Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk menilai efek cardio-protective dari minyak Nigella sativa atau

Nigella sativa Oil (NSO) pada kerusakan jantung yang di induksi logam timbal (Pb). Empat

puluh lima tikus putih di bagi ke dalam tiga kelompok secara acak: kelompok kontrol,

kelompok timbal (Pb) yang menerima timbal Asetat (20mg/kg/hari) 3 kali seminggu selama 8

minggu dan kelompok timbal + NSO yang menerima perlakuan NSO (4ml/kg) peroral 1 jam

sebelum pemberian timbal asetat (pemberian timbal sama dengan kelompok timbal).

Kerusakan otot jantung di nilai dengan studi laboratoris dan patologis, dan denyut jantung

diukur pada semua hewan coba. Timbal yang diberikan mengakibatkan peningkatan

signifikan dari cardiac high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), interlukin-6 (IL-6), E-

selectin, troponin I, malondialdehyde (MDA) dan serum creatine kinase-MB (CK-MB).

Kadar cardiac apelin, superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) dan

glutathione (GSH) menurun secara signifikan pada Kelompok timbal jika dibandingkan

dengan kelompok kontrol. Denyut jantung dan segmen ST meningkat secara signifikan pasca

pemberian timbal. Beberapa jenis lesi pada jantung yang timbul akibat pemberian timbal

antara lain, hemoragik, nekrosis otot jantung, infiltrasi mononuclear sel dan fibrosis. Hasil

pemeriksaan Immuno histochemical jantung menunjukan adanya ekspresi cyclooxygenase-2

(Cox-2) pada kelompok yang diberikan timbal. Pemberian NSO menghasilkan normalisasi

signifikan dari parameter fisiologis dan struktur histologi juga menurunkan ekspresi dari

Cox-2 jika dibandingkan dengan kelompok timbal. Kesimpulannya adalah bahwa pemberian

NSO memiliki potensi cardio protective melalui kemampuannya dalam menurunkan kadar

sitokin pro inflamasi, stress oksidatif dan kerusakan jaringan jantung pada kerusakan jantung

yang diinduksi timbal.

PENDAHULUAN

Penyakit Jantung Pembuluh (PJP) telah menjadi penyebab tersering kematian di

seluruh dunia dan insidennya terus menerus meningkat. Menurut Roshan et al (2011) terdapat

hubungan antara PJP dengan proses inflamasi dan stress oksidatif. Timbal (Pb) adalah salah

satu sumber toksik logam berat yang banyak tersebar di lingkungan. Paparan kronik terhadap

kadar Pb rendah dapat menyebabkan berbagai kelainan fisiologi, biokimia dan kebiasaan

(Ahamed and Siddiqui 2007; Alghazal et al., 2008).

Hubungan antara kadar polusi di udara telah banyak dilaporkan (Makri and

Stilianakis, 2008). Beberapa penelitian sebelumnya menunjukan bahwa paparan terhadap

kadar Pb rendah berhubungan dengan beberapa penyakit seperti hipertensi dan penyakit

jantung pembuluh. Telah dibuktikan bahwa salah satu mekanisme kerusakan akibat Pb adalah

proses inflamasi general (Boris et al., 2008) dan disturbansi dari keseimbangan prooksidan

dan antioksidan dengan terbentuknya Reactive Oxygen Species (ROS) (Alghazal et al.,2008;

Roshan et al., 2012). Adipokin seperti apelin, C-reactive protein (CRP), tumor necrosis factor

TNF-α dan E-selectin adalah beberapa kelompok protein diproduksi oleh adiposit yang

mempengaruhi berbagai proses biologis termasuk metabolisme, satiety, inflamasi dan fungsi

jantung-pembuluh (Gaeini et al., 2008).

