Teknik Isolasi DNA

Dapatkah Kita Melihat DNA ?• ukuran DNA terlalu

kecil untuk diihat oleh mata

• Bahkan dengan menggunakan miskroskop terbaik pun, yang dapat kita lihat hanya kromosom

Dapatkah Kita Melihat DNA ?• Meskipun demikian,

banyak sekali jumlah DNA di dalam sel tubuh manusia. Bila DNA dari suatu sel dibentangkan, panjangnya sekitar 2 meter

• Bila seluruh DNA di dalam tubuh dibentangkan, panjangnya 9 juta km (jarak dari bumi ke bulan pulang pergi 13 kali)

Bahan (Material)1. Kita harus menyiapkan bahan yang mengandung

DNA

3. Kita akan mengisolasi DNA dari kacang hijau (kenapa? karena murah)

2. Karena DNA adalah "blueprint" kehidupan, maka semua makhluk hidup mempunyai DNA

Bahan1. kacang hijau2. garam3. deterjen / sabun cair4. isopropil alkohol5. pelunak daging6. tabung reaksi7. batang pengaduk

Safety First !

1. Jangan makan atau minum2. Tetap di tempat duduk3. Gunakan googles4. Hati-hati dengan bahan yang digunakan

Tahap 1• Blender kacang hijau

untuk memisahkan sel dari komponen lainnya

• Blender dengan air dan sedikit garam sampai diperoleh bentuk seperti sup

Filtrasi

Untuk memisahkancairan berisi sel dari residu kacang hijau

Tahap 2• Tambahkan Deterjen/

sabun cair

• Masukkan sup kacang hijau ke dalam tabung reaksi dan tambahkan deterjen

• Diaduk

Apa fungsi deterjen ?• Setiap sel dilindungi oleh membran sel• DNA berada di dalam nukleus dari sel, yang

juga dilindungi oleh membran

• Membran sel tersebut harus dipecahkan supaya DNA bisa dikeluarkan dari sel

Apa fungsi deterjen ?

Deterjen

Membran Sel

• Deterjen memecahkan membran sel yang melindungi sel

• Bagaimana? deterjen menempel pada lipid (lemak) dan protein pada membran sel

Apa fungsi deterjen ?

Apa fungsi deterjen ?• Membran di sekitar

sel dan nukleus sudah dipecahkan

• Yang tersisa adalah : Protein, Karbohidrat, DNA

Tahap 3Tambahkan pengempuk daging (enzim) ke dalam campuran

• Pelunak daging adalah suatu enzim

• Enzim adalah protein yang mengkatalis reaksi agar lebih cepat membentuk produk

• Enzim pada pelunak daging mempercepat reaksi pemotongan molekul protein

• DNA di dalam nukleus dikelilingi oleh protein

• Enzim memotong protein dari DNA

Tahap 4• Perlahan tambahkan alkohol• Miringkan tabung reaksi dan perlahan masukkan

satu lapisan alkohol di atas campuran sup kacang hijau

• DNA akan mengapung di lapisan alkohol• Semua residu dan protein dari sel kacang akan

ada di dasar, di lapisan air

DNA adalah molekulpanjang yang berikatansatu sama lain

DNA Sequencing

Protein Purification

1. Ammonium Sulfate Precipitation

2. Column Chromatography

Flow-through Eluate

3. Ion-Exchange Chromatography

Ion exchange chromatography

DEAE celluloseanion exchanger

CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)-

--

-

Negatively charged (acidic) protein or enzyme

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-

+++

+

Positively charged (basic) protein or enzyme

CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)

Ion exchange chromatography

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-

+++

+

Positively charged protein or enzyme bind to the column

For protein binding, the pH is fixed (usually near neutral) under low salt conditions. Example cation exchange column…

---

--

--

-

Negatively charged proteins pass through the column

Ion exchange chromatography

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-

+++

+

To elute our protein of interest, add increasingly higher amount of salt (increase the ionic strength). Na+ will interact with the cation resin and Cl- will interact with our positively charged protein to elute off the column.

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-+

++

+

Na+

Na+Cl-

Na+2

Cl-

Cl-

Cl-

Na+2

+ Increasing [NaCl] of the elution buffer

4. Affinity Chromatography

5. Gel Filtration Chromatography

Using SDS-PAGE to Assess Purity