LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“Isolasi DNA“

Nama : ADIS PERMATA SARI

NIM : 125040201111205

Kelompok : SELASA, 11.00

Asisten : NANIK SUPRIATUN

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDNA adalah molekul utama yang mengkode

semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder  seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebutmenjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA

1.2 Tujuan1. Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA2. Untuk mengetahui macam-macam metode isolasi

DNA3. Untuk mengetahui tahapan isolasi DNA4. Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3 Manfaat1. Mengetahui pengertian isolasi DNA2. Mengetahui macam-macam metode isolasi DNA3. Mengetahui tahapan isolasi DNA4. Mengetahui manfaat isolasi DNA

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNA1. Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil

akhirnya strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih (Aditia, 2010).

2. Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.

3. DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis (Doyle, 1987).Terjemahan :Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya

4. DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive (Hatta, 2002).Terjemahan :Isolasi DNA merupakan tahapan terpenting dalam analisis biologi molekuler. Beberapa teknik isolasi DNA yang dikembangkan cukup mahal.

2.2 Macam Metode Isolasi DNA1. Kitchen Preparation

Terdapat 4 prinsip dalam melakukan isolasi DNA yaitu :a. Melisis sel secara fisik, dengan cara b. Penggerusan. Pemecahan dinding sel.c. Pemecahan membran sel.d. Pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara fisik dengan menumbuk atau menggerus bahana yang akan kita gunakan. bahkan bahan yang lunak seperti strowberry cukup hanya diremas-remas saja.

Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA)bisa keluar.

Jika perlu kita dapat menambahkan proteinase (enzim pengurai protein) untuk menyingkirkan protein yang mungkin akan mengotori bahan yang kita inginkan. Proteinase alami yang dapat kita gunakan adalah papain yang merupakan ekstrak daun pepaya, atau bromelin yang merupakan ekstrak buah nanas.

 Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan. (Tohib, 2012)

 2. CTAB

CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat (Kaidah dan Suprapto, 2003), merusak membran sel dan melarutkan DNA ( Purwantara, 2001). Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel

dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.

Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996). Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein (Milligan, 1992). Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel.

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA (Ningrum, 2008). Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi (Purwantara, 2001). Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.

Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono, 1996).

Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal

dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit ( Ningrum, 2008). Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Wyatt and Brown, 1996).

2.3 Tahapan Isolasi DNAMenurut Istanti (1999) terdapat 5 (lima) tahap

untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: 1. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan

2. Pelisisan dinding dan membrane selTahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada di dalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang

tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

3. Pengekstrasi dalam larutanSelanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

4. PurifikasiTahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

5. PresipitasiTahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi

yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas

2.4 Manfaat Isolasi DNAMenurut Abbas (2012) manfaat isolasi DNA di

bidang pertanian adalah untuk mengetahui gen – gen yang terdapat dalam sel tumbuhan tersebut. Gen – gen yang terdapat pada sel tumbuhan tersebut dapat diaplikasikan dalam budidaya suatu tumbuhan melalui rekayasa genetika. Gen – gen bagus yang terdapat dalam sel tumbuhan dapat dipertahankan sedangkan gen – gen yang kurang menguntungkan dapat diminimalisasi dampaknya terhadap tumbuhan tersebut.

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 3. 1 Alat dan Bahan

1. Alat2. Bahan

Erlenmeyer : Untuk tempat aquadesCawan : Untuk wadah garam dan

detergen.Saringan : Untuk menyaring bahan yang di

ekstraksi Mortar : Untuk melembutkan bahan

praktikumPastle : Untuk melembutkan bahan

praktikumSpatula : Untuk mengaduk dan

mengambil bahan praktikumGunting : Untuk memotong bahan agar

lebih kecil agar mempermudah dalam menghalus- kannya.

Gelas ukur : Untuk wadah pasta daunPipet : Untuk mengambil etanolKamera : Untuk mendokumentasiTimbangan : Untuk menimbang bahan

praktikumTabung Reaksi:Untuk meletakkan bahan yang

sudah di haluskan dan untuk mereaksikan bahan.

2. BahanMangga :Sebagai bahan praktikun yang

akan diamati DNA nya.

Detergen :Bu cream, bubuk, cair untuk merusak dinding sel dan meluruhkan DNA

Aquades :Untuk melarutkan detergen dan garam

Garam :Untuk mengendapkan kotoran akibat rusaknya dinding sel.

