Sitotoksik , pro - apoptosis , pro - oksidan , dan kegiatan non - genotoksik ofa tembaga baru ( II ) kompleks terhadap kanker serviks manusia

Susana E. Frias memangku Gonzáleza , Enrique Angeles Anguianob , Alberto Mendoza Herrerac , Daniel Escutia Calzadaa , Cynthia Ordaz Pichardoa , * aLaboratorio de Biología Celular y Productos Naturales , Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía - IPN , Guillermo Massieu Helguera 239 , Fracc . LaEscalera , Ticoman , D.F. 07.320 , MexicobLaboratorio de Química Obat , Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán - UNAM , Av . 1ode Mayo s / n , Kolonel Sta . María Las Torres , Cuautitlán Izcalli , Estado de México 54.740 , MexicocLaboratorio de Interacción Planta - Microorganismo , Centro de Biotecnología Genómica - IPN , Blvd . del Maestro s / n Esq . Elías Pi ~ na , Reynosa , Tamaulipas88710 , Meksiko

sejarah Artikel : Diterima 19 April 2013 diterima dalam bentuk revisi 8 Agustus 2013 diterima 28 Agustus 2013 tersedia secara online 5 September 2013

Kata kunci : Tembaga ( II ) sel-sel kanker serviks yang kompleks Sitotoksisitas Genotoksisitas Apoptosisa

abstrak :Cisplatin tetap menjadi salah satu agen kemoterapi yang paling efektif saat ini ; Namun , complexessynthesis logam telah meningkat dalam rangka untuk memproduksi obat anti - neoplastik baru dengan DNA mengikat dan apoptoticactivities dalam sel tumor dan toksisitas kurang untuk pasien . Dalam studi ini , kami mengevaluasi sitotoksik activ - ity dari tembaga baru ( II ) kompleks ( LQM402 ) terhadap jalur sel kanker serviks dan menemukan bahwa LQM402exhibited sitotoksisitas selektif terhadap HeLa dan Ca Ski sel . Assay FITC - annexin dan DNA fragmenta - tion menunjukkan bahwa apoptosis dapat terlibat dalam kematian sel HeLa . Caspase 3/7 dan sitokrom c Hasil analisis menggunakan imunoblotting menunjukkan jalur intrinsik . LQM402 adalah induktor peroksidasi lipid Menurut produksi toTBARS . Selain itu , tes Ames dan mikronukleus menunjukkan non - genotoksik activityfor senyawa ini dalam Salmonella typhimurium dan tikus CD1 , masing-masing. Oleh karena itu , LQM402 mungkin apromising dan aman senyawa anti-kanker serviks .

Kanker serviks Pendahuluan ( CECA ) adalah keganasan umum di sekitar theworld . Penyakit ini merupakan masalah kesehatan masyarakat di Latin Amer - ica , dimana hal itu menyebabkan sekitar 32.000 kematian pada wanita pertahun ( Almonte et al . , 2010). Karena saat ini digunakan anti - tumordrugs menimbulkan efek samping beracun dan resistensi , perlu toresearch dan mensintesis baru , produk yang efektif untuk treatmentof tumor canggih yang menyebabkan efek negatif yang lebih sedikit ( Zou et al . , 2005). Sejak penemuan standar cisplatin obat anti -proliferasi , derivatif seperti carboplatin , oxaliplatin , dan kompleks othermetal telah disintesis dan diuji untuk kegiatan anti tumor in vitro ( Chitambar dan Purpi , 2010; Laine dan Passirani , 2012) dan in vivo ( Chen et al , 2007; . . Milacic et al , 2006) . Partisipasi tembaga dalam reaksi transfer elektron dari banyak proses seluler dan fungsinya sebagai komponen metallopro - teinases dan enzim telah dipertimbangkan selama pengembangan obat kemoterapi ( Marzano et al , 2009; . Wang dan Guo , 2006; Ruiz - Azuara dan Bravo - Gomez , 2010). Tembaga , seperti jejak logam lain , adalah penting untuk protein thatare terlibat dalam beberapa proses biologis , termasuk respirasi , metabolisme , sintesis

DNA , dan reaksi oksidasi-reduksi ( Marzano et al . , 2009). Defisiensi tembaga atau ketidakseimbangan adalah asosiasi- diasosiasikan dengan gangguan neurologis yang parah , termasuk Alzheimer , Parkinson ( Donnelly et al . , 2008) , Wilson , dan penyakit Menkes ' ( Wang dan Guo , 2006) . Karakteristik kimia transitionmetals memberikan kesempatan untuk mengembangkan obat anti - kanker yang berbasis logam baru dengan mekanisme yang berbeda dari tindakan; dengan demikian , complexesthat mengandung tembaga atau logam lainnya mewakili baru agen antitumor alternatif generationof ( Ruiz - Azuara dan Bravo - Gomez , 2010). Casiopeínas ® adalah kompleks tembaga yang designedon dasar dari kegiatan antitumor dari cisplatin dan otherseries senyawa logam . Senyawa ini ditemukan beseveral kali lebih sitotoksik daripada cisplatin terhadap beberapa baris sel kanker servikal ( Gracia - Mora et al . , 2001) . Berbagai coppercomplexes juga sitotoksik terhadap jenis sel bisa- cer manusia . A terner tembaga ( II ) kompleks amino - kumarin dengan phenanthroline menghambat pertumbuhan sel prostat manusia PC3 bisa- cer dan HL - 60 sel kanker leukemia myeloid manusia ( Jiaet al . , 2010). Benzene - 1 ,2 - dithiol - dimodifikasi , berbasis cisplatin polisi - per ( II ) dan seng ( II ) kompleks juga terbukti sitotoksik . terhadap lini sel kanker manusia , termasuk HeLa ( kanker servikal manusia ) , Hep2 (kanker epitel laring manusia ) , HepG2 ( kanker hati manusia ) , dan MCF - 7 ( sel kanker payudara manusia ) ( Raman et al . , 2010). Pengobatan with10 - Deacetyl Baccatin thiosemi - carbazone saja hanya menangkap pertumbuhan sel MCF - 7 kanker payudara yang layak , sedangkan penambahan tembaga untuk senyawa yang sama diinduksi mematikan sel terkenal ( Murugkar et al . , 1999) . Dalam recentyears , laporan kompleks tembaga sitotoksik telah menunjukkan bahwa themechanism tindakan didasarkan pada interkalasi DNA dan cleavageactivity ( Krishnamoorthy et al , 2011; . . Lakshmipraba et al , 2011) atau kegiatan induksi apoptosis ( Boulsourani et al , 2011; . Tarditoet al . , 2009). Dalam tulisan ini , kami mengevaluasi in vitro sitotoksik abili - ikatan tembaga ( II ) LQM402 kompleks terhadap empat baris sel cervicalcancer manusia , yang HeLa dan Ca Ski sel adalah yang paling yang sensitif . Tangga DNA dan TUNEL tes menunjukkan fragmentasi thatLQM402 pembelahan DNA diinduksi dalam sel HeLa dalam waktu - dependentmanner . Kami berhipotesis bahwa efek sitotoksik terkait tothe aktivitas pro - apoptosis LQM402 , seperti yang terdeteksi oleh annexin - FITCstaining dan ekspresi berkurang dari pro - caspases 3 dan 7 , juga sebagai kehadiran sitokrom c dalam ekstrak sitosol . Lebih - lebih , LQM402 tidak menginduksi mutasi pada Salmonella typhimuriumand CD1 tikus .

kimia

Kompleks 4 - acetate { 4 - hydroxi - 3 ,5 -bis ( morpholinomethyl ) } tetra tembaga ( II ) ( LQM402 . ; Gambar 1 ) ( 4 - Oxo ? ) Tetra - ? Disiapkan inethanol dengan 1.602 g ligan 2 ,6 - Bis ( morpholinomethyl ) fenol ( Velazquezet al . , 2008) , 1,081 g Cu ( II ) asetat dan 0,1 ml NH4OH . Solusinya adalah stirredfor 18 jam pada suhu kamar . Pelarut dibuang dan endapan wascollected dan mengkristal (hasil : 86 % ) . Kristal hijau yang dihasilkan ditampilkan karakteristik thefollowing : rumus , C44H72Cu4O14N4 ; berat molekul , 1132 g / mol , dan titik leleh , 198-200 ◦ C ( data tidak dipublikasikan , dalam pengolahan paten ) .

