PERCOBAAN III

WAKTU KOAGULASI DARAH

I. TUJUAN

- Agar mahasiswa mampu melakukan percobaan farmakologi untuk melihat efek

antikoagulansia terhadap waktu koagulasi darah (penjendalan darah, blood cotting).

II. DASAR TEORI

Peristiwa penjendalan darah (koagulasi darah) adalah sebuah proses yang normal terjadi

yang merupakan bagian dari mekanisme proses homeostasis (mempertahankan keadaan

tubuh dalam keadaan normal). Homeostasis merupakan sebuah proses untuk menghentikan

proses pendarahan agar terhindar dari kerusakan pembuluh darah. Koagulasi dapat terjadi bila

ada perlukaan, yang berarti apabila darah berkoagulasi maka pendarahan yang terjadi akan

berhenti. ada saat terluka, hemostasis akan terganggu. Pada saat itu,koagulasi darah dan

fibrinolisis akan membantu cairan darah tetap dalam kondisi hemostasis. Sejumlah darah

akan keluar dan untuk mencegah pengeluaran darah terlalu banyak, hemostasis dan trombosis

bekerja sama dalam tiga fase (Murray et al., 2003).

Fase pertama, pembentukan agregat platelet yang longga dan sementara di sisi bagian

yang terluka. Platelet ini akan berikatan pada kolagen di dinding pembuluh darah. Pengikatan

ini dibantu oleh trombin yang sudah diaktifkan. Setelah itu, pada sisi yang sama, terjadi

koagulasi dan pelepasan ADP dari proses aktivasi. Selama pengaktifan, bentuk platelet akan

berubah dan muncul fibrinogen yang meupakan agregat yang dibentuk dalam proses

hemostasis.

Fase selanjutnya, pembentukan fibrin yang berikatan pada platelet agregat. Fibrin

dibentuk dari keadaan hemostasis  yang lebih stabil. Fase ketiga yaitu, pelepasan atau

pelarutan senyawa  pada proses hemostasis oleh plasmin.Ada dua jalur pembentukan fibrin,

yaitu jalur intrinsik dan ekstrinsik (Murray et al., 2003). Akhir dari kedua jalur ini akan

terkonversi pada jalur umum pengaktifan protrombin menjadi trombin dan pengaktifan

fibrinogen menjadi fibrin yang dikatalisis trombin.Selama proses koagulasi terdapat berbagai

faktor yang mempengaruhi jalannya proses tersebut. Faktror-faktor tersebut antara lain faktor

I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XII. Faktor I memiliki nama fibrinogen yang

bersama dengan trombin dapat mengaktifkan fibrin. Faktor II dikenal juga sebagai

protrombin.Faktor ini dalam koagulasi darah berfungsi mengaktifkan platelet aktif oleh

protrombinase complex.Faktor III dan IV merupakan kofaktor yang mengandung

Ca2+.Faktor-faktor yang lainnya memiliki peranan masing-masing dalam koagulasi

darah.Faktor Xa yang dihasilkan baik dari jalur intrinsik dan ekstrinsik, akan mengaktifkan

protrombin (faktor II) menjadi trombin (faktor Iia) yang selanjutnya mengkonversi fibrinogen

menjadi fibrin. Aktivasi protrombin membutuhkan protrombinase kompleks yang

mengandung platelet fosfolipid anion, Ca2+, faktor Va, Xa dan protrombin. Faktor-faktor

tersebut akan menghasilkan 2 rantai molekul trombin yang diikat oleh ikatan

disulfida.Trombin yang sudah aktif akan mengaktifkan fibrinogen menjadi fibrin. Fibrinogen

merupakan larutan glikoprotein plasma yang terdiri dari tiga rantai polipeptida yang

nonidentik yang terhubung oleh ikatan disulfida.Ketiga rantai polipeptida tersebut disintesis

di hati dan baru diregulasikan ke tubuh. Trombin yang merupakan serin protease akan

menghidrolis 4 ikatan Arg antara fibrinopeptida  rantai α β fibrinogen. Pada saat

pengkonversian fibrinogen menjadi fibrin, trombin juga akan mengkonversi faktor XIII

menjadi faktor XIIIa yang merupakan transglutaminase spesifik. Enzim ini akan

menghasilkan fibrin yang lebih stabil.Trombin peredarannya harus dikontrol karena

berpengaruh terhadap pembentukan fibrin.Pengaturannya dapat dengan feedback mechanism

dan ccirculating inhibitory.Normalnya keempat inhibitor trombin berada di membran

plasma.Dari keempat inhibitor tersebut yang paling penting adalah antitrombin inhibitor yang

berperan sekitar 75% dalam aktivitas antitrombin.Inhibitor ini dapat menghambat aktivitas

faktor Ixa, Xa, Xia, XIIa, dan VIIa yang berperan dalam koagulasi darah.Keberadaan

senyawa heparin semakin meningkatkan aktivitas antitrombin. Heparin akan mengikat sisi

kation antitrombin III, mengubah konformasinya, dan memulai mengikat trombin. Prinsip

inilah yang menjadikan heparin di dalam dunia kedokteran digunakan sebagai antikoagulan.