Nigella sativa (NS) Linn. merupakan tumbuhan tahunan dari famili Ranunculaceae

dan banyak tumbuh di negara-negara tepi laut tengah, pakistan, india, dan iran (Ali and

Blunden, 2003). Biji dari N. sativa mangandung lebih dari 30% fixed oil dan 0.4 to 0.45%

volatile oil. Penyusun utama dari fixed oil adalah asam lemak tak jenuh. Bahan aktif yang

banyak terkandung dalam volatile oil NSO adalah Thymoquinone (TQ) (Worthen et al.,

1998). Thymoquinone memiliki efek antioksidan tinggi lewat aktivitasnya mencari dan

menangkap radikal bebas (Känter et al., 2005). Banyak penelitian telah menunjukan aktivitas

biologis lain dari zat aktif ini seperti anti-hypertensive, anti diabetic, anti-bacterial, anti-

tumour and immunomodulator (Kӧkdil et al., 2009). Kemudian daripada itu, penelitian ini

dimaksudkan untuk meneliti lebih jauh tentang kemungkinan efek kardio protektif dari NSO

pada kerusakan jantun yang diinduksi oleh Pb.

MATERIALS & METHODS

Zat Kimia

Timbal asetat dibeli dari Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Biji N. sativa didapat dari

pasar lokal di Assiut, Mesir.Bahan-bahan tersebut diautentikasi oleh Pharmacognsy

Department, Faculty of Pharmacy, Assiut University, Egypt. Minyak esensial jintan hitam

(NSO) disiapkan dengan melalui proses sebagaimana yang dijelaskan oleh Burits and Bucar

(2000); 75 g jintan hitam dihancurkan dan diekstraksi menggunakan 220ml light petroleum

ether dalam Soxhlet apparatus. Proses ekstraksi dilakukan berulang hingga didapatkan

minyak yang cukup. Minyak yang terkumpul kemudian dianalisis menggunakan high

performance liquid chromatography (HPLC) berapa kadar thymoquinone yang terkandung

sesuai dengan proses yang dijelaskan oleh Ghosheh et al. (1999). Kolom yang digunakan

adalah Reprosil Gold 120 C18 type (250 × 4.6 mm,5 μm particle size). Isocratic mobile phase

terdiri dari H2O: methanol: 2-propanol dengan perbandingan volume 10: 9: 1. Temperatur

kolom dan rerata kecepatan aliran adalah 28°C dan 1 ml/min. Detektor yang digunakan

adalah DAD (254.4 nm) dan jumlah injeksi yang digunakan adalah sebanyak 5 μl. Minyak

disimpan dalam keadaan beku dengan suhu -20°C hingga digunakan.

Hewan Coba

Protokol penelitian telah disetujui oleh the Institutional Animal Research Committee of the

Faculty of Medicine, Assiut University, Egypt. Empat puluh lima tikus putih Wistar jantan

dewasa, dengan umur 8 minggu, dan berat sekitar 180-200 g didapatkan dan dirawat di The

Assiut University Animal Nutrition and Care House. Hewan coba ditempatkan di kandang

yang mendukung metabolisme dan dijaga sesuai dengan standar laboratorium konvensional

pada temperatur 22 ± 2°C, dengan kelembaban relatif 50 ± 5% dan siklus gelap terang 12-

jam/12-jam. Meraka mendapat akses tak terbatas untuk makanan dan minuman. Hewan coba

dibagi kedalam 3 kelompok percobaan dengan masing-masing kelompok 15 tikus. Kelompo

1 (kelompok kontrol): tikus hanya diberikan makan dan minuman selama 8 minggu. 2

(kelompok Pb) kelompok tikus yang mendapatkan injeksi timbal asetat dari Sigma (St. Louis,

MO), dengan dosis 20 mg/kg dalam bentuk saline solution (for intraperitoneal [ip] injection),

3 kali dalam seminggu selama 8 minggu (Ghosheh et al., 1999). 3 (kelompok Pb + NSO)

kelompom tikus yang mendapat tambahan NSO (4 ml/kg) peroral 1 jam sebelum pemberian

timbal asesta—jumlah serta pemberian timbal asetat sama dengan kelompok 2 (kelompok Pb)

EKG

Penyadapan EKG dilakukan sesaat setelah perlakuan. EKG didapatkan dengan cara

memasukan jarum elektroda ke bawah kedua kulit tungkai dan lengandibawah pengaruh

anestesi menggunakan urethane (1 g/kg, intraperitoneal injection) pada posisi lead II. Jarum

terhubung dengan perekam EKG (ECG Cardiofax Nih Onkohn Kohden, Kogyo Co. Ltd,

Kogyo, Japan). Kompleks QRS, ST and P-R intervals direkam. Denyut jantung (HR) dihitung

dari interval P-R. Setelah seluruh proses tindakan selesai berat tikus ditimbang dan dicatat.