Budaya garis sel

Empat karsinoma serviks manusia ( CECA ) baris sel , HeLa , Siha , Ca Ski , dan C - 33 A , dan fibroblast manusia non - tumoral primer ( FB ) yang digunakan . Sel HeLa kindlydonated oleh Teresa Ramírez - Apan , M.Sc. dari Instituto de Química di Universidad Nacional Autonoma de México ( UNAM ) . Siha , Ca Ski , dan C - 33 baris sel yang ramah disumbangkan oleh Juan Carlos Gomora , Ph.D. dari Instituto de Fisiología di UNAM.The sel dipertahankan dalam modifikasi media Eagle Dulbecco yang disuplementasi dengan 10 % serum janin sapi ( HyClone , Thermo Scientific , Logan , UT , USA ) dan 1 % antibiotik antimycotic solusi ( Gibco , Carlsbad , CA , USA ) dalam labu kultur pada 37 ◦ C ina 5 % CO2 inkubator dilembabkan . Sel Semi - konfluen ( 70-80 % ) telah dihapus with0.1with0.1 % tripsin ( Sigma - Aldrich , St Louis , MO , USA ) , dicuci dua kali dengan larutan garam fosfat-buffer ( PBS ) yang mengandung 0,2 g KCl , 0,2 g KH2PO4 , 8 g NaCl , and2.16 g Na2HPO4 · 7H2O per liter , pH 7,4 , disentrifugasi , dan diresuspensi dalam media . September - arately , 5 × 103FB , HeLa , atau Siha sel dan 8 × 103Ca Ski atau C - 33 A sel per wellwere disimpan ke dalam 96 -well microplates . Sel diinkubasi semalam sebelum perawatan tambahan .

Pengobatan sel dan MTT assay

Sitotoksisitas ditentukan dengan MTT assay standar sebagai describedby Mosmann ( 1983) . Uji ini didasarkan pada pengurangan MTT kuning ( 3 - ( 4,5- dimethythiazol - 2 - il) -2,5 - diphenyltetrazolium bromide ) untuk formazan bymitochondrial suksinat dehidrogenase dalam sel hidup . Kristal forma - zan ungu yang dihasilkan dilarutkan dalam DMSO dan kemudian absorbansi yang measuredand terkait dengan nilai absorbansi formazan yang diproduksi oleh sel-sel yang tidak diobati . Nilai Theabsorbance dari formazan berbanding lurus dengan jumlah viablecells ( Cory et al . , 1991) . Secara singkat , sel-sel CECA yang telah unggulan ke - 96 wellmicroplates dirawat selama 24 jam dengan konsentrasi yang berbeda LQM402 com - pound ( 12,5-100 ? M ) . Cisplatin ( Sigma - Aldrich , St Louis , MO , USA ) pada sameconcentrations digunakan sebagai kontrol positif , dan media ditambah 1 % DMSO adalah usedas kontrol negatif . Selain itu , sel-sel HeLa diobati selama 48 dan 72 jam . Aftertreatment , media itu disedot dari sumur dan diganti dengan media yang memuat MTT ( 1 mg / ml ) , dan sel-sel diinkubasi untuk tambahan 4 jam pada 37 ◦ C.After inkubasi dan penghapusan media MTT , yang kristal formazan yang dis - diselesaikan dengan DMSO dan piring yang dibaca pembaca lempeng ( ELx808 , Bio - Tek , Winooski , VT , USA ) pada 570 nm. Semua perawatan dilakukan setidaknya tiga rangkap tiga timesin . Nilai rata-rata yang diperoleh dan digunakan untuk menghitung persen viabil - ity dengan rumus : % viabilitas = ( berarti OD sel diperlakukan × 100 ) / nilai mean konsentrasi ODcontrol cells.The yang menyebabkan penghambatan pertumbuhan sel 50 % ( IC50 ) werecalculated dari hubungan dosis - efek setiap baris sel dengan non - linear regresi dengan Prism 5.0 software ( GraphPad , La Jolla , CA , USA )

Deteksi phosphatidylserine dengan sitometri assay

Aktivitas apoptosis LQM402 dinilai dengan FITC-label annexin Vbinding dan serapan PI dengan Annexin-V FITC kit (Biovision, Milpitas, CA, USA). Menurut instruksi dari pabriknya, 5 × sel

104HeLa yang diunggulkan inDMEM Media dengan 10% FBS dan diizinkan untuk mematuhi selama 24 jam. Pada hari berikutnya, themedia digantikan dengan media yang berisi LQM402 at 74.74? M dan cellswere diinkubasi untuk tambahan 6, 12, atau 24 jam. Setelah pengobatan, sel-sel wereharvested, dicuci dua kali dengan PBS, disuspensi dalam 500? Penyangga l mengikat ditambah 5? Lannexin V-FITC dan 5? L PI (disediakan dalam kit). Tabung lembut diaduk, disimpan dalam gelap pada es selama 10 menit, dan dianalisis pada aliran FACScan cytometer (BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) (Vermes et al., 1995).

Kematian sel deteksi oleh TUNEL assay

The HeLa diprogram kematian sel dideteksi dengan menggunakan In Situ Cell Kematian deteksi kit, AP versi 11.0 dari Roche sesuai dengan petunjuk produsen withminimal modifikasi. Secara singkat, sel-sel HeLa yang diunggulkan di coverslips dalam 6 wellplates dan diperlakukan dengan 74.74? M LQM402 selama 24, 48, dan 72 jam. 1% DMSO dan 20? Sel Mcisplatin-diobati (48 jam) adalah kendaraan dan kontrol positif, masing-masing. Aftertreatments, sel dicuci dua kali dengan PBS dan tetap dengan 4% paraformaldehydein PBS pH7.4 dan permeabilized dengan 0,1% Triton X-100 dalam 0,1% sodium sitrat selama 20 menit pada 2-8 ◦ C. Setelah permeabilization, sel dicuci dua kali dengan PBS dan cov ditutup dengan 50? L campuran reaksi TUNEL dan diinkubasi pada suhu 37 ◦ C selama 60 menit di atmosfer ahumidified dalam gelap. Akhirnya, coverslips dengan sel dibilas dengan PBS threetimes dan ditempatkan pada slide menggunakan Vectashield ® Mounting Media forfluorescence (Vector Labs) untuk observasi mereka di bawah mikroskop fluoresensi inthe kisaran 515-565 nm (lampu hijau).