Selain heparin, antikoagulan lain adalah komarin. Komarin ini akan menghambat vitamin K

yang digunakan untuk karboksilasi Glu menjadi residu Gla yang merupakan terminal amino

pada faktor II, VII, IX , X, protein C dan S.

Setelah fibrin melakukan fungsinya dalam koagulasi darah, fibrin harus didegradasi untuk

menjaga keseimbangan dalam sistem koagulasi. Proses penghancuran dan pelarutan fibrin ini

disebut fibrinolisis. Sistem fibrinolisis terdiri dari tiga komponen utama yaitu sistem

plasminogen, aktivator plasmin dan inhibitor plasmin (Budhiarta, 2007).

Plasmin dibentuk dari reaksi enzimatis multikomponen pada sistem plasminogen.Plasmin

merupakan serin protease yang bertanggung jawab terhadap degradasi fibrin dan

fibrinogen.Plasmin tersirkuasi dalam bentuk zimogen inaktif yaitu plasminogen.Plasmin

diaktivasi oleh dua jenis aktivator yaitu tissue-type PA (t-PA) dan urokinase-type PA (u-

PA).Kinerja plasmin juga dapat dihambat oleh α2-antiplasmin (α2-AP) dan plasmingen

activator inhibitor (Budhiarta, 2007).

Alteplase (t-PA) merupakan serin protease yang masuk ke dalam sirkulasi dari vaskular

endotelium  pada saat terluka atau stres. Aktivator ini akan mnegubah plasminogen menjadi

plasmin yang dapat menjadikan fibrin mudah di degradasi dan larut. Baik plasmin dan

aktivatornya dapat kembali berikatan pada produk degradasinya dalam bentuk fase cair

sebagaimana sebelum diaktifkan.Aktivator plasminogen lainnya adalah urokinase.Awalnya

diisolasi di urin, kemudian disintesis dari tipe makrofag, monosit, fibroblas dan sel epitel.

Koagulasi darah juga dapat terjadi secara spontan sewaktu darah mengalir di dalam

pembuluh darah dengan sebab yang belum dapat dijelaskan.Pada keadaan yang terakhir ini

jendalan darah yang terbentuk, disebut thrombus (thrombi), dapat menyumbat aliran darah

apabila terjadi pada arteriola atau venula (pembuluh darah yang sempit). Penyumbatan aliran

darah tersebut akan menjadi persoalan yang serius apabila menyangkut pasokan darah pada

organ – organ fital seperti otak (terjadi stroke) dan otot jantung (infarct myocard). Atas dasar

kondisi patologis tersebut maka pemakaian antikoagulan dalam terapi menjadi sangat

bermakna.

Proses yang mengawali pembentukan bekuan fibrin sebagai respons terhadap cedera

jaringan dilaksanakan oleh lintasan ekstrinsik. Lintasan intrinsic pengaktifannya berhubungan

dengan suatu permukaan yang bermuatan negative. Lintasan intrinsic dan ekstrinsik menyatu

dalam sebuah lintasan terkahir yang sama yang melibatkan pengaktifan protrombin menjadi

thrombin dan pemecahan fibrinogen yang dikatalis thrombin untuk membentuk fibrin. Pada

pristiwa diatas melibatkan macam jenis protein yaitu dapat diklasifikaskan sebagai berikut:

a. Zimogen protease yang bergantung pada serin dan diaktifkan pada proses koagulasi

b.Kofaktor

c.Fibrinogen

d.Transglutaminase yang menstabilkan bekuan fibrin

e.Proteinpengatur dan sejumla protein lainnya

Lintasan intinsik melibatkan factor XII, XI, IX, VIII dan X di samping prekalikrein,

kininogen dengan berat molekul tinggi, ion Ca2+ dan fosfolipid trombosit. Lintasan ini

membentuk factor Xa (aktif).

Lintasan ini dimulai dengan “fase kontak” dengan prekalikrein, kininogen dengan berat

molekul tinggi, factor XII dan XI terpajan pada permukaan pengaktif yang bermuatan

negative. Secara in vivo, kemungkinan protein tersebut teraktif pada permukaan sel endotel.

Kalau komponen dalam fase kontak terakit pada permukaan pengaktif, factor XII akan

diaktifkan menjadi factor XIIa pada saat proteolisis oleh kalikrein. Factor XIIa ini akan

menyerang prekalikrein untuk menghasilkan lebih banyak kalikrein lagi dengan

menimbulkan aktivasi timbale balik. Begitu terbentuk, factor xiia mengaktifkan factor XI

menjadi Xia, dan juga melepaskan bradikinin(vasodilator) dari kininogen dengan berat

molekul tinggi.

