3.2 aktivitas penghambat DH dan ACE dari albumin dan globulin

Albumin 1 dan globulin pada biji bayam yang dihindrolisis oleh alkali. Hasil hidrolisis dapat

dilihat daritingkat pengukuran degaradasi proteolitik melalaui DH sesuai dengan reaksi TNBS

dengan kelompok amino bebas. Peningkatan terjadi selama 24 jam (57 ± 0,019%) dan 27 jam

(38 ± 0,06%). Berdasarkan hasil tersebut memperpanjang waktu reaksi tidak menghasilkan

perbaikan yang signifikan dalam DH. Albumin 1 dapat dihidrolisis oleh alkali sedangkan

globulin dapat dihidrolisis juga tetapi membutuhkan waktu yang lama. Menurut konishi

albumin 1 terurai oleh pronase, tapi tidak untuk albumin 2 karena terikat dengan protein-

tubuh. Menurut Silva-Sanchez dkk (2008) globulin dan glutelins diperkirakan di urutan utama

untuk ikatan peptida pada anti hipertensi.

Awalnya, fraksi albumin dan globulin tidak mempunyai aktivitas ACE inhibitor (tabel 2).

Tapi, hidrolisat dari fraksi protein memnunujukkan aktivitas ACE-inhibitor (Gambar. 2a dan b).

Setelah ditambhakan aktivitas ACE-inhibitor meningkat. . Pada awal hidrolisis, penghambatan

ACE meningkat dengan DH hingga penghambatan maksimum pada 18 jam (44 ± 0,07% DH)

dan 15 jam (13 ± 0,25% DH) untuk fraksi albumin 1 dan globulin. Data tersebut 40 ± 0,03% dan

35 ± 0,30% pada aktivitas ACE-inhibitor untuk albumin 1 dan globulin. Dengan kondisi

tersebut, fraksi peptida menunjukkan IC50 tertinggi, untuk albumin 1 menjadi 1,16 ± 0,05 mg /

ml sedangkan untuk globulin G1 dan G2 yaitu berturut – turut 0,63 ± 0,03 mg / ml serta 0,69 ±

0,02 mg / ml, masing-masing. Nilai-nilai ini dihitung dari kurva penghambatan masing-masing.

Dalam langkah ini hidrolisat enzimatik dari kedua fraksi protein menunjukkan aktivitas ACE

inhibitor jika dibandingkan dengan peptida pada protein kedelai mulai 0,021-1,73 mg / ml. Hal

ini dapat diketahui jika sebagian besar protein pada makanan utnuk antihipertensi terhdapa

aktivitas ACE inhibitor tnggi terlebih dahuu dimurnikan (Mr; Philanto-Leppälä, Koskinen,

Piilola, Tupasela, & Korhonen, 2000). Hidrolisis lebih lanjut dari albumin 1 dan globulin

mengakibatkan hidrolisat dengan penurunan penghambatan pada ACE. Selain itu, waktu

hidrolisis yang diamati dalam penelitian ini untuk fraksi albumin 1 dan globulin itu lebih lama

dari itu. Dalam kondisi eksperimen yang diuji, butuh waktu yang sangat lama untuk albumin 1

dan globulin menjalani alcalase hidrolisis bila dibandingkan dengan protein makanan lain

seperti kacang (30% DH dan 40% ACE-IA pada 30 menit;. Pedroche et al, 2002 ) dan kacang

hijau (16% DH dan aktivitas ACE-inhibitor 80% pada 2 jam; Li et al, 2005).

Alcalase adalah serin bakteri endopeptidase dibuat dari strain baillus licheniformis.