Assay Tangga

(Deteksi fragmentasi DNA) isolasi DNA dari sel HeLa diobati dengan 74.74? M untuk 24, 48, dan 72 jam wasperformed menggunakan metode DMSO-SDS-TE baru sesuai dengan Suman et al., 2012.Floating dan sel-sel yang melekat seeded dan diperlakukan 100 mm cawan petri yang col-lected dan dicuci dengan PBS. 100? L DMSO ditambahkan langsung ke sel pelletand dicampur dengan baik diikuti oleh vortexing. 100? L dari SDS (2% sodium dodesil sulfat)-TE (Tris-EDTA) (pH 7,4) ditambahkan diikuti dengan mencampur dan vortexing. Theresulting solusi disentrifugasi pada 13.000 rpm pada 4 ◦ C dan supernatan col-lected dalam tabung baru. 25? L dari supernatan untuk setiap perlakuan dimuat pada 1,5% agarose gel dan berjalan selama 60 menit pada 100 V. 1% DMSO dan 20? M cisplatin-treatedcells (48 jam) yang kontrol negatif dan positif, masing-masing.

Analisis Western blotting

Tingkat ekspresi caspases 3, 7, dan 9 dan sitokrom c yang immunoassays determinedby. Pengendalian dan 74.74? M LQM402-diperlakukan sel HeLa dari berbeda-ent titik waktu (3, 6, 12, 18, dan 24 jam) dicuci dua kali dengan PBS dan jumlah atau sitoplasma ekstrak diperoleh

dengan RIPA penyangga (0,5 M Tris-HCl , 1,5 M NaCl, 2,5% asam deoxycholic, 10% NP-40, 10 mM EDTA) atau digitonin, masing-masing (semua fromSigma-Aldrich) pada pH 7,4, di hadapan Lengkap Protease Inhibitor CocktailTablet (Roche Diagnostics, Mannheim, Jerman ). Semua reaksi lisis yang performedon penangas es. Jumlah konsentrasi protein ditentukan menurut metode Brad-ford (BioRad, Hercules, CA, USA). Jumlah yang sama protein dari masing-masing lisat (30? G) dimuat dan berjalan pada 12% SDS-poliakrilamida gel. Protein werethen ditransfer ke membran nitroselulosa yang diblokir dengan 5% non-fatmilk di 0,1% Tween 20-Tris buffer saline pada pH 7,5. Setelah mencuci, hybridiza-tion dilakukan semalam dengan antibodi primer terhadap caspases 3, 7, and9 dan sitokrom c (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) pada 4 ◦ C.Horseradish peroksidase-conjugated antibodi sekunder IgG juga digunakan (SantaCruz Bioteknologi), diikuti oleh deteksi dengan chemiluminescencekit ditingkatkan (Pierce, Rockford, IL, USA) dan pengembang autoradiografi Film (Kodak, Rochester, NY, USA). Anti-?-Aktin (1:500) digunakan untuk memastikan pemuatan sama protein pada thegel (Montes-Sanchez et al., 2009).

Uji Ames

Tes Mutagenisitas adalah tes biologi yang digunakan untuk menilai mutagenik potensi terjadinya senyawa kimia (Hong et al., 2011). Kami melakukan tes Ames onthe berikut set histidin auksotrofik S. typhimurium strain: TA100 (hisG46, rfauvrB pKm101), yang dapat mendeteksi mutasi substitusi pasangan basa; TA98 (hisD3502, rfa UvrB pKm101), yang dapat mendeteksi mutasi frameshift; dan TA102 (hisG428, rfa, pQ1, pKm101), yang dapat mendeteksi kerusakan DNA ROS-diinduksi reaktif. The mutasi genicity dari LQM402 dievaluasi dalam tiga strain, dengan atau tanpa Arochlor1254 diinduksi tikus homogenat hati (S9 campuran), dengan metode penggabungan asdescribed oleh Maron dan Ames (1983). Tiga konsentrasi LQM402 (50, 100, dan 200? M / plate) yang digunakan dalam tidaknya 500? L dari S9 mix-mendatang. LQM402 dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi yang ditunjukkan dan mixedwith 100? L kultur bakteri (1-2 × 109CFU/ml) dalam 2 ml agar cair yang ditambahkan ke wassubsequently agar minimal piring Vogel Bonner dengan 0,5 mM histi-dine/biotin. Pelat diinkubasi selama 48 jam pada 37 ◦ C dan histidin (+-Nya) koloni reversi dibentuk dihitung dengan Fisher koloni-counter. Untuk hasil tes Ames yang positif, bahan kimia yang diuji harus mendorong dua kali lebih banyak + revertantsas Nya diperoleh dengan pengembalian spontan (Ames et al, 1975;.. Szyba et al, 1992). Kontrol yang positif yang digunakan dalam pengujian ini adalah picrolonic acid (PA) di 50? g / piring, N-metil-N?-nitro-N-nitrosoguanidin (NMNG) pada 10? g / piring, mitomycin C (Mit C) AT10 ng / piring, 2-Aminoanthracene (2AA) pada 10? g / piring, dan cyclophosphamide (CP) pada 500? g / piring.

Dalam uji mikronukleus vivo

Tes mikronukleus mendeteksi kromosom rusak yang tidak ditarik ke theappropriate tiang penggulung karena hilang sentromer kromosom dan fragmen-fragmen yang tidak dimasukkan ke dalam inti sel anak pada mitosis (Schmid, 1975). Untuk tes ini, kami menggunakan CD1 tikus

jantan (25-30 g) yang diperoleh dari Rismart, Meksiko. Mencit dipelihara sesuai dengan kantor Meksiko peraturan forthe produksi, perawatan, dan penggunaan hewan laboratorium (NOM-062-ZOO-1999) dan theprotocol disetujui oleh Komite Etika dari Sekolah Nasional Kedokteran andHomeopathy Meksiko (Pendaftaran No ENMH -CB-010-2011). Tikus-tikus tersebut keptin ruang hewan pada 25 ± 2 ◦ C, 50 ± 5% kelembaban, dan di bawah 12 jam: 12 jam cahaya darkcycle. Tikus diberi diet standar (Purina, Cuautitlan, Meksiko) dan adlibitum air. Kelompok perlakuan terdiri dari lima tikus yang masing-masing mengalami injeksi oneintraperitoneal. Tikus pada kelompok kontrol (kendaraan) menerima air steril, tikus pada kelompok kontrol positif menerima 60 mg / kg Mit C, dan tikus dalam kelompok mengobati-pemerintah menerima 5, 10, atau 15 mg / kg LQM402 dilarutkan dalam air steril. Thesame dosis LQM402 juga diberikan kepada tikus yang telah menerima 60 mg / kgMit C 30 menit sebelumnya dengan tujuan menentukan potentialof LQM402 anti-mutagenik. Noda darah perifer dari ekor tikus diperoleh sebelum thetreatments dan pada 24, 48, dan 72 jam setelah perawatan. Para smear diwarnai dengan larutan Giemsa (Sigma-Aldrich) dalam larutan dapar fosfat (0,6 M, pH 6,8). Toestimate jumlah eritrosit polikromatik micronucleated (MNPCE), 1000 eritrosit polikromatik (PCE) diberi skor per smear (Diaz Barriga et al., 1999) dan rasio PCE diperkirakan dari tahun 2000 eritrosit. Nilai-nilai yang diperoleh fromLQM402 atau Mit C hewan yang dirawat dibandingkan dengan yang diperoleh dari controlanimals.