Factor Xia dengan adanya ion Ca2+ mengaktifkan factor IX, menjadi enzim serin

protease, yaitu factor IXa. Factor ini selanjutnya memutuskan ikatan Arg-Ile dalam factor X

untuk menghasilkan serin protease 2-rantai, yaitu factor Xa. Reaksi yang belakangan ini

memerlukan perakitan komponen, yang dinamakan kompleks tenase, pada permukaan

trombosit aktif, yakni: Ca2+ dan factor IXa dan factor X. Perlu kita perhatikan bahwa dalam

semua reaksi yang melibatkan zimogen yang mengandung Gla (factor II, VII, IX dan X),

residu Gla dalam region terminal amino pada molekul tersebut berfungsi sebagai tempat

pengikatan berafinitas tinggi untuk Ca2+. Bagi perakitan kompleks tenase, trombosit

pertama-tama harus diaktifkan untuk membuka fosfolipid asidik (anionic). Fosfatidil serin

dan fosfatoidil inositol yang normalnya terdapat pada sisi keadaan tidak bekerja. Factor VIII,

suatu glikoprotein, bukan merupakan precursor protease, tetapi kofaktor yang berfungsi

sebagai resepto untuk factor IXa dan X pada permukaan trombosit. Factor VIII diaktifkan

oleh thrombin dengan jumlah yang sangat kecil hingga terbentuk factor VIIIa, yang

selanjutnya diinaktifkan oleh thrombin dalam proses pemecahan lebih lanjut.

Lintasan ekstrinsik melibatkan factor jaringan, factor VII,X serta Ca2+ dan menghasilkan

factor Xa. Produksi factor Xa dimulai pada tempat cedera jaringan dengan ekspresi factor

jaringan pada sel endotel. Factor jaringan berinteraksi dengan factor VII dan

mengaktifkannya; factor VII merupakan glikoprotein yang mengandung Gla, beredar dalam

darah dan disintesis di hati. Factor jaringan bekerja sebagai kofaktor untuk factor VIIa

dengan menggalakkan aktivitas enzimatik untuk mengaktifkan factor X. factor VII

memutuskan ikatan Arg-Ile yang sama dalam factor X yang dipotong oleh kompleks tenase

pada lintasan intrinsic. Aktivasi factor X menciptakan hubungan yang penting antara lintasan

intrinsic dan ekstrinsik.

Interaksi yang penting lainnya antara lintasan ekstrinsik dan intrinsic adalah bahwa

kompleks factor jaringan dengan factor VIIa juga mengaktifkan factor IX dalam lintasan

intrinsic. Sebenarna, pembentukan kompleks antara factor jaringan dan factor VIIa kini

dipandang sebagai proses penting yang terlibat dalam memulai pembekuan darah secara in

vivo. Makna fisiologik tahap awal lintasan intrinsic, yang turut melibatkan factor XII,

prekalikrein dan kininogen dengan berat molekul besar. Sebenarnya lintasan intrinsik bisa

lebih penting dari fibrinolisis dibandingkan dalam koagulasi, karena kalikrein, factor XIIa

dan Xia dapat memotong plasminogen, dan kalikrein dapat mengaktifkanurokinase rantai-

tunggal.

Inhibitor lintasan factor jaringan (TFPI: tissue factor fatway inhibitior) merupakan

inhibitor fisiologik utama yang menghambat koagulasi. Inhibitor ini berupa protein yang

beredar didalam darah dan terikat lipoprotein. TFPI menghambat langsung factor Xa dengan

terikat pada enzim tersebut didekat tapak aktifnya. Kemudian kompleks factor Xa-TFPI ini

manghambat kompleks factor VIIa-faktor jaringan.

Pada lintasan terskhir yang sama, factor Xa yang dihasilkan oleh lintasan intrinsic dak

ekstrinsik, akan mengaktifkan protrombin(II) menjadi thrombin (IIa) yang kemudian

mengubah fibrinogen menjadi fibrin.

Pengaktifan protrombin terjadi pada permukaan trombosit aktif dan memerlukan

perakitan kompelks protrombinase yang terdiri atas fosfolipid anionic platelet, Ca2+, factor

Va, factor Xa dan protrombin.

Factor V yang disintesis dihati, limpa serta ginjal dan ditemukan didalam trombosit serta

plasma berfungsi sebagai kofaktor dng kerja mirip factor VIII dalam kompleks tenase. Ketika

aktif menjadi Va oleh sejumlah kecil thrombin, unsure ini terikat dengan reseptor spesifik

pada membrane trombosit dan membentuk suatu kompleks dengan factor Xa serta

protrombin. Selanjutnya kompleks ini di inaktifkan oleh kerja thrombin lebih lanjut, dengan

demikian akan menghasilkan sarana untuk membatasi pengaktifan protrombin menjadi

thrombin. Protrombin (72 kDa) merupakan glikoprotein rantai-tunggal yang disintesis di

hati.Region terminal-amino pada protrombin mengandung sepeuluh residu Gla, dan tempat

protease aktif yang bergantung pada serin berada dalam region-terminalkarboksil molekul

tersebut. Setelah terikat dengan kompleks factor Va serta Xa pada membrane trombosit,

protrombin dipecah oleh factor Xa pada dua tapak aktif untuk menghasilkan molekul

thrombin dua rantai yang aktif, yang kemudian dilepas dari permukaan trombosit. Rantai A

dan B pada thrombin disatukan oleh ikatan disulfide.

Fibrinogen (factor 1, 340 kDa) merupakan glikoprotein plasma yang bersifat dapat larut

dan terdiri atas 3 pasang rantai polipeptida nonidentik (Aα,Bβγ)2 yang dihubungkan secara

kovalen oleh ikatan disulfda. Rantai Bβ dan y mengandung oligosakarida kompleks yang

terikat dengan asparagin. Ketiga rantai tersebut keseluruhannya disintesis dihati: tiga

structural yang terlibat berada pada kromosom yang sama dan ekspresinya diatur secara

terkoordinasi dalam tubuh manusia. Region terminal amino pada keenam rantai

dipertahankan dengan jarak yang rapat oleh sejumlah ikatan disulfide, sementara region

terminal karboksil tampak terpisah sehingga menghasilkan molekol memanjang yang sangat

asimetrik. Bagian A dan B pada rantai Aa dan Bβ, diberi nama difibrinopeptida A (FPA) dan

B (FPB), mempunyai ujung terminal amino pada rantainya masing-masing yang mengandung

muatan negative berlebihan sebagai akibat adanya residu aspartat serta glutamate disamping

tirosin O-sulfat yang tidak lazim dalam FPB. Muatannegatif ini turut memberikan sifat dapat

larut pada fibrinogen dalam plasma dan juga berfungsi untuk mencegah agregasi dengan

menimbulkan repulse elektrostatik antara molekul-molekul fibrinogen.

Thrombin (34kDa), yaitu protease serin yang dibentuk oleh kompleks protrobinase,

menghidrolisis 4 ikatan Arg-Gly diantara molekul-molekul fibrinopeptida dan bagian α serta

β pada rantai Aa dan Bβ fibrinogen. Pelepasan molekul fibrinopeptida oleh thrombin

menghasilkan monomer fibrin yang memiliki struktur subunit (αβγ)2. Karena FPA dan FPB

masing-masing hanya mengandung 16 dab 14 residu, molwkul fibrin akan mempertahankan

98% residu yang terdapat dalam fibrinogen. Pengeluaran molekul fibrinopeptida akan

memajankan tapak pengikatan yang memungkinkan molekul monomer fibrin mengadakan

agregasi spontan dengan susunan bergiliran secara teratur hingga terbentuk bekuan fibrin

yang tidak larut. Pembentukan polimer fibrin inilah yang menangkap trombosit, sel darah

merah dan komponen lainnya sehingga terbentuk trombos merah atau putih.Bekuan fibrin ini

mula-mula bersifat agak lemah dan disatukan hanya melalui ikatan nonkovalen antara

molekul-molekul monomer fibrin.

Selain mengubah fibrinogen menjadi fibrin, thrombin juga mengubah factor XIII menjadi

XIIIa yang merupakan transglutaminase yang sangat spesifik dan membentuk ikatan silan

secara kovalen anatr molekul fibrin dengan membentuk ikatan peptide antar gugus amida

residu glutamine dan gugus ε-amino residu lisin, sehingga menghasilkan bekuan fibrin yang

lebih stabil dengan peningkatan resistensi terhadap proteolisis.

Regulasi thrombin begitu thrombin aktif terbentuk dalam proses hemostasis atau

thrombosis, konsentrasinya harus dikontrol secara cermat untuk mencegah pembentukan

bekuan lebih lanjut atau pengaktifan trombosit. Pengontrolan ini dilakukan melalui 2 cara

yaitu:

1. Thrombin beredar dalam darah sebagai prekorsor inaktif, yaitu protrombin. Pada setiap

reaksinya, terdapat mekanisme umpan balik yang akan menghasilkan keseimbangan antara

aktivasi dan inhibisi.