Alcalase adalah enzim yang juga menguntungkan karena biaya yang murah dari pada pepsin,

tripsin, kimotripsin, papin atau thermolysin. Subtilisin Carlsber menghidrolisis ikatan peptida

dengan spesifisitas yang luas, membebaskan peptida dengan asam amino hidrofobik seperti

Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Val dan Met di mereka C-terminal. . Pedroche et al., 2002 menyatakan

bahwa perlu untuk menggunakan lebih dari satu protease untuk mendapatkan hidrolisat

ekstensif dengan DH lebih besar dari 50%. Secara umum satu, enzim enzim tidak dapat

mencapai pada DH yang diinginkan dalam jangka waktunya. Pra-pencernaan dengan alcalase

endoprotease meningkatkan jumlah N-terminal. Namun, pencernaan lebih lanjut alcalase

hidrolisis dengan flavourzyme tidak menunjukkan efek yang ditandai pada penghambatan

ACE, meskipun meningkatkan DH. Alcalase telah digunakan di masa lalu untuk produksi

peptida ACE-inhibitor (Matsufuji et al, 1994.); sehingga enzim ini adalah satu-satunya enzim

yang diuji. Berdasarkan hasil ini menunjukkan bahwa optimal hidrolisis terdapat ACE-inhibitor

peptida yang terdegradasi, tapi lebih sedikit yang terbentuk, sehingga menurunkan aktivitas

ACE-inhibitor secara keseluruhan. Selain itu, peptida ACE-inhibitor diproduksi oleh alcalase

dari otot sarden tahan terhadap pencernaan oleh protease pencernaan (Matsufuji et al., 1994)

peptida tersebut terdapat dalam hidrolisat protein. Banyak dari hidrolisat ini telah terbukti

memiliki aktivitas antihipertensi ketika diuji pada tikus hipertensi.

3.3 pemurnian dari fraksi peptida dengan aktivitas penghambat ACE

Selama 18 jam albumin dan 15 hidrolisat h globulin diuji ke aktivitas penghambat ACE

secara optimal. Fraksi ini diperoleh untuk prses pemurnian dan pengukuran aktivitas

penghambat ACE. Gamabr 3a dan b menunjukkan gel infiltrasi profile (Sephadex G-200) dari

albumin 1 dan fraksi globulin. Abumin 1 dan fraksi globulin menunjukkan ketiga puncak utama

yaitu A1 (313 kDa), A2 (159 kDa) dan A3 (101 kDa). Ketiga albumin 1 fraksi dianalisis dengan

SDS-PAGE (data tidak ditampilkan) untuk menentukan polipeptida. Karena itu sulit untuk

memisahkan masing-masing puncak secara individual dari kolom filtrasi, karena elusi

penutupan A1, A2 dan A3, awal albumin 1 fraksi (AI) yang digunakan. Ketika hidrolisat albumin

(18 h) dianalisis, itu menghasilkan puncak luas (AI.1; <1,35 kDa). Fraksi AI.1 polipeptida

kemudian diterapkan pada kolom Sephadex G-15 untuk menganalisis komposisi polipeptida

nya (Gambar. 3a '). Dengan demikian fraksinasi dari AI.1 mengakibatkan AI.1.1 (4,7 kDa) dan

AI.1.2 (0,55 kDa). Jika 120 g / mol diasumsikan mean Mr untuk asam amino, panjang peptida

kemungkinan akan dihitung menyiratkan 4-5 asam amino untuk AI.1.2. Demikian pula, fraksi

globulin dielusi dari Sephadex G-200 mendapatkan dua fraksi. Hasil fraksinasi ditemukan

puncak G1 (457 kDa) dan G2 (41 kDa). Secara terpisah, sebuah fraksinasi lanjut dari G1 dan G2

setelah 15 jam hidrolisis mengakibatkan G1.1 dan G1.2 dan, pada gilirannya, G2 diberikan

G2.1 dan G2.2. Menurut pola elusi mereka dari Sephadex G-15 (Gambar. 3b '), G1.1 (7,5 kDa),

G1.2 (4,7 kDa), G2.1

Fraksi yang dikumpulkan dari gel infiltrasi diuji untuk% penghambatan terhadap ACE.