Lipid peroksidasi inductionEvaluation pembentukan spesies reaktif sering digunakan untuk mengukur aktivitas theantioxidant atau pro-oksidan dalam beberapa jenis sampel. Karena malon-dialdehyde dan senyawa sejenis yang dihasilkan oleh reaksi peroksidasi lipid asam withthiobarbituric, tes ini bernama asam spesies reaktif thiobarbituric (TBARS) (Cathcart et al., 1991). Untuk pengujian ini, kami menggunakan tikus Wistar jantan dewasa (200 ± 50 g) yang disediakan oleh Institut of Cellular Physiology-UNAM dan dipelihara AT25 ± 2 ◦ C dan 50 ± 5% kelembaban di bawah 12 h: 12 h terang-gelap siklus. Tikus-tikus yang fedwith diet dan air baku ad libitum. Untuk persiapan homogenat otak tikus, hewan-hewan itu dikorbankan dengan CO2according ke protokol resmi previouslymentioned untuk menghindari rasa sakit yang tidak perlu. Seluruh otak dengan cepat dibedah andhomogenized di PBS untuk menghasilkan 1/10 (b / v) homogenat. Homogenat wassubsequently disentrifugasi selama 10 menit pada 3400 rpm. Kandungan protein di otak solusi super-natant diukur dengan Folin dan Ciocalteu yang fenol reagen dan thesolutions disesuaikan dengan larutan PBS menjadi 2,66 mg / protein ml (Dominguez et al., 2005). Semua percobaan peroksidasi lipid dilakukan dalam penangas es. Secara singkat, 375? Solusi supernatan otak lof dan 50? L dari 20? M EDTA ditambahkan 1,5 ml tubes.Next, 25? L dari LQM402 pengenceran di DMSO ke konsentrasi yang berbeda (1-100? M) atau DMSO hanya untuk kontrol ditambahkan ke tabung. Sampel diinkubasi at37 ◦ C selama 3 jam dengan gemetar konstan. Setelah inkubasi, 500? L larutan TBA (0,5% TBA di 0,05 N NaOH dan 30% asam trikloroasetat pada rasio 1:1) ditambahkan ke eachmixture dan sampel didinginkan pada es selama 10 menit, disentrifugasi pada 10.000 rpmfor 5 min, dan diinkubasi pada 90 ◦ C selama 30 menit. Setelah pendinginan pada suhu kamar, absorbansi sampel diukur pada 540 nm dalam pembaca lempeng (ELx808, Bio-Tek, Winooski, VT). Selain itu, eksperimen kontrol untuk menguji induksi oflipid peroksidasi dilakukan di hadapan tikus homogenat otak

untuk memberikan pemasukan yang membaca basal atau 20 mM 2,2?-Azobis (2-metil-propionamidine) dihidroklorida (AAPH) atau 10? M ferrous sulfate ( FeSO4) untuk memberikan pembacaan kontrol positif; lattercondition diinkubasi selama 1 h.2.11. Aktivitas scavenging assayThe antioksidan LQM402 diukur dengan 2,2-diphenyl-1-pikrilhidrazil metode (DPPH). DPPH adalah stabil radikal bebas yang dapat reducedin keberadaan pemulung radikal bebas, yang di atasnya itu mengkonversi dari warna ungu aslinya kuning (Waffo Teguo et al., 1998). Secara terpisah, tiga konsentrasi ofLQM402 (1, 10, dan 100? M) yang telah dilarutkan dalam etanol dari larutan 20 mM stockDMSO diizinkan untuk bereaksi dengan stabil DPPH radikal bebas (100? M) for30 menit pada suhu kamar dalam gelap . Setiap pengenceran diuji dalam rangkap tiga. Thereaction absorbansi diukur pada 515 nm dengan pembaca lempeng (ELx808, Bio-Tek, Winooski, VT). Persentase aktivitas radikal (% RSA) untuk masing-masing sam-ple dihitung dibandingkan dengan kelompok kontrol DMSO-diperlakukan accordingto persamaan berikut: %RSA =

analisis statistik

Data disajikan sebagai mean ± standard error. Untuk perbandingan treatedgroups terhadap kelompok kontrol, dua arah ANOVA dan Bonferroni pasca-tes wereconducted untuk analisis data ketika berlaku. Signifikansi ditetapkan pada p <0,05, p <0,01, atau p <0.001, tergantung pada percobaan.

Hasil dan diskusi

3.1. LQM402 adalah sitotoksik terhadap sel CECA di mannerThe obat anti-neoplastik tergantung aconcentration yang umumnya digunakan untuk treatCeCa menyebabkan efek samping yang serius dan menghasilkan resistensi, indi-cating kebutuhan untuk alternatif yang aman untuk mengobati ini disease.Cis-diaminedichloroplatinum (II) (Cisplatin ) masih salah satu agen anti-tumor kemoterapi saat mosteffective. Sebagai tanggapan, beberapa kompleks logam telah disintesis dengan intentto menghasilkan senyawa anti-neoplastik baru yang mencakup metalssuch galium, emas, nikel, tembaga, dan seng (Frezza et al, 2010;. Laine dan Passirani, 2012). Di sinilah kita diuji tembaga baru (II) LQM402 kompleks terhadap HeLa, Ca Ski, Siha, dan baris sel kanker C-33 A servikal untuk menentukan data effects.Our anti-tumor potensial pada Gambar. Kegiatan cyto-toxic tergantung konsentrasi 2 acara diferensial dalam baris sel pada 24 jam. Pada konsentrasi tertinggi (? 100 M), viabilitas menurun sebagai fungsi dari lineas sel tumor berikut: Siha (57,75%), C-33 A (51.44%), Ca Ski (36.62%), andHeLa (19,45%); Data ini menunjukkan bahwa sel-sel HeLa adalah mostsensitive ke LQM402. Di semua lini sel, aktivitas sitotoksik wasnot diamati pada konsentrasi LQM402 bawah 25 M; ? Namun, pada konsentrasi mulai dari 50 hingga 100 M, hal ini menyebabkan kerugian dramatis dalam kelangsungan hidup semua lini sel CECA kecuali untuk Siha line.The LQM402 IC50 values secara signifikan lebih rendah untuk HeLa dan sel CaSki (<100 M;? p <0,05) dibandingkan dengan jalur lain sel (> 100 M;? Tabel 1), menunjukkan kemungkinan perbedaan dalam membran permeabilityor metabolisme tembaga (II) kompleks antara baris sel.

PICTURE

The Fig. 2. LQM402 menghambat kelangsungan hidup jalur sel kanker serviks. Garis cancercell serviks HeLa, Siha, Ca Ski, dan C-33 A diobati dengan berbagai concentrationsof LQM402 selama 24 jam dan dianalisis dengan MTT assay. Sel viabilitas CECA menurun secara tergantung aconcentration sementara fibroblas normal (FB) kurang grafik affected.The menunjukkan sarana dan kesalahan standar setidaknya tiga independentexperiments, dilakukan dalam rangkap tiga. * P <0,05 dan p *** <0,001 mewakili significantdifferences dibandingkan dengan kontrol (sel kendaraan-diobati).