2. Inaktivasi setiap thrombin yang terbentuk oleh zat inhibitor dalam darah.

Ada beberapa kelompok senyawa / obat yang mempengaruhi proses koagulasi darah

dengan beberapa mekanisme yang berbeda. Kelompok senyawa yang pertama yang disebut

dengan antikoagulansia.Kelompok senyawa ini diwakili oleh heparin dan warfarin.Heparin,

sebuah glikosaminoglikan yang bersifat asam, dapat menghambat koagulasi darah dengan

meningkatkan pembentukan kompleks antithrombin III (sebuah inhibitor protease) dengan

thrombin sehingga thrombin tidak mampu mengubah fibrinogen menjadi fibrin.Antikoagulan

ini merupakan asam mukopolisacharida yang bekerja dengan cara menghentikan

pembentukan trombin dari prothrombin sehingga menghentikan pembentukan fibrin dari

fibrinogen. Ada tiga macam heparin: ammonium heparin, lithium heparin dan sodium

heparin. Dari ketiga macam heparin tersebut, lithium heparin paling banyak digunakan

sebagai antikoagulan karena tidak mengganggu analisa beberapa macam ion dalam

darah.Heparin banyak digunakan pada analisa kimia darah, enzim, kultur sel, OFT (osmotic

fragility test). Konsentrasi dalam penggunaan adalah : 15IU/mL +/- 2.5IU/mL atau 0.1 – 0.2

mg/ml darah. Heparin tidak dianjurkan untuk pemeriksaan apusan darah karena

menyebabkan latar belakang biru.Heparin aktif secara in vivo dan in vitro, tetapi durasi

aksinya pendek. Warfarin adalah derivate kumarin dan strukturnya mirip vitamin K. Warfarin

mampu mencegah koagulasi darah dengan menghambat reduktase vitamin K sehingga

gamma-karboksilasi residu glutamate dari prothrombin terhambat, dan menghasilkan factor

VII, IX, X, dan prothrombin yang inaktif. Warfarin hanya aktif in vivo.

Kelompok senyawa yang kedua adalah senyawa – senyawa yang bersifat fibrinolitik

(melisis fibrin) seperti streptokinase, alteplase, dan retaplase.Streptokinase bukan sebuah

enzim, mampu membentuk komplek dengan plasminogen dan komplek ini mengaktifkan

plasminogen menjadi plasmin.Plasmin adalah sebuah enzim protease yang mampu melisis

fibrin sehingga tidak terjadi thrombus. Alteplase adalah activator plasminogen hasil

rekombinasi DNA (recombinant-tissue plasminogen activator = rt-PA). Selektifitas kelompok

senyawa ini dalam menghambat koagulasi darah adalah berdasarkan perbedaan keberadaan

inhibitor plasmin didalam sirkulasi dengan yang ada di dalam thrombi. Di dalam sirkulasi

kadar inhibitor plasmin sangat tinggi sedangkan di dalam thrombi kadar inhibitor plasmin

sangat rendah.

Kelompok senyawa penghambat koagulasi yang ketiga adalah kelompok yang disebut

sebagai antiplatelet seperti aspirin, klopidogrel, tiofiban, eptifibatide, abciximab, dan

dipyridamole.Senyawa ini efektif mencegah terjadinya thrombosis di arteri.Sedang

antikoagulan tidak efektif mengatasi thrombosis di arteri.Hal ini dikarenakan thrombi yang

terbentuk pada darah yang mengalir cepat, seperti di arteri, tersusun atas banyak platelet dan

sedikit fibrin. Sesuai dengan namanya antiplatelet menghambat koagulasi dengan cara

mencegah terjadinya agregasi platelet. Di dalam arteri yang atheromatous, plaques yang

terbentuk memiliki inti besar yang kaya lipid dan dibungkus kapsul berserabut tipis.Kapsul

ini gampang pecah dan apabila pecah maka kolagen subendotelialakan terbuka dan

mengaktifkan platelet dan beragregasi. Pecahnya kapsul plaque dan terbukanya kolagen

subendotelial ini akan melepaskan thromboksan A2, ADP, dan 5-hidroksitriptamin (5-HT)

yang akan lebih memacu agregasi platelet. TXA2 adalah inductor kuat terjadinya agregasi

platelet.Aspirin dapat menghambat sintesis TXA2 oleh enzim siklooksigenase.Klopidogrel

mencegah agregasi platelet dengan cara memblok secara irreversible efek ADP pada platelet.

Dalam dunia pengobatan senyawa / obat yang mampu menghambat koagulasi darah ini

sering digunakan pada pasien – pasien yang dalam masa recovery dari serangan stroke, atau

pada pasien – pasien yang mempunyai resiko infarct myocard karena terjadinya thrombus

pada arteri yang memasok darah ke otak atau otot jantung. Heparin biasanya diberikan secara

injeksi sub cutan atau intra vena. Efek samping utama dari heparin adalah perdarahan.Oleh

karena durasi efeknya yang singkat perdarahan yang terjadi dapat diatasi dengan

menghentikan pemberian heparin.Bila dianggap perlu dapat dinetralkan efeknya dengan

injeksi intra vena protamin, sebuah peptide yang basa.Warfarin dapat diberikan peroral

karena dapat diabsorpsi dengan baik di saluran pencernaan. Onsetnya lama, tetapi juga

mempunyai waktu paro biologic yang panjang (40 jam) dan membutuhkan waktu hingga 5

hari untuk nilai prothrombin time kembali normal setelah pemberian warfarin dihentikan.

Dalam praktikum ini akan dilihat efek senyawa – senyawa penghambat koagulasi darah

baik secara in vivo maupun in vitro, dengan mengamati waktu yang diperlukan untuk

terjadinya penjendalan darah yang ditunjukkan dengan terbentuknya benang – benang fibrin.

Demikian juga akan diamati pengaruh pemberian protamine sulfat dalam menetralkan efek

antikoagulasi heparin. Metode ini dalam bioanalisis juga sering menjadi metode untuk

menetapkan potensi antikoagulansia warfarin atau heparin atau potensi protamine.

III.ALAT dan BAHAN

1. Alat :

- Pisau scalpel

- Spuit injeksi 1 ml

- Jarum/pipa kapiler

- Gelas arloji

- Stop watch

2. Bahan :

- Heparin

- Warfarin

- Aspirin

- Protamine sulfat

- Tikus putih (Rattus norvegicus) dewasa jantan atau betina galur Wistar /

Sprague-Dawley

IV. CARA KERJA

Ditimbang tikus, ditentukan dosis

Dilakukan percobaan in vivo dengan memberikan dosis heparin secara i.v atau

warfarin atau aspirin secara p.o

10 menit setelah pemberian heparin atau 60 menit setelah pemberian warfarin /

aspirin, tikus disayat ekornya pada vena lateralis sehingga darah mengalir keluar

darah dibersihkan dengan kain flannel atau kertas tissue dan darah dibiarkan mengalir

lagi secara teratur dan diamati sampai terjadinya penjendalan darah yang ditandai

dengan berhentinya aliran darah pada luka buatan tersebut

Dicatat waktu penjendalan darah yaitu waktu dari keluarnya darah pertama kali

sampai darah berhenti mengalir

Dilakukan in vitro dengan mengambil 4x0,5 mL – 1,0 mL darah tikus yang tidak

diberi obat, diteteskan pada 4 gelas arloji

Semua sampel darah ditambah larutan 0,1 % kalsium sitrat 0,2 mL, gelas I ditambah

dengan volume yang sama larutan heparin dengan kadar 0,5 mg/mL, gelas II

dicampur dengan warfarin, gelas III dicampur dengan aspirin, gelas IV tidak dicampur

apa – apa, dihomogenkan dengan jarum

Pada waktu – waktu tertentu ujung jarum tersebut diangkat pelan – pelan, dicatat

waktu prothrombin (waktu antara penetesan darah di gelas arloji dan terbentuknya

benang fibrin)

Percobaan untuk melihat efek protamine sulfat dalam menetralkan efek heparin dapat

dilakukan secara in vivo / in vitro

V. DATA DAN PERHITUNGAN

Obat Waktu Penjendalan (s) Berat Tikus (s)

In vivo In vitro In vivo In vitro

Kontrol 87 16 209,5

231,5Aspirin 153 1800 191,5

Heparin 427 27 196,4

Perhitungan Dosis :

In vivo

Volume pemberian = manusia tikus

80 mg 80 x 0,018 = 1,44 mg/200 g BB

Heparin = 1 mL

Aspirin 100 mg ad 10 mL CMCNa 0,5%

V 1× M 1=V 2 × M 2

V 1× 10mgml

=1,376mgml

×10 ml

V 1=1,376 ml

80 mg ×0,018= 1,44 mg200 g BB

Bobot tikus = 191,1

1,44 mg200 g BB

= xmg191,1 g

x=1,376 mg

In Vitro

80 x 0,018 = 1,44 mg

1/5 x 1,44 mg = 0,288 mg

= 0,288 mg/200 g BB x 231,5 g = 0,33 mg

stok=0,33 mg0,2 ml

=1,65 mg /ml

1,65mgml

×100 ml=165 mg 165 mg ad 100 Ml

VI. PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa mampu melakukan percobaan farmakologi

untuk melihat efek antikoagulansia terhadap waktu koagulasi darah (penjendalan darah,

blood cotting).

