahan sel,

pengekstrakan, dan pemekatan DNA. Pada tahapan pemecahan sel, sel umbi

bawang merah dirusak selnya dengan cara menambahkan beberapa zat. Larutan

pertama yang ditambahkan adalah larutan lisis. Larutan ini berisi larutan Tris HCl

yang berfungsi untuk merusak dinding sel umbi bawang merah. Selain itu,

campuran juga ditambahkan garam yang berfungsi untuk mendekatkan ujung-

ujung gugus fosfat yang terdapat pada DNA. Sehingga DNA dapat mengendap

didalam larutan. Campuran dari umbi bawang merah, larutan lisis, dan garam di

blender agar merusak membran sel secara fisik. Campuran yang sudah halus ini

kemudian ditambahkan larutan SDS 10%. Larutan SDS atau Sodium dodecyl

sulfate adalah larutan yang mengemulsi lipid dan protein yang berasal dari

membran sel (Firouzabad H, Iranpoo N 2005). Campuran tersebut kemudian

disaring agar pengotor yang berasal dari endapan protein dan lipid membran sel

tidak masuk kedalam filtrat. Filtrat kemudian diinkubasi pada suhu 37oC didalam

water bath.

Tahapan kedua dari isolasi DNA yaitu pengekstrakan DNA. Hal ini

dilakukan dengan menambahkan larutan kloroform : etanol dengan perbandingan

1:1. Larutan ini berfungsi untuk menghilangkan semua komponen sel kecuali

DNA. Komponen-komponen sel ini dapat menggangu proses isolasi DNA

sehingga DNA yang diperoleh kurang murni. DNA yang kurang murni dapat

mengganggu proses PCR. Campuran larutan kemudian didiamkan didalam es

selama 5 menit sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas diambil karena

mengandung DNA sel. Lapisan atas kemudian ditambahkan dengan etanol 96%.

Penambahan ini bertujuan untuk mengendapkan DNA sehingga lebih mudah

untuk dipisahkan. Etanol menurunkan sifat elektrostatik dari DNA yang

menyebabkan DNA mengambang diatas larutan. DNA yang mengambang ini

kemudian diambil dan dimasukan kedalam tabung eppendorf serta ditambahkan

larutan etanol.campuran kemudian disentrifuse agar DNA mengendap.

Tahapan ketiga dari isolasi DNA adalah pemurnian DNA. Pemurnian

bertujuan untuk menghilangkan komponen-komponen lain yang mungkin ikut

mengendap didalam endapan DNA. Pemurnian dilakukan dengan melarutkan

endapan DNA dengan alkohol 70% yang berfungsi untuk menghilangkan

pengotor dalam endapan DNA. Larutan tersebut disentrifuse kembali dan larutan

etanol dibuang. Bagian endapan dikeringkan sehingga diperoleh hasil sebagai

berikut :

Gambar 1 Endapan DNA Umbi Bawang Merah

Berdasarkan gambar terlihat adanya endapan yang terbentuk pada dasar

tabung. Endapan tersebut seharusnya diukur dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dari

kedua panjang gelombang tersebut dibandingkan dengan perbandingan :

nilaiabsobansi pada panjang gelombang 260 nmnilaiabsobansi pada panjang gelombang 280 nm

Absorbansi pada panjang gelombann 260 nm dimiliki oleh DNA, sedangkan pada

panjang gelombang 280 nm merupakan nilai absorbansi yang dimiliki oleh

protein. Jika nilai perbandingan berkisar antara 1,02-1,08 menunjukan DNA

tersebut cukup murni dan bebas dari protein yang dapat mengganggu proses PCR.

Telah dijelaskan juga pada bagian pendahuluan bahwa terdapat DNA

kromosom dan DNA ekstrakromosom. Pada makhluk hidup tingkat tinggi seperti

hewan, manusia, tumbuhan, DNA di isolasi dari DNA kromosom. Sedangkan

pada hewan tingkat rendah, DNA di isolasi dari DNA ekstraseluler seperti

plasmid.

Isolasi DNA memiliki banyak manfaat dibidang rekayasa genetika.

Aplikasi ini dilakukan dengan mengisolasi DNA dan melakukan beberapa

modifikasi terhadap gen tersebut. Modifikasi dapat dilakukan dengan

menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen organisme tersebut.

Beberapa hasil dari modifikasi tersebut yang dapat kita lihat sehari-hari adalah

adanya buah-buahan tanpa biji, semangka berbentuk kotak, dan adanya varietas-

varietas tumbuhan baru. Isolasi DNA memungkinkan untuk mengetahui

keanekaragaman dari genetik plasma. Keanekaragaman genetik ini

memungkinkan untuk pengelompokan mahkluk hidup berdasarkan kemiripan

DNA antara satu makhluk hidup dengan makhluk hidup lainnya.

Simpulan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa isolasi

memiliki tiga tahapan umum yaitu pemecahan sel, pengekstrakan, dan pemekatan

DNA. Kemurnian DNA dapat dinilai dari perbandingan absorbansi isolat DNA

pada panjang 260 nm/280 nm. Nilai perbandingan 1,02-1,08 menunjukan isolat

DNA yang diperoleh sudah cukup murni.

Daftar Pustaka

Ngili Y. 2013. Biokimia Dasar. Bandung (ID) : Rekayasa Sains.

Yuwono T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta (ID) : Erlangga.

Elrod S, Stnsfield WD. 2007. Schaum’s Outlines : Teori dan Soal-Soal edisi ke-4.

Tyas D : Penerjemah. Jakarta (ID) : Erlangga. Terjemahan dari : Scahum’s

Outlines of Theory and Problems of Genetic fourth edition.

Stansfield WD et al. 2006. Biologi Molekular dan Sel. Fahmi V : Penerjemah.

Jakarta (ID) : Erlangga. Terjemahan dari : Schaum’s Easy Outlines

Molecular and Cell Biology.

Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase

Chain Reaction (PCR). Unitas Vol 9 No 1 Hal : 17—29.

Firouzabad H, Iranpoo N. 2005. Micellar Solution of Sodium Dodecyl Sulfate

(SDS) Catalyzes Facile Michael Addition of Amines and Thiols to α,β-

Unsaturated Ketones in Water under Neutral Conditions. Shiraz :

Chemistry Department, College of Sciences, Shiraz University.