aktivitas sitotoksik senyawa kami adalah sesuai dengan reportsdescribing kegiatan sitotoksik kompleks tembaga introducedinto sel HeLa oleh vektor pengiriman nanopartikel (Harris et al., 2011), serta Casiopeínas ® dievaluasi oleh sulforhodamine b assayin baris sel yang sama yang digunakan dalam CECA kami studi (Gracia-Mora et al, 2001;.. Krishnamoorthy et al, 2011, 2012). Lain diuji tembaga com-plexes telah menunjukkan menjadi sitotoksik untuk jalur sel dari differenttypes kanker seperti prostat, hati, dan leukemia myeloid (Jiaet al, 2010;. Lakshmipraba et al, 2011;. Hammud et al, 2008.). Inthis studi, fibroblas digunakan sebagai sel non-ganas kendali manusia dan ditemukan kurang dipengaruhi oleh LQM402 dari tumorcells, menunjukkan keuntungan untuk kompleks ini sebagai obat antikanker selektif potensial. Hasil ini sebanding dengan obtainedin studi lain tembaga makrosiklik (II) kompleks yang wereevaluated pada konsentrasi yang sama (1-100 M?) Dan oleh samemethod di V79 hamster Cina fibroblas paru-paru normal; bahwa tingkat kelangsungan hidup sel studyreported di atas 80% pada 50? M dalam 24 jam inkubasi (Fernandes et al., 2007), sementara kompleks kami diinduksi 95,14% bertahan hidup pada saat yang sama konsentrasi dan waktu inkubasi. Di sisi theother, dibandingkan dengan obat cisplatin antitumor, LQM402was kurang sitotoksik terhadap sel HeLa; Namun, IC50value ofLQM402 untuk fibroblas non-tumoral adalah lebih tinggi dari cis-platin, yang menunjukkan bahwa LQM402 kurang toksik terhadap sel thesenormal (Tabel 1). Karena selektivitas sel LQM402 forHeLa, kami menguji sitotoksisitas kompleks tembaga dalam cellline ini pada 48 dan 72 jam dan dibandingkan dengan pengobatan cisplatin pada thesame kali. IC50values yang diperoleh menunjukkan pada Tabel 2.3.2. LQM402 menginduksi phosphatidylserine residu externalizationon obat antikanker HeLa cellsMost mengerahkan efek mereka dengan induksi apoptosis, yang merupakan mekanisme aksi dianjurkan karena kurangnya

TABEL

Setiap data yang diberikan sebagai mean dan standard error (SE) dari setidaknya tiga independen

eksperimen dalam rangkap tiga. Cisplatin IC50: HeLa 18.9

±

0.99? M, Ca Ski 66,6

±

8.5? M,

Siha 69,92

±

1.25? M, C-33 A 64.98

±

6.88? M, FB 185,23

±

28,6? M.

TABEL 2

respon inflamasi (Mizutani, 2007; Kerr et al, 1994.). Apo-ptosis merupakan mekanisme penting dari kematian sel yang terlibat inmany proses fisiologis yang berkaitan dengan homeostasis dan merupakan centralregulator kondisi patofisiologi. Sel-sel kanker telah beenreported untuk mengembangkan beberapa mekanisme yang dapat digunakan untuk melawan kematian sel-apop Totic, dan ketahanan terhadap apoptosis dianggap kanker hallmarkof (Hanahan dan Weinberg, 2000, 2011; Ocker dan Hopfner, 2012). Untuk menentukan apakah efek penghambatan sel viabilitas LQM402 onHeLa akibat apoptosis, kami mengukur proses apop-Totic oleh annexin V-FITC pewarnaan dan propidium iodida (PI) akumulasi, berdasarkan awal sandal phosphatidylserineresidue apoptosis dari dalam ke permukaan luar sitoplasma membran, dan dianalisis sel pewarnaan oleh aliran cytometry (van Engelandet al, 1998;.. Vermes et al, 1995). Gambar. 3 menunjukkan bahwa concentrationof 74.74? M LQM402 mampu menginduksi tergantung waktu apoptosis pada sel HeLa, dengan frekuensi 10,96% dan 51,44% apoptoticcells pada 6 dan 24 jam, masing-masing, dibandingkan dengan 5,86% pada 24 jam apoptoticcells dalam sel diobati dengan 0,1% DMSO-diperlakukan; ini findingwas konsisten dengan IC50data kami sebelumnya. Pada 12 jam, hampir setengah ofthe LQM402-diperlakukan sel HeLa apoptosis berada di awal apoptosis, dengan sisanya pada akhir apoptosis. Pada 24 jam, 3,77% dari treatedcells diberi label hanya dengan propidium iodida (nekrosis) dan sel-sel restof diwarnai oleh kedua annexin V dan PI (akhir apoptosis), yang menunjukkan bahwa sel-sel telah kehilangan integritas membran (Caiet al, 2002. ). Karena sebagian besar sel diperlakukan berada di awal apo-ptosis, kita dapat mengatakan bahwa LQM402 memiliki potensi yang sama seperti othercopper kompleks untuk menginduksi apoptosis pada sel HeLa pada titik waktu awal. Sebagai contoh, karsinoma ovarium manusia (CH1) dan murineleukemia (L1210) sel

dipamerkan perubahan morfologi khas inthe sitoplasma (penyusutan), kromatin (kondensasi), dan inti (fragmentasi DNA) setelah pengobatan dengan Casiopeína ® II selama 24 jam (De Vizcaya-Ruiz et al., 2000). Sebuah dasar tembaga Schiff (II) juga inducedapoptosis di MCF-7 sel pada konsentrasi 20? M atau kurang dalam 48 hincubation, sebagaimana ditentukan dengan aliran cytometry (Ma et al., 2012), dan sebuah studi dari siklus sel di HCT116 sel menunjukkan bahwa polisi-per bis (thiosemicarbazone) kompleks induksi apoptosis baik andDNA pembelahan dalam sel-sel (Palanimuthu et al., 2013). Ini andmany penelitian lain yang diterbitkan dalam dekade terakhir confirmthat kompleks tembaga potensi sitotoksik compounds.3.3. LQM402 menginduksi fragmentasi DNA di HeLa cellsIt diketahui bahwa kematian sel terprogram atau apoptosis adalah bentuk mostcommon kematian sel dan bahwa proses ini dikaitkan withDNA pembelahan (Kroemer et al., 2009). Oleh karena itu, untuk mengevaluasi apakah thecopper LQM402 kompleks mampu menginduksi pembelahan DNA, kita per-bentuk TUNEL dan tes DNA-tangga dengan HeLacells LQM402-dirawat di IC50value diperoleh dalam sel-sel ini pada 24 jam (74.74? M) selama 24, 48 dan 72 kali jam inkubasi. Dalam uji TUNEL, kami foundDNA label pembelahan dengan cara tergantung waktu (Gambar 4). Theamount sel memperlihatkan belahan DNA yang diinduksi oleh LQM402 at72 h adalah serupa bahwa disebabkan oleh kontrol cisplatin positif, namun, tampaknya bahwa morfologi atau fragmentationpattern DNA diamati pada beberapa sel LQM402-diperlakukan berbeda dari dana sel cisplatin-diobati. The TUNEL Reaksi istimewa labelsDNA istirahat untai yang dihasilkan selama apoptosis; Namun demikian, DNA GAMBAR HAL 159

Gambar. 3. LQM402 mempromosikan apoptosis. Sel HeLa diobati dengan 1% DMSO selama 24 jam atau 74,74? M LQM402 selama 6, 12, dan 24 jam dianalisis dengan aliran cytometry untuk mendeteksi annexinV-FITC pewarnaan. Persentase sel apoptosis meningkat dengan cara yang tergantung-waktu di LQM402-diperlakukan sel sel HeLa bila dibandingkan dengan sel-sel DMSO-diobati. Graphsare wakil dari tiga percobaan independen, masing-masing dengan 10.000 peristiwa dianalisis.