Pada percobaan ini dilihat efek senyawa-senyawa penghambat koagulasi darah baik

secara in vivo maupun in vitro. Senyawa yang digunakan sebagai obat antikoagulansia

pada praktikum ini adalah aspirin dan heparin. Pengamatan secara in vivo, heparin

diberikan intra vena, sedangkan aspirin diberikan secara per oral. Heparin termasuk dalam

kelompok antikoagulansia yang kerjanya mempengaruhi fase koagulasi hemostatis, atau

menghambat perkembangan dan perluasan pembentukan klot darah. Efek samping dari

penggunaan antikoagulan tersebut adalah hemoragi atau pendarahan. Seperti obat

antiplatelet, obat antikoagulan juga tidak efektif terhadap klot darah yang sudah terbentuk

dan tidak dapat melarutkan atau melisis klot tersebut, sehingga penggunaannya hanya

bersifat prefentif. Obat antikoagulan mencegah atau memperlambat pembentukan klot

darah yang terjadi. Obat ini digunakan pada terapi propilaksis trombosis arteri maupun

vena, dan pada pasien yang mengalami fibrasi atrium bisa menurunkan resiko embolisme

dan stroke. (Agung, 2011)

Obat golongan ini dibagi menjadi dua berdasarkan cara pemberiannya yaitu

antikoagulan injeksi dan oral.

a) Antikoagulan injeksi, contohnya : Heparin. Obat bekerja dengan mempengaruhi

aktivasi faktor pembentuk klot, baik pada jalur intrinsik dan ekstrinsik. Heparin beraksi

dengan mengikat antitrombin III (Inhibitor enzim hemostatis), selanjutnya

meningkatkan aktivitas antitrombin III (ATIII). Komplek heparin dan ATIII dapat

menghambat faktor pembentuk trombin dan selanjutnya menghambat pembentukan

klot darah. Ringkasnya, heparin (berikatan dengan ATIII) mempercepat proses

inaktivasi faktor pembentuk klot, sehingga mencegah proses pembentukan klot darah.

Heparin sering dalam bentuk low-molecular-weight (LMW). (Agung, 2011)

Nama Produk : Heparin

Molecule Formula : C26H41NO34S4

Berat Molekul : 1039.85

Struktur Molekul :

Kepadatan : 2,13 g/cm3

Indeks bias : 1,711

(www.chemnet.com)

b) Antikoagulan oral, contohnya : Warfarin dan dikumarol. Warfarin merupakan antagonis

vitamin K. Vitamin K merupakan vitamin larut lemak yang berasal dari tanaman.

Vitamin K sangat penting dalam pembentukan faktor pembentuk klot, dan dalam

sintesis faktor tersebut membutuhkan vitamin K sebagai kofaktor. Ringkasnya, Faktor

pembentuk klot (dalam bentuk aktif) dibentuk oleh prekursornya dengan melibatkan

vitamin K sebagai kofaktor. Warfarin berefek berlawanan dengan vitamin K, yaitu

memperlambat proses pembentukan faktor pembentuk klot aktif tersebut. Namun tidak

berpengaruh teradap faktor tersebut apabila sudah teraktivasi. Pemberian vitamin K

dapat melawan efek antikoagulan tersebut, namun memerlukan waktu agak lama (24

jam). Hal ini disebabkan untuk menghasilkan faktor koagulasi yang baru juga

membutuhkan waktu lama. Warfarin digunakan untuk terapi jangka panjang. (Agung,

2011)

Aspirin termasuk dalam kelompok obat penghambat agregasi platelet (antiplatelet)

golongan TXA2 (tromboksan A2) inhibitor. Aspirin beraksi dengan menghambat

pembentukan TXA2, melalui penghambatan enzim siklooksigenase. Obat ini digunakan

untuk penghambatan agregasi platelet dan memperpanjang waktu pendarahan.

Nama Produk : Aspirin

Molecule Formula : C9H8O4

Berat Molekul : 180.15742

Struktur Molekul :

(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

Pada praktikum ini, digunakan 4 ekor hewan uji (tikus). 3 ekor untuk pengamatan

secara in vivo, masing-masing diberikan: heparin secara intra vena, aspirin juga secara per

oral, dan satu tikus sebagai kontrol (tidak diberi senyawa penghambat koagulasi).

Sedangkan satu ekor yang lain untuk pengamatan secara in vitro.

Awalnya, tikus ditimbang untuk menentukan dosis pemberian senyawa uji. Penentuan

dosis berdasarkan dosis lazim pada manusia untuk masing-masing senyawa kemudian

dikonversi menjadi dosis tikus. Untuk pengamatan secara in vivo, heparin diberikan

sebanyak 1 ml secara intra vena, dan aspirin sebanyak 1,376 ml secara per oral. Setelah 10

menit pemberian heparin, atau 60 menit setelah pemberian warfarin dan aspirin, ekor tikus

disayat pada vena lateralis. Pada tikus yang diberikan heparin, hanya ditunggu 10 menit

untuk disayat ekornya, karena pemberiannya secara intra vena, diasumsikan bahwa

heparin sudah tersebar ke seluruh tubuh tikus. Sedangkan pada pemberian per oral aspirin

ditunggu sampai 60 menit, karena obat yang diberikan akan melalui proses absorbsi dulu

kemudian disebarkan ke seluruh tubuh.