Sampel darah diambil dari setiap tikus via vena retro orbital. Kemudian, seluruh hewan cona

didekapitasi dibawah pengaruh anestesi urethane. Sampel darah kemudian segera

disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Serum disimpan pada suhu -20oC sampai

proses analisis kadar Creatine Kinase-MB (CK-MB) levels. Kavitas tubuh dibuka kemudian

dengan cepat jantung dipisahkan dari aorta. Jaringan jantung kemudian ditimbang dan

dicatat.

Persiapan Jaringan

Beberapa jaringan jantung dihomogenasi pada ice-cold 10 mmol/L Tris-HC1, pH 8.2,

mengandung 0.25 mol/L sucrose, 2 mmol/L 2-mercaptoethanol, 10 mmol/L sodium azide and

0.1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride dengan polytron (4 vol/wt), dan kemudian

disentrifugasi pada 50,000 g (20 min, 4°C). Supernatan kemudian disimpan pada suhu -20°C.

Pengujian kadar sitokin proinflamasi dari jaringan jantung (Assay of the cardiac levels

of pro-inflammatory cytokines)

Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) digunakan untuk mengukur konsentrasi dari

Apelin (ELISA kit, Phoenix Pharmaceuticals, Inc.), E-selectin (rat E-selectin ELISA Kit),

high sensitive C reactive protein (rat C-reactive protein (CRP) ELISA Kit, e-Biosceince, Inc),

interlukin-6 IL-6 (rat ELISA; BioSource, Camarillo, CA); adalah pemerikasaan yang

digunakan pada total cell ekstrak yang telah disiapkan dari jaringan jantung.

Estimation of cardiac biochemical markers and lead levels

Kadar CK-MB diukur menggunakan commercial kit yang disuplai oleh Agappe

Diagnostics, Kerala, India dan Cardaic troponin I pada cardiac homogenate diperikasa

menggunakan ELISA. Kadar Pb dalam jantung diukur menggunakan atomic absorption

spectrophotometer (Perkin-Elmer, 2380) sesuai dengan metode Slater and Sawyer (1971).

Assay of cardiac lipid peroxidation

Malondialdehyde (MDA), merupakan bentuk dari produk akhir spectrophotometer,

seperti yang telah dijelakan sebelumnya (Ohkawa et al.,1979). Kadar MDA ditunjukan

dengan nmoles/mg protein.

Assay of endogenous antioxidants

Glutathione (GSH) diukur dari jaringan jantung homogen menggunakan metode

Ellmen's reagent (DTNB) (Elman, 1999). Keterserapan dibaca pada 412 nm dan hasilnya

ditunjukan sebagai μmol of GSH/gm dari jaringan basah. Pemeriksaan Glutathione

peroxidase (GPx) pertamakali dikenalkan oleh Rotruck et al. (1973) dalam 10% (w/v)

jaringan jantung yang telah dihomogenisasi dan kemudian diperiksa menggunakan

spectrophotometer pada 420 nm. Aktivitas Superoxide dismutase (SOD) diperiksa dari

jaringan jantung (Lowry et al., 1951) yang telah dihomogenisasi dan kemudian diperiksa

menggunakan spectrophotometer pada 320 nm. Satu unit aktivitas SOD didefinisikan sebagai

konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk menghambat rerata dari adrenalin auto-oksidasi

sebanyak 50% dalam 1 menit pada pH 10. Jumlah total protein dinilai dari jaringan jantung

hewan coba yang dihomogenisasi (10% w/v) (Lowry et al., 1951).