Gambar. 4. LQM402 menginduksi fragmentasi DNA dengan cara yang tergantung waktu. Sel HeLa diobati dengan 74.74? M LQM402 untuk (A) 24, (B) 48, dan (C) 72 h dan DNA strandbreaks diberi label dengan fluorescein oleh TUNEL assay menunjukkan peningkatan tergantung waktu sel dalam apoptosis. (D) 1% DMSO dan (E) 20? M cisplatin selama 48 jam digunakan kontrol asnegative dan positif, masing-masing

Gambar 5. LQM402 perawatan di sel-sel HeLa menginduksi kerusakan DNA. Sel HeLa weretreated dengan 74.74 M LQM402 pada waktu yang berbeda poin dan DNA diperoleh withDMSO-SDS-TE metode. Semua perawatan LQM402 dihasilkan DNA fragmentsof kira-kira 600 bp seperti 20 M cisplatin lakukan di 24 h. Hanya cisplatin treatmentgenerated beberapa ukuran DNA fragments.cleavage dapat tidak lengkap dalam beberapa bentuk bentuk sel kematian atau Mei occurin acak dalam tahap akhir nekrosis (Zong dan Thompson, 2006). Dalam

assay DNA-tangga, kami mengamati degradasi DNA sel-sel inLQM402-diperlakukan sama sekali waktu diuji (aprox. 600 bp) com-dikupas dengan sel-sel kontrol. Cisplatin perawatan di 24 h diinduksi serupa fragmen DNA (600 bp) sebagai pengobatan LQM402, berarti whileapproximately 1000, 600, dan 400 bp fragmen yang generatedat 48 jam (GB. 5). Beberapa komplek tembaga dengan fitur struktural yang berbeda telah ditunjukkan untuk mengikat heliks ganda DNA dan Pro mote double-untai DNA kerusakan, kegiatan ini adalah terutama associatedto kemampuan mereka untuk menginduksi atau untuk menghasilkan radikal (Liu et al., 1999).3.4. BlottingApoptosis Barat dan nekrosis adalah jenis utama dari kematian sel. Setiap ischaracterized oleh fitur morfologi dan biokimia dan skr-kini sedang, genetika berkontribusi secara khusus menetapkan proses-proses tersebut (Kroemer et al., 2009; Ouyang et al., 2012). Namun, ada arealso kurang mekanisme kematian sel belajar seperti anoikis, cornifica-tion, entosis, mitosis bencana, necroptosis, netosis, parthanatos, dan pyroptosis (Galluzzi et al., 2012) yang kurang commonlyobserved.Proses apoptosis tergantung pada aktivasi Yangyang caspases terlibat dalam kedua jalur ekstrinsik dan intrinsik. Untuk mencegah tambang jika LQM402 diinduksi aktivasi caspase, kami memperoleh lysatesfrom HeLa budaya yang diperlakukan dengan kompleks di differenttime poin dan memeriksa ekspresi caspase-3, caspase-7, dan caspase-9. Immunoblotting percobaan menunjukkan thedepletion procaspase-3 dalam sel-sel HeLa diperlakukan dengan 74.74 MLQM402 untuk 18 dan 24 h, dibandingkan dengan kontrol sel (p < 0.01and p < 0.001, masing-masing), dan hasil yang sama setelah treatmentwith 20 M cisplatin untuk 24 h (p < 0.05). Meskipun analisis densitomet-ric tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara thetreatments, procaspase-7 dan procaspase-9 menunjukkan tren ara

tren gambar 6. LQM402 menginduksi perubahan dalam ekspresi protein terkait apoptosis.Sel HeLa diperlakukan dengan 74.74 M LQM402 pada titik waktu yang berbeda dan thelysates dianalisis oleh immunoblotting. Ekspresi dari wasdiminished pro-caspases 3 dan 7 cara tergantung pada waktu. Denganrasio sitokrom c tingkat meningkat inan inkubasi bergantung pada waktu cara. Perwakilan bercak dari exper-iments berulang yang ditampilkan.

menuju berkurang ekspresi, yang disarankan pembentukan ofactive bentuk zymogens ini; Namun, bentuk-bentuk aktif ofthese caspases tidak terdeteksi di tes kami. Cwas sitokrom dideteksi dalam sitoplasma lisat dari withLQM402 sel-sel yang diperlakukan HeLa untuk 6, 12, 18 dan 24 h atau dengan cisplatin untuk 24 h, tetapi notin lisat dari kontrol (diobati) dan 1% diperlakukan DMSO sel (gambar 6). Pada awalnya, data kami menunjukkan bahwa dariucup jalur intrinsik terlibat dalam LQM402-induced apoptosis, tetapi kemungkinan ofother rute atau jenis kematian sel tidak boleh kematian sel diberhentikan becauseother proses telah diamati dalam respon todifferent Cu(II) kompleks. Sebagai contoh, cop-per(II) thioxotriazole kompleks (A0) yang dipelajari oleh Tardito dan co pekerja inducedcell kematian setelah aktivasi caspase-3, tapi sel melakukan displaythe dikenal karakteristik klasik bergantung pada caspase apopto-SIS. Para penulis melaporkan bahwa kematian A0-induced sel terlibat endoplasma stres dan paraptotic kematian (Tardito et al., 2009). Selanjutnya, apoptosis kematian sel dilaporkan

dalam sel-sel glioma C6 yang terkena selama 24 jam untuk konsentrasi [(dimetil 4,4--2,2 bipiridine)(acetylacetonate) Copper(II) nitrat] (CasIII-ia) mulai dari 11.23 22.4 m. Namun, pengobatan with33.7 – 44.9 M findingsthat ultra disebabkan bahwa senyawa menyarankan kematian sel autophagic (Trejo-Solis et al., 2012). Theseresults dibuka pendekatan berbeda mekanisme aksi fornew tembaga atau lainnya berbasis logam senyawa dirancang untuk terapi anti-kanker.Di sisi lain, sementara 74.74 M LQM402 dimin-ished ekspresi procaspase-3 dan procaspase-9at 24 h, 50 M Isatin-diimine copper(II) kompleks bis-[(2-ox-indol-3-yl-imino) - 1,3 - diaminopropane-N, N, O, O] tembaga (II) perklorat ([Cu(isapn)](ClO4)2) and[bis-(2-oxindol-3-yl-imino)-2-(2-aminoethyl)pyridine-N,N] copper(II) perchlorate([Cu(isaepy)2](ClO4)2), juga knownas Cu(isapn) dan Cu(isaepy), disebabkan ekspresi bentuk theactive caspases ini setelah h 24 dan 48 memperlakukan-ment di baris sel neuroblastoma SH-SY5Y (Filomeni et al., 2007). Selain itu, 11.23 – 22.4 M dari Cas III-ia disebabkan mito-chondrial sitokrom c pembebasan, yang ditemukan di dalam sitoplasma (Trejo-Solis et al., 2012). Hasil ini adalah simi-lar untuk temuan kami di sel-sel HeLa diperlakukan-LQM402; Namun, data ini mewakili awal penyelidikan jalan jalan LQM402-induced sel HeLa kematian dan lebih lanjut studi diperlukan.