Setelah ekornya disayat, darah segera dibersihkan dan dibiarkan mengalir lagi secara

teratur. Diamati sampai terjadi penjendalan darah yang ditandai dengan berhentinya aliran

darah. Waktu dari keluarnya darah pertama kali sampai darah berhenti mengalir dicatat

sebagai waktu penjendalan darah. Diperoleh waktu penjendalan darah pada tikus kontrol

yaitu 87 detik, pada tikus yang diberi aspirin 153 detik, dan pada tikus yang diberi heparin

427 detik. Dari hasil tersebut terlihat perbedaan waktu penjendalan antara tikus kontrol

dan tikus yang diberi obat heparin maupun aspirin. Pada tikus kontrol, waktu

penjendalannya cepat, sedangkan pada tikus yang diberi senyawa antikoagulan waktu

penjendalan darahnya cukup lama. Sehingga dapat dikatakan bahwa obat yang dibeikan

memberikan efek antikoagulan. Namun waktu penjendalan paling lama ditunjukkan pada

tikus yang diberi heparin. Menurut teori, aspirin akan mengahasilkan waktu penjendalan

lebih lama karena aspirin termasuk ke dalam kelompok antiplatelet dimana mekanisme

kerjanya adalah menghambat sintesis thromboksan A2 oleh enzim siklooksigenase.

Senyawa dalam kelompok antipletelet ini efektif mencegah terjadinya thrombosis di arteri,

sehingga durasi aksi kelompok antiplatelet lebih lama jika dibandingkan dengan

antikoagulan, dalam hal ini heparin. Hasil yang diperoleh dari percobaan secara in vivo ini

tidak sesuai teori.

Selain itu, dilakukan pengamatan secara in vitro. Tikus yang tidak diberi obat, darahnya

diambil secukupnya, sebanyak 3 kali. Darah tersebut masing-masing diteteskan pada 3

gelas arloji. Semua sampel darah ditambah larutan 0,1% kalsium sitrat. Gelas pertama

darah dicampur dengan larutan heparin sebanyak 12 tetes ≈ 0,2 ml, gelas kedua darah

dicampur dengan aspirin juga sebanyak 12 tetes ≈ 0,2 ml, dan gelas terakhir tidak dicampur

apapun. Campuran tersebut dihomogenkan dengan ujung jarum, pada waktu tertentu ujung

jarum diangkat pelan-pelan dan diamati. Bila terjadi benang-benang fibrin maka di ujung

jarum tersebut terlihat bentukan seperti benang-benang yang menggelayut. Waktu dari

penetesan darah di gelas arloji sampai terbentuknya benang fibrin dicatat sebagai waktu

prothrombine time. Didapatkan prothrombine time pada darah yang tidak diberi apapun

selama 16 detik, sedangkan pada darah yang dicampur dengan aspirin selama 1800 detik,

serta pada darah yang dicampur heparin selama 27 detik. Prothrombine time pada darah

yang tidak dicampur apapun terlihat paling singkat dibanding dengan prothrombine time

darah yang dicampur obat. Hal ini menunjukkan bahwa obat yang diberikan (heparin dan

aspirin) berefek antikoagulan. Darah yang dicampur aspirin, prothrombine timenya lebih

panjang daripada darah yang dicampur heparin. Hal ini sesuai dengan teori, karena aspirin

termasuk ke dalam kelompok antiplatelet di mana aksinya lebih lama jika dibandingkan

dengan antikoagulan, dalam hal ini adalah heparin.

VII. KESIMPULAN

1. Heparin dan aspirin mempunyai efek antikoagulan

2. Waktu penjendalan darah control : 87 detik

Waktu penjendalan darah Heparin : 427 detik

Waktu penjendalan darah Aspirin : 153 detik

3. Kecepatan penjendalan darah secara invitro adalah heparin > aspirin > control

4. Maknisme penjendalan darah dari :

Heparin : Meningkatkan pembentukan kompleks antithrombin III dengan

thrombin

Aspirin : Menghambat sintesis TXA2 oleh enzim siklooksigenase

5. Heparin memiliki durasi yang lebih cepat dibandingkan Aspirin

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2013, “Heparin”, http://www.chemnet.com, diakses pada tanggal 1 Desember

2013 pukul 09:00 WIB

Anonim, 2013, “Aspirin”, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, diakses pada tanggal 1

Desember 2013 pukul 09:34 WIB

Djamhuri, Agus, 1995, Sinopsis Farmakologi Dengan Terapan Khusus di Klinik dan

Perawatan, Hipokrates, Jakarta

Neal, Michael J., 2006, At A Glance Farmakologis Medis, Erlangga, Jakarta

Nugroho, A.E, 2011, Farmakologi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta

Syarif, Amir dkk, 2007, Farmakologi dan Terapi, Departemen Farmakologi dan

Teraupetik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta

Tambayong, Jan, 2001, Farmakologi Untuk Keperawatan, Widya Medika, Jakarta