Pemeriksaan menggunakan mikroskop cahaya

Segera setelah proses euthanasia, spesimen jantung difikasasi dalam larutan 10%

buffered formalin, dilekatkan pada paraffin, disiapkan dalam bentuk potongan setebal 4 μm

dan diwarnai hematoxylin eosin (HE) (Bancroft et al., 1996). Potongan yang telah diwarnai

diperiksa menggunakan mikroskop cahaya (Olympus CX31, Japan) dan diphoto

menggunakan kamera digital (Olympus, Camedia C-5060, Japan). Lesi histopatologi yang

paling signifikan dan kemunculan/ketidak munculan lesi dicatat.

Immunohistochemistry (IHC)

Potongan jaringan setebal 5 mm diletakan pada slide dengan muatan positif.

Singkatnya, potongan dide-paraffinisasi dan aktivitas endogenous peroxidase diblok dengan

3% hydrogen peroxide (H2O2) dalam PBS selama 30 min. Antigen retrieval dilakukan

dengan cara potongan melewati proses microwaving dalam 0.01 M sodium citrate buffer (pH

6.0). kemudian slides dibilas dalam PBS, diblok dengan normal goat serum kemudian

diinkubasi secara respectif dengan antibodies COX2 primer (diluted 1:200 in PBS, Thermo

Fisher Scientific, USA) selama satu malam dalam suhu 4°C.

Statistical analysis

Data disajikan sebagai rerata ± simpang baku (SD) untuk seluruh para meter. Data

yang ada dianalisis menggunakan GraphPad Prism data analysis program (GraphPad

Software, Inc., San Diego, CA, USA). Student Newman-Keuls paired t-test digunakan untuk

membandingkan secara statistik kebermaknaan perbedaan diantara 2 kelompok yang berbeda.

Tes one-way-analysis of variance (ANOVA) digunakan untuk menguji perbandingan lebih

dari 2 kelompok dan diikuti dengan least significant difference (LST). Korelasi dinilai

menggunakan Spearman’s non-parametric correlation coefficient sebagaimana dijelaskan

oleh Knapp and Miller (1992). Nilai P ≤ 0.05 digunakan sebagai acuan kebermaksaan

statistik.

HASIL

Tidak didapatkan kematian dari kelompok manapun baik dari kelompok yang

diinduksi oleh Pb maupun dua kelompok lainnya selama periode tindakan selama 8 minggu

Berat badan, jantung, dan rasio berat badan/jantung

Table 1 menunjukan penurunan berat badan yang signifikan dari kelompok Pb jika

dibandingkan kelompok kontrol (p < 0.01). Bagaimanapun, kelompok 3 (Pb+NSO)

menunjukan penghambatan proses penurunan berat badan jika dibandingkan kelompok Pb (p

< 0.01). Tidak ditemukan perbedaan berat badan antara kelompok Pb + NSO dan kelompok

kontrol. Berat jantung dari kelompok Pb lebih berat signifikan dibandingkan dengan dua

kelompok lain (p < 0.05). pemberian NSO selama 8 minggu menurunkan berat jantung secara

signifikan dibuktikan dengan tidak ada perbedaan signifikan berat jantung antara kelompok

yang diberikan NSO dan kelompok kontrol. Rasio berat badan/berat jantung secara signifikan

meningkat jika dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok Pb + NSO (p > 0.01).

Bagaimanapun, rasio ini menurun secara signifikan setelah pemberian NSO, namun tetap

lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok kontrol (p > 0.05).

Kadar Pb dalam Jaringan Jantung

Pada penelitian ini, kadar Pb pada jaringan jantung dari kelompok dengan pemberian Pb lebih

tinggi secara signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol (p < 0.001).

Bagaimanapun, kadar Pb dalam jaringan jantung pada kelompok dengan pemberian NSO

turun secara signifikan jika dibandingkan kelompok Pb (p < 0.001) dan (p < 0.05) kelompok

kontrol (gambar 1).