table 3

LQM402 adalah agen bebas-mutagenik di Ames testBecause potensi obat anti neoplastic harus sel-sel ganas tonon beracun, kami mengukur efek genotoksik LQM402on histidine mutan S. typhimurium strain TA 98, TA100 dan TA 102. Senyawa diuji dengan atau tanpa theaddition aktivator S9 karena banyak agen karsinogenik mustbe diaktifkan (Ames et al., 1973). Tabel 3 menunjukkan jumlah nya + revertants S. typhimurium setelah 48 jam inkubasi dengan kontrol DMSOvehicle atau konsentrasi berbeda LQM402. LQM402 wasnot mutagenik dalam salah satu strain diuji tiga di 50, 100, and200 M bila dibandingkan dengan semua kontrol positif bekerja (PA, NMNG, Mit C, 2AA dan CP) dengan atau tanpa campuran S9, allof yang diinduksi mutasi tarif yang telah higher(3–64) beberapa kali daripada kontrol spontan pengembalian (DMSO; Tabel 2).Hasil kami menunjukkan bahwa dosis ini LQM402 tidak genic muta ke galur diuji oleh tes Ames dan toresults serupa yang diperoleh dalam studi Ames novel copper(II) quinolin satu Schiff kompleks dasar yang sitotoksik terhadap manusia dapat-karsinoma sel (Hep-G2) dan non-mutagenik di S. typhimuriumstrains TA98 dan TA100 (Duff et al., 2012). Lain tembaga complexesevaluated oleh tes Ames itu [Cu (phendione) 3] (ClO4) 2·4H2O and[Cu(phen)2(mal)] ·2H2O, yang juga sitotoksik terhadap Hep-G2and garis sel adenokarsinoma (A-498) ginjal manusia tetapi bebas-mutagenik di S. typhimurium strain TA98 dan TA102 (Deeganet al., 2006, 2007). Hasil ini menunjukkan bahwa beberapa tembaga com-plexes dapat secara efektif membunuh sel-sel kanker tanpa mutagenik activity.3.6. LQM402 tidak menginduksi pembentukan micronucleus di miceperipheral bloodTo menilai aktivitas genotoksik LQM402 di vivomodel di, jumlah micronucleated polychromatic erythrocytes(MNPCE) mencetak dalam eritrosit polychromatic 1000 (PCE), menurut sebelumnya diterbitkan kriteria (Fenech, 2000). Abil-ity dari LQM402 untuk menginduksi MNPCE ditampilkan dalam Fig. 7, dimana itu isobserved yang hanya tikus diobati dengan kontrol positif hadstatistically Mit C signifikan meningkatkan jumlah MNPCE di 48and 72 h sehubungan dengan tikus diobati dengan kendaraan (distilledwater). Biasanya mungkin untuk mengamati efek mutagenik awal dari

micronucleus-merangsang agen di 24 h; ofMN jumlah tertinggi diamati 48 h, dan tingkat menurun di 72 h. Ini wasobserved dengan kami pengendalian positif Mit C, tapi tidak dengan LQM402.Fig. 7 juga menunjukkan efek penghambatan LQM402 di Mit C-inducedMNPCE ketika kompleks tembaga diberikan selain toMit C. Semua kelompok diperlakukan LQM402 telah sama jumlah MNPCEboth

sebelum (0 h) dan setelah pengobatan (24, 48, dan 72 h), dengan meanvalues mulai dari 2 sampai 3,6, dan tidak signifikan wereobserved perbedaan antara kelompok-kelompok atau berkaitan dengan kontrol. Theseresults menyarankan bahwa LQM402 memiliki sifat anti-mutagenik.Dalam tes micronucleus, peningkatan rasio Poli-kromatik eritrosit (PCE) sehubungan dengan normal chromaticerythrocytes (NCE) berarti bahwa aktivitas proliferatif identitas-laranangan dan saksi, mungkin karena fase awal dari penipisan sel (Ecobichon, 1997). LQM402-induced PCE/NCE Ratios dinyatakan inTable 4. Tidak ada konsentrasi dan waktu poin untuk LQM402showed peningkatan PCE/NCE, dibandingkan dengan rasio exhib-ited untuk kelompok kontrol. Di 24 dan 48 jam setelah administrasi ofMit C, rasio untuk PCE NCE adalah sangat berbeda (p < 0.05) dari rasio kontrol pada waktu yang sama dan di h 72, ratiodecreased hampir dengan nilai awal (0 h). Ketika LQM402 at5 mg/kg (C1), 10 mg/kg (C2) dan 15 mg/kg (C3) concentrationswas diberikan 30 menit setelah pemberian 60 mg/kgMit C, itu menghambat peningkatan rasio PCE NCE, efek anti sitotoksik indicatingan LQM402 di concentrationsagainst diuji Mit C-induced toksisitas dalam sel-sel darah mencit. Ada studi arefew genotoxicity kompleks tembaga yang evaluatedby micronuclei assay. Evaluasi micronuclei coppercomplexes CuL (ClO4) 2and CuL(NO3) untuk macrocyclic ligand1, 1 - bis (bis-(6,6 2,2 - oxymethylenyl - bipyridine) binaphthyl (L) incultured manusia limfosit ditunjukkan genotoxicity oleh induc-tion micronucleated sel pada dosis 0.15 mg/kg untuk 24 h andcytotoxicity oleh penurunan jumlah sel di sama dosis andtime (Beynek et al., 2007); efek ini tidak diamati unsur tembaga kompleks bahkan pada 33 untuk 100-fold dosis yang lebih tinggi. Dalam reportsof kegiatan genotoksik lainnya tembaga kompleks, researcherscommonly digunakan tes DNA fragmentasi. Kebanyakan dari laporan-laporan ini

TABEL 4

Gambar 7. LQM402 tidak menginduksi pembentukan micronuclei. Konsentrasi tiga LQM402 diberikan intraperitoneally dalam dosis tunggal untuk tikus CD1. Nomor ofmicronucleated polychromatic eritrosit (MNPCE) di 1000 dihitung polychromatic eritrosit dianalisis pada 0, 24, 48, dan 72 h di ekor Giemsa-bernoda darah smear.Konsentrasi sama LQM402 juga diberikan 30 menit setelah pemberian 60 mg/kg Mit C. Efek genotoksik Mit C diamati hanya ketika itu wasadministered sendirian. Grafik menunjukkan berarti dan kesalahan standar 5 tikus per kelompok eksperimental. Perbedaan yang signifikan dari kontrol ditunjukkan oleh ** p < 0.01and * p < 0,05

menyarankan mungkin clastogenic efek atau oksigen reaktif speciesas mekanisme efek mutagenik kompleks tembaga (Beynek et al., 2007; Szyba et al., 1992; Serment-Guerrero et al., 2011).3.7. LQM402 menginduksi lipid peroxidation dari tikus otak homogenateCytotoxicity dan

