Isolasi DNA

37
Teknik Isolasi DNA

description

Politeknik AKA Bogor

Transcript of Isolasi DNA

Page 1: Isolasi DNA

Teknik Isolasi DNA

Page 2: Isolasi DNA

Dapatkah Kita Melihat DNA ?• ukuran DNA terlalu

kecil untuk diihat oleh mata

• Bahkan dengan menggunakan miskroskop terbaik pun, yang dapat kita lihat hanya kromosom

Page 3: Isolasi DNA

Dapatkah Kita Melihat DNA ?• Meskipun demikian,

banyak sekali jumlah DNA di dalam sel tubuh manusia. Bila DNA dari suatu sel dibentangkan, panjangnya sekitar 2 meter

• Bila seluruh DNA di dalam tubuh dibentangkan, panjangnya 9 juta km (jarak dari bumi ke bulan pulang pergi 13 kali)

Page 4: Isolasi DNA

Bahan (Material)1. Kita harus menyiapkan bahan yang mengandung

DNA

3. Kita akan mengisolasi DNA dari kacang hijau (kenapa? karena murah)

2. Karena DNA adalah "blueprint" kehidupan, maka semua makhluk hidup mempunyai DNA

Page 5: Isolasi DNA

Bahan1. kacang hijau2. garam3. deterjen / sabun cair4. isopropil alkohol5. pelunak daging6. tabung reaksi7. batang pengaduk

Page 6: Isolasi DNA

Safety First !

1. Jangan makan atau minum2. Tetap di tempat duduk3. Gunakan googles4. Hati-hati dengan bahan yang digunakan

Page 7: Isolasi DNA

Tahap 1• Blender kacang hijau

untuk memisahkan sel dari komponen lainnya

• Blender dengan air dan sedikit garam sampai diperoleh bentuk seperti sup

Page 8: Isolasi DNA

Filtrasi

Untuk memisahkancairan berisi sel dari residu kacang hijau

Page 9: Isolasi DNA

Tahap 2• Tambahkan Deterjen/

sabun cair

• Masukkan sup kacang hijau ke dalam tabung reaksi dan tambahkan deterjen

• Diaduk

Page 10: Isolasi DNA

Apa fungsi deterjen ?• Setiap sel dilindungi oleh membran sel• DNA berada di dalam nukleus dari sel, yang

juga dilindungi oleh membran

Page 11: Isolasi DNA

• Membran sel tersebut harus dipecahkan supaya DNA bisa dikeluarkan dari sel

Apa fungsi deterjen ?

Page 12: Isolasi DNA

Deterjen

Membran Sel

Page 13: Isolasi DNA

• Deterjen memecahkan membran sel yang melindungi sel

• Bagaimana? deterjen menempel pada lipid (lemak) dan protein pada membran sel

Apa fungsi deterjen ?

Page 14: Isolasi DNA

Apa fungsi deterjen ?• Membran di sekitar

sel dan nukleus sudah dipecahkan

• Yang tersisa adalah : Protein, Karbohidrat, DNA

Page 15: Isolasi DNA

Tahap 3Tambahkan pengempuk daging (enzim) ke dalam campuran

Page 16: Isolasi DNA

• Pelunak daging adalah suatu enzim

• Enzim adalah protein yang mengkatalis reaksi agar lebih cepat membentuk produk

• Enzim pada pelunak daging mempercepat reaksi pemotongan molekul protein

Page 17: Isolasi DNA

• DNA di dalam nukleus dikelilingi oleh protein

• Enzim memotong protein dari DNA

Page 18: Isolasi DNA

Tahap 4• Perlahan tambahkan alkohol• Miringkan tabung reaksi dan perlahan masukkan

satu lapisan alkohol di atas campuran sup kacang hijau

Page 19: Isolasi DNA

• DNA akan mengapung di lapisan alkohol• Semua residu dan protein dari sel kacang akan

ada di dasar, di lapisan air

Page 20: Isolasi DNA

DNA adalah molekulpanjang yang berikatansatu sama lain

Page 21: Isolasi DNA
Page 22: Isolasi DNA

DNA Sequencing

Page 23: Isolasi DNA
Page 24: Isolasi DNA
Page 25: Isolasi DNA

Protein Purification

Page 26: Isolasi DNA
Page 27: Isolasi DNA
Page 28: Isolasi DNA

1. Ammonium Sulfate Precipitation

Page 29: Isolasi DNA

2. Column Chromatography

Flow-through Eluate

Page 30: Isolasi DNA

3. Ion-Exchange Chromatography

Page 31: Isolasi DNA

Ion exchange chromatography

DEAE celluloseanion exchanger

CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)-

--

-

Negatively charged (acidic) protein or enzyme

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-

+++

+

Positively charged (basic) protein or enzyme

CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)

Page 32: Isolasi DNA

Ion exchange chromatography

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-

+++

+

Positively charged protein or enzyme bind to the column

For protein binding, the pH is fixed (usually near neutral) under low salt conditions. Example cation exchange column…

---

--

--

-

Negatively charged proteins pass through the column

Page 33: Isolasi DNA

Ion exchange chromatography

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-

+++

+

To elute our protein of interest, add increasingly higher amount of salt (increase the ionic strength). Na+ will interact with the cation resin and Cl- will interact with our positively charged protein to elute off the column.

CM cellulosecation exchanger

CH2-COO-

CH2-COO-+

++

+

Na+

Na+Cl-

Na+2

Cl-

Cl-

Cl-

Na+2

+ Increasing [NaCl] of the elution buffer

Page 34: Isolasi DNA

4. Affinity Chromatography

Page 35: Isolasi DNA

5. Gel Filtration Chromatography

Page 36: Isolasi DNA
Page 37: Isolasi DNA

Using SDS-PAGE to Assess Purity