The effect of N. sativa oil on changes of heart rate and electrocardiogram patterns

induced by lead acetate

Nilai rerata dari denyut jantung kelompok Pb menigkat secara signifikan ketimbang kedua

kelompok lain kelompok kontrol (p < 0.01) dan kontrol Pb + NSO (p < 0.01). Pemberian

NSO pada tikus yang diberi Pb mencegah penigkatan denyut jantung dibuktikan dengan tidak

ada berbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok Pb+NSO.

EKG dari hewan coba normal dan eksperimental ditunjukan pada Tabel 2. Tikus yang

diinduksi timbal asetat menunjukan peningkatan secara signifikan (p < 0.01) pada ST-

segment dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kelompok yang diberikan NSO memiliki

denyut jantung yang lebih rendah secara signifikan namun masih lebih tinggi jika

dibandingka kelompok kontrol (p < 0.05). tidak ada perbedaan pada kompleks QRS dari

ketiga kelompok percobaan.

The effect of N. sativa oil on the pro-inflammatory cytokines of cardiac tissues

Nilai dari apelin lebih rendah secara signifikan (p < 0.01) disaat yang sama kadar HS-CRP,

E-selectin dan IL-6 lebih besar signifikan (p < 0.001) pada kelompok Pb dibanding kelompok

Kontrols. Lebih jauh lagi, data ini menunjukan penurunan kadar dari E-selectin, HS-CRP dan

IL-6 (p < 0.01, p < 0.05, p < 0.05, respectively) pada kelompok NSO, dan kadar apelin yang

meningkat secara signifikan (p < 0.05) namun tetap berbeda dari kadar pada kelomok kontrol

(p < 0.05) (Table 3).

The effects of N. sativa oil on cardiac tissue damage markers

Gambar 1 menunjukan adanya peningkatan pada biomarker kerusakan jantung

(Troponin I, CK-MB) pada kelompok Pb secara signifikan jjika dibandingkan kedua

kelompok kontrol dan NSO. (p < 0.001 dan p < 0.01). pemberian NSO signifikan

menurunkan kadar biomarker kerusakan (p < 0.01). Namun kadar ini masih lebih tinggi jika

dibandingkan dengan kelompok kontrol (p < 0.01).

The effects of N. sativa oil on cardiac lipid peroxidation and endogenous antioxidants

Table 4 menunjukan kadar lipid peroxidation as measured by the levels of MDA pada

kelompok Pb (p < 0.001) dan menurun signifikan pada kelompok kontrol (p < 0.001).

pemberian NSO signifikan menghambat peningkatan kadar MDA (p < 0.01) dan

menyebabkan peningkatan signifikan kadar antioksidan endogen (p < 0.01). Namun kadar ini

masih lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok kontrol (p < 0.05).

Histopathological results

Pemeriksaan histopathological dari pewarnaan HE mnunjukan bahwa lesi yang paling

signifikan ditemukan pada tikus yang diinduksi leh Pb. Di sisi lain, pemberian NSO

menunjukan adanya perbaikan dari lesi yang tadi ditemukan (Table 5). Lesi pada jaringan

jantung akibat Pb antara lain hemorrhage, myocardial necrosis, mononuclear cell infiltration

and fibrosis.

Immunohistochemistry results

Hasil immunohistochemical dari Cox-2 pda jantung menunjukan ekspresi Cox-2

positif pada kelopmpok Pb, ekspresi Cox-2 yang lemah dari kelompok Pb + NSO dan negatif

pada kelompok kontrol (gambar 3).

DISCUSSION

Penelitian ini dilakukan untuk mengamati efek kardio protektif dari N. sativa oil

(NSO) pada kerusakan ajntung yang diinduksi oleh timba (Pb). Penurunan dari berat badan

pada kelompok Pb hampir sama dengan apa yang ditemukan pada penelitian lain seperti yang

dilakukan Haque (2005) yang melaporkan penurunan berat setelah intoksikasi oleh timbal

asetat. Seddik et al. (2010) menemukan bahwa intake Pb menurunkan kecepatan

pertumbuhan tikus yang mungkin disebabkan oleh ketidak seimbangan metabolisme yang

dipicu oleh penurunan kadar zink yang mana dibutuhkan oleh banyak proses metabolisme.

Pada penelitian ini, peningkatan rasio berat jantung dan berat badan yang terdeteksi

diperkirakan karena nekrosis yang terjadi akibat penumpukan lipid (Badalzadeh et al., 2008).

Hal ini selaras dengan temuan patologi kami yang menunjukan bahwa pemberian Pb

menyebabkan nekrosis otot jantung, infiltrasi monosit dan perdarahan intersisial pada

kelompok Pb. Penelitian kami menunjukan kadar Pb yang sangat tinggi dalam jaringan

jantung kelompok Pb dan ini sesuai dengan penelitian Patra et al. (2011). Kadar Pb yang

tinggi dalam jaringan menyebabkan terjadinya kerusakan akibat stress oksidatif. Pemberian

NSO sebelum pemberian Pb menurunkan kadar Pb secara signifikan. Hal ini dapat

mengindikasikan bahwa NSO dapat membuang Pb dari organ dengan cara mencegah

penimbunan atau meningkatkan pembersihan logam berat dari organ dengan mekanisme yang

belum diketahui secara jelas.

Penelitian ini menunjukan bahwa Pb dapat menyebabkan peningkatan denyut jantung

tanpa mempengaruhi durasi dari QRS. Hasil ini sesuai dengan yang ditemukan oleh

Badalzahed et al. (2008). Peningkatan denyut jantung mungkin diakibatkan oleh

hiperaktifitas dari pusat saraf simpatis, menurunkan sensitifitas baroreflek dan hipotonus

vagal (Carmignani et al., 2000). Di sisi lain pemberian NSO menurunkan HR dan

menurunkan ST segment secara signifikan. Hal ini mengindikasikan bahwa NSO memiliki

efek mengurangi HR yang mungkin muncul akibat aktivasi mekanisme cholinergic (El-Tahir

et al.,1993; Hamed et al., 2010).

Pada penelitian ini, Pb meningkatkan cardiac HS-CRP, IL-6 ,E-selectin, troponin I

dan serum CK-Mb serta secara signifikan menurunkan kadar apelin. Beberapa teori untuk

menjelaskan efek ini antara lain: inhibisi dari Ca-pump atau transport protein, gangguan pada

mineral, inaktivasi dari beberapa enzym (Patrick, 2006). Pathogenesis dari keracunan Pb

adalah mekanisme stress oksidatif (Yazdanshenas et al., 2012).

Timbal dapat memicu kerusakan secara oksidatif pada otak, jantung, ginjal, dan organ

reproduktif (Daniel et al., 2004; Gholamhosseini et al., 2009; Wang et al., 2012) dan hasil

dari penelitian ini mendukung hipotesis tersebut, dibuktikan dengan adanya peningkatan

secara signifikan dari kadar MDA dan penurunan secara signifikan dari antiksidan endogen

dalam jaringan jantung.

The present results support the antioxidant activity of NSO. When it was

administered, NSO effectively lowered the levels of MDA and caused a significant increase

of the endogenous antioxidants in the cardiac tissue. Our pathological findings confirmed the

biochemical data of the present study and showed that lead acetate intake caused cardiac

damage in the form of myocardial necrosis, interstitial hemorrhage, mononuclear cell infil-

tration and fibrosis. Lead acetate increased the cardiac tissues COX -2 expression. However,

administration of NSO reduced the cardiac histo pathologic lesions, pre-served its structure

and decreased the COX-2 expression in Pb + NSO group.

Conclusion

Data dari penelitian ini menunjukan bahwa suplementasi NSO dapat menurunkan keruusakan

jantung akibat Pb karena kemampuan NSO ini dalam mengurangi sitokin pro inflamasi,

oxidative stress dan kerusakan jaringan jantung dan menjaga aktivitas enzim-enzim

antioksidan. N. sativa dapat disajikan sebagai makanan sehari-hari dan dapat memberi efek

positif terhadap kesehatan dengan cara mengurangi resiko penyakit kardiovaskular.