apoptosis terjadi sebagai respon terhadap beberapa penyebab, termasuk ekses radikal bebas atau lain lipid peroxidation prod-ucts (Barrera, 2012). Untuk sebagian besar unsur-unsur penting, animbalance tembaga endogen dapat mengubah sistem redoks di acell dan menyebabkan kerusakan sistemik dan patologi (Wang dan Guo, 2006). Di sisi lain, sementara chelation tembaga dapat digunakan asan anti-angiogenik terapi (Hancock et al., 2011; AndHarris Lowndes, 2004; Lowndes et al., 2008), tembaga kompleks seperti ascasiopeínas ® dapat menginduksi berlebih ROS dan mengarah toksisitas tomitochondrial (Serment-Guerrero et al., 2011). Di Amestest kami TA102 ketegangan, jumlah nya + revertants diinduksi byincubation dengan LQM402 sudah hampir menggandakan jumlah sponta-neous nya + revertants, yang dapat mengindikasikan stres oksidatif dalam diperburuk genotoxicity. Oleh karena itu, untuk menguji effectsof Pro-oksidan LQM402, kita mengevaluasi kemampuan untuk menginduksi lipid peroxidation ina tikus otak homogenate. Kami menemukan bahwa dalam berbagai konsentrasi of5.62 – 17,7 M, LQM402 disebabkan peningkatan lipid per-oksidasi (p < 0.01) di atas tingkat basal; ini meningkatkan werenot diamati pada konsentrasi di bawah 5.62 M atau di kisaran of31.62-100 M (gambar 8). LQM402 10 M diinduksi maksimum levelof lipid peroxidation (6.7 menegaskan nmol TBARS mg protein), yang washigher dari tingkat yang disebabkan oleh 20 mM AAPH positif kontrol (3,7 menegaskan nmol protein TBARS mg) dan mirip dengan yang disebabkan oleh the10 M FeSO4positive kontrol (7.4 menegaskan nmol protein TBARS mg). Thesedata menyarankan bahwa LQM402 mampu peroxidize lipid dan thereforeto mendorong proses-proses biologis yang terkait. Dengan demikian, LQM402-induced celldeath dan apoptosis pada sel-sel HeLa dapat karena lipid peroxida-tion dan/atau lipid peroxidation produk. Logam Cu(II), Cr(II),Co(II), Pb(II), dan Fe(II) memainkan peran penting dalam proses redoks sistem inbiological dan beberapa dari mereka adalah induktor lipid perox-idation oleh fitur oksidatif Fenton reaksi (Benedetand Shibamoto, 2008); dengan demikian, hal ini tidak biasa bahwa senyawa berbasis logam yang mencakup logam ini memiliki aktivitas tersebut. Beberapa casiopeínas ® dan kompleks tembaga lainnya dapat menghasilkan oksigen reaktif spesies (Trejo-Solis et al., 2012; Serment-Guerrero et al., 2011) dan kegiatan ini telah diasumsikan menjadi ofaction modus utama di balik cytotoxicity kompleks tembaga (Kowol et al., 2012).Cu(II) dan lain logam transisi seperti (Mn(II), Mn(III), andFe(III)) tampilan antioksidan properti. Scavengeractivities superoksida macrocyclic copper(II) kompleks yang ditentukan bya xantina-xantina oksidase sistem (Fernandes et al., 2007). Dengan demikian, kita diuji kemampuan LQM402 untuk menghambat FeSO4-inducedlipid peroxidation dalam upaya untuk menentukan apakah aktivitas antioksidan LQM402had. LQM402 ditemukan memiliki efek PA-tive pada produksi FeSO4-induced TBARS di concentrationsfrom 5.62 M untuk M 13.34 tikus otak homogenate; Namun, LQM402 ditampilkan penghambatan aktivitas konsentrasi berkisar of23.71-56.23 M (GB. 9). Bersama-sama, hasil kami menunjukkan bahwa LQM402has induktif dan penghambatan kegiatan di lipid peroxidation.3.8. LQM402 bukanlah seorang agen pemulungan untuk radicalThe DPPH DPPH radikal assay pemulungan digunakan sebagai tes PA-mem untuk mengukur aktivitas antioksidan dari LQM402. Wetested LQM402 pada tiga konsentrasi, 1, 10, dan 100 M, ina 100 M DPPH solusi. Konsentrasi tertinggi LQM402achieved nilai maksimum 5.18% pengurangan DPPHsolution, yang kita tidak bisa menentukan efektif con-centration diperlukan untuk mengurangi 50% larutan DPPH (EC50).Kegiatan ini adalah sangat rendah dibandingkan dengan kegiatan knownantioxidants seperti - tokoferol (85.79% DPPH pengurangan at74.13 M) atau quercetin (85.53% 23.71 m). LQM402 bisa inhibitthe Pro-oksidan

kegiatan FeSO4but tidak dapat bertindak sebagai scav-Crissi dari DPPH radikal bebas. Temuan ini tersirat mekanisme differentpotential dari aktivitas pemulung superoksida pra-sented oleh macrocyclic copper(II) kompleks, yang ditampilkan EC50values kegiatan pemulungan pada konsentrasi di bawah 30.82 M (Fernandes et al., 2007). Namun demikian, dalam penelitian lain, asam mefenamat obat inflam-matory dan senyawa azo ligand(E)-4-((1H-1,2,4-triazol-3-yl)diazenyl)benzene-1,3-diol dan (E)-4-((5-mercapto-1,3,4-thiadiazol-2-yl)diazenyl)benzene-1,3-diol Apakah tidak mengerahkan sifat antioksidan ketika dikomplekskan dengan Cu(II) (Kovala-Demertzi et al., 2009; GABER et al., 2013), yang revealsroles untuk ligan selain logam terikat.

8 GB. LQM402 adalah sebuah induktor peroksidasi lipid. Tikus otak homogenate (2 mg/ml protein) diinkubasi dengan LQM402 di beberapa konsentrasi (1-100 M) di 37◦C for3 h. TBARS produksi diukur di 540 nm. Signifikan TBARS produksi, ditandai dengan * p < 0,01, hanya diamati pada konsentrasi dari 5.62 M 17.78 M. At10 m LQM402 lemak peroxidation induktor lebih kuat daripada AAPH (20 mM) dan mirip dengan FeSO4(10 M). Grafik menunjukkan berarti dan kesalahan standar threeindependent percobaan.

Gambar 9. LQM402 meningkatkan dan menghambat produksi FeSO4-induced TBARS. Lipid peroxidation diinduksi dalam otak tikus homogenate oleh 10 M FeSO4alone atau simultaneouslyadding LQM402 pada konsentrasi berbeda (5,62 – 56.23 M). TBARS produksi diukur di 540 nm. TBARS yang disebabkan oleh FeSO4was ditingkatkan dengan 5,62 – 13.34 M LQM402and adalah dihambat secara konsentrasi tergantung pada konsentrasi 23.71 m dan tinggi. Grafik menunjukkan mean dan kesalahan standar tiga independentexperiments. ##p < 0,01 menunjukkan perbedaan yang signifikan dari kelompok-kelompok diperlakukan LQM402 dibandingkan dengan tingkat basal dan ** p < 0,01 mewakili perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan FeSO4.

Kesimpulan studi ini menunjukkan bahwa iscytotoxic LQM402 kompleks tembaga melawan Republik Ceko jalur sel, dengan selektivitas untuk sel-sel HeLa dan CaSki, dan itu menampilkan kurang cytotoxicity terhadap fibro-ledakan normal. Senyawa ini disebabkan translokasi membranephosphatidylserine sel-sel HeLa fitur apoptosis kematian, asdetected oleh annexin V-FITC noda. Pada awalnya, LQM402-inducedcell kematian menunjukkan aktivasi intrinsik apoptosis jalan-jalan yang ditentukan oleh kehadiran sitokrom c di diperlakukan HeLacell sitoplasma ekstrak dan penurunan ekspresi pro-caspases 3 dan 7. Dimungkinkan bahwa aktivitas sitotoksik bahwa ledto kematian apoptosis pada sel-sel HeLa adalah karena aktivitas LQM402as lemak peroxidation induktor dan itu juga mungkin terkait degradasi DNA yang diamati dalam tes tangga TUNEL dan DNA.Meskipun ada laporan dari tembaga kompleks dengan antioxidantor oksigen reaktif spesies induktor kegiatan, novel tembaga (II) kompleks LQM402 ditampilkan peroxidation kedua lipid penghambatan dan induktif effectson. Oleh karena itu, karena LQM402 memiliki genotoxicactivity tidak, mungkin digunakan sebagai agen terapeutik againstcervical kanker potensial. Saat ini, penelitian kami berfokus pada efek ofthis copper(II) kompleks pada pertumbuhan tumor pada tikus telanjang modelof kanker serviks, serta ekspresi gen terkait tocancer kemajuan.Konflik interestThe penulis menyatakan bahwa ada konflik tidak keprihatinan-ing manuskrip ini.AcknowledgementsWe terima Antonio Nieto

Camacho, M. Sc. dan Iván AriasGonzález, M. Sc. atas bantuan teknis dengan TBARS andDPPH, dan tes DNA tangga, masing-masing. Proyek ini finan-manusia menjadi sangat didukung oleh Instituto Politécnico Nacional (IPN), Meksiko (SIP proyek 20101395, 20110808 dan 20121122). SEFG adalah siswa saat ini terdaftar dalam Program Doktor ilmu di bidang bioteknologi di ENMH-IPN dan Penerima mahasiswa sesama-kapal dari CONACyT (40069) dan PIFI-IPN..

.