hidrolisat enzimatik albumin 1 dan peptida globulin memiliki moderat ACE-inhibitor aktivitas

yaitu AI.1.2 (IC50 = 0,82 ± 0,07 mg / ml) dan G2.2. (IC50 = 0,32 ± 0,02 mg / ml). Pecahan AI.1.2

dan G2.2 dari Sephadex G-15 kolom, yang terdaftar nilai IC50 tertinggi di fraksi protein

masing-masing, yang diterapkan pada kolom RP-HPLC untuk dipisahkan atas dasar non-

polaritas. Elusi pro fi le ditunjukkan pada Gambar. 4a dan b. Pecahan AI.1.2 dan G2.2 yang

dielusi dari kolom RP-HPLC empat fraksi dan diuji untuk nilai IC50 mereka: pecahan AI.1.2.1,

AI.1.2.2, AI.1.2.3 dan AI.1.2.4 dielusi pada 4,5, 9, 14 dan 30% (v / v) asetonitril, masing-masing.

Demikian pula, fraksi G2.2.1, G2.2.2, G2.2.3 dan G2.2.4 dielusi pada 3, 8, 17 dan 30%

asetonitril, masing-masing. Karena ACE-inhibitor diabaikan aktivitas% untuk AI.1.2.1; AI.1.2.3;

AI.1.2.4; G2.2.1; G2.2.3 dan G2.2.4, nilai IC50 mereka tidak diselidiki. IC50 adalah 0,35 ± 0,02

mg / ml untuk fraksi AI.1.2.2 peptida, sedangkan fraksi G2.2.2 peptida adalah 0,15 ± 0,03 mg /

ml. Dari Sephadex G-15 kromatografi, yang IC50 akan sesuai dengan 636 LM dan 375 LM.

Kaptopril dan inhibitor ACE memiliki aktivitas ACE-inhibitor yang kuat dari peptida bayam.

untuk kaptopril IC50 adalah 6,9 ± 0,32 ng / ml dan untuk inhibitor ACE 329 ± 26 ng / ml, yang

membandingkan erat dengan nilai IC50 yang dilaporkan 1,3-8,9 ng / ml untuk kaptopril dan

100-300 ng / ml untuk ACE inhibitor (Lo & Li-Chan, 2005). Aktivitas ACE-inhibitor diamati

dengan nilai IC50 berkisar 0,20-246,7 mg / ml (Li, Le, Shi, & Sherstha, 2004). ). Beberapa

tripeptides yang terisolasi dari hidrolisat zein, protein endosperm jagung, bertindak sebagai

inhibitor ACE. Nilai-nilai IC50 untuk peptida ini (Leu-Arg-Pro, Leu-Ser-Pro, Leu-Gln-Pro dan Leu-

Ala-Tyr) berturut – turut adalah 0,27, 1,7, 1,9 dan 3,9 Lm. Ketika sebagian kecil peptida kedelai

dimurnikan, empat peptida yang ditemukan dengan nilai IC50 berkisar 39-153 LM. Terutama,

nilai-nilai IC50 dari prolin peptida pada C-terminal adalah sekitar 1-82 LM. Oleh karena itu,

hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi peptida G2.2 globulin memiliki aktivitas alamiah

ACE-inhibitor peptida yang paling aktif (IC50 = 0,32 ± 0,02 mg / ml atau 800 Lm). Setelah

dimurnikan peptida tunggal didapatkan dan nilainya akan meningkat. Oleh karena itu, hasil ini

juga menunjukkan bahwa peptida dengan Mr rendah. Dimana yang bersifat hidrofobik

mungkin memiliki pola penghambatan kuat terhadap ACE. Perlu dicatat bahwa dalam G2.2.2

penelitian ini adalah campuran dari peptida, bukan pemurnian peptida tunggal. Selain itu, jika

suatu peptida tunggal diisolasi, nilai IC50 yang mungkin timbul.