3. 2 Cara Kerja

Seger

Campur buffer ekstraksi dengan

karbon (0.5% w/v) dan

mercaptoethanol 4 µL. (Kocok

sebelum digunakan)

Masukkan 1 mL ke dalam tube ukuran 1.5 ML

dan tutup kembali dengan

tube (labeli setiap tube)

Timbang 0.1 gr sampel daun

Tube berisi buffer ekstraksi

Masukan kedalam mortar,

tambahkan sedikit PVP dan

tambahkan nitrogen kemudia segera digerus hingga halus

(jangan sampai cair)

Segera masukkan

Segera vortex hingga tercampur rata

3.3 Analisa perlakuanDalam penanaman kultur organ, bahan yang

dipilih adalah krisan karena mudah untuk diperoleh serta pertumbuhan selnya relative cepat. Dalam pemotongan awal, potongan dilebihkan sebagai seleksi awal agar nantinya proses pemotongan pada penanaman lebih mudah. Tahap penanaman ada 2, yaitu sterilisasi awal (sterilisasi eksplan) dan penanaman di LAFC. Dalam sterilisasi awal, ada 3 larutan bahan yang digunakan yaitu detergen untuk sterilisasi dari bakteri, cloroks untuk menghilangkan detergen dari eksplan dan fungisida untuk sterilisasi dari cendawan jamur.

Penanaman di LAFC harus ada dalam kondisi steril sehingga selain sterilisasi alat juga dilakukan sterilisisasi diri dengan alcohol 70% dan menggunakan alat pelindung diri berupa masker dan sarung tangan lateks. Hal ini dikarenakan tubuh juga membawa patogen serta enzim-enzim yang dapat menggagalkan proses kultur jaringan. Alat-alat yang digunakan dalam LAFC yaitu pinset dan scalpel sebelum dan setelah digunakan harus dicelupkan ke dalam alcohol 90% kemudian dibakar pada Bunsen untuk menjaga agar kondisi benar-

Inkubasi dalam oven pada suhu 65oC selama 10 menit (bolak balik tube setiap 5 menit)

Keluarkan tube dari oven dan dinginkan sebentar

Setelah dinging

benar steril sehingga kontaminasi dapat diminimalisir. Eksplan yang ditanam harus diletakkan tegak sesuai titik tumbuhnya pada media. Hal ini agar eksplan dapat tumbuh dengan baik. Botol kultur yang telah ditanami eksplan harus disterilisasi kembali dengan membakar mulut botol pada Bunsen dan menutupnya dengan plastic serta mengikatnya rapat agar pengaruh dari luar dapat dihindarkan. Setelah eksplan ditanam semua maka eksplan dipindahkan ke rak kultur untuk diamati. Pengamatan dilakukan selam 2 minggu dengan interval pengamatan 3 hari sekali. Setiap kali dilakukan pengamatan harus dicatat dan didokumentasikan.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4. 1 Hasil

4. 2 Pembahasan

BAB VPENUTUP

5. 1 Kesimpulan5. 2 Saran

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous a .2012.Tujuan Isolasi DNA. http://www.  scribd.com / doc/69290030/Isolasi-Dna-n-Elektroforesis. Diakses pada tanggal 2 Desember 2012

Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA  dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Nicho.1993;Surzycki.2000.IsolasiDNA.http://anieez87.blogspot.com/.  Diakses pada 2 Desember 2012

Utami,  Annisa; Riani Meryalita; Nur Aeny Prihatin; Laksmi Ambarsari; Popi Asri Kurniatin; Waras Nurcholis.2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya

Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada University Press. Yogyakarta

Zubaidah.2004. Isolasi DNA Buah. http://aan-annas.blogspot.com/2010/11/isolasi-dna-buah-tomat-dan-pepaya.html .Diakses pada 2  Desember 2012.

Aditia. 2010. Isolasi DNA. http://sharkestaditia.blogspot.com /2010/03/isolasiDNA.html Diakses 01 Desember 2012

Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure

for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas

comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang

Puspita, 2010. Tahapan Isolasi DNA. http://puspitt .multiply.com /journal/item/14/ISOLASI-DNA? &show_interstitia l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem. Diakses tanggal 01 Desemb- er 2012

Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.

Abbas, usnun Hamidah. 2012. Macam Metode Isolasi DNA (online).http://dc317.4shared.com/doc/e70nZ7SO/preview.html. Diakses pada 2 Desember 2012.

Hatta, M. 2002. Teknik Isolasi dan Pengukuran DNA. Seminar Teknik Isolasi DNA, Makassar, Universitas Hasanuddin.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.

Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Sabirose, Bernadhete Gaudia. 2012. Tahapan Isolasi DNA (Online).

http://www.scribd.com/doc/86207052/Isolasi-Dna.diakses tanggal 3 Desember 2012.

Utami, Annisa; Riani Meryalita; Nur Aeny Prihatin; Laksmi Ambarsari; Popi Asri Kurniatin; Waras Nurcholis.2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (Cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya

Yulia, Floweriza. Manfaat dari Isolasi DNA (online). http://flowerizayulia.blogspot.com/2012/01/isolasi-dna.html.diakses tanggal 3 Desember 2012.

Yuwono, T.2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta : Gajahmada University Press.

Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan

Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi.

Mustahib. 2012. . Available on http://biologi.blogsome.com/2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/. Diakses tanggal 22 Februari 2012.

BAB III METODOLOGI3.1 Alat dan Bahan Fungsi 3.2 Langkah Kerja + dokumentasi3.3 Analisis Perlakuan

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)4.2 Pembahasan (bandingkan dengan literature)

BAB V PENUTUP5.1 Kesimpulan5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten