LAPORAN AKHIR

PENELITIAN FUNDAMENTAL

SINTESIS TURUNAN EURIKUMANON, KAJIAN AKTIVITAS DAN

KEAMANANNYA SEBAGAI ANTIKANKER

Tahun ke-1 dari rencana 1 tahun

Ketua / Anggota Tim

Dr. HANIFAH YUSUF, M.KES, APT / 0011095703

dr. DARMA SATRIA, M.Si / 0011088301

dr. ZULKARNAIN, M.Sc / 0025098302

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA

NOVEMBER 2014

LAPORAN AKHIR

PENELITIAN FUNDAMENTAL

SINTESIS TURUNAN EURIKUMANON, KAJIAN AKTIVITAS DAN

KEAMANANNYA SEBAGAI ANTIKANKER

Tahun ke-1 dari rencana 1 tahun

Ketua / Anggota Tim

Dr. HANIFAH YUSUF, M.KES, APT / 0011095703

dr. DARMA SATRIA, M.Si / 0011088301

dr. ZULKARNAIN, M.Sc / 0025098302

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA

NOVEMBER 2014

RINGKASAN

Eurikumanon dari akar tumbuhan pasak bumi (Eurycoma longifolia, Jack) telah

terbukti memiliki aktivitas antikanker. Penelitian tentang “Sintesis Turunan

Eurikumanon, Kajian Aktivitas dan Keamanannya Sebagai Antikanker”

bertujuan untuk mendapatkan antikanker baru. Penelitian ini diawali dengan

ekstraksi serbuk akar pasak bumi dengan metanol, kemudian difraksinasi dan

isolasi. Eurikumanon yang diperoleh ditentukan strukturnya secara spektroskopi.

Selanjutnya eurikumanon ini digunakan sebagai starting material untuk

mensintesis turunannya secara esterifikasi dengan farmakofor asetilklorida,

butirilklorida, valerilklorida, para-metoksi benzoilklorida dan suksinat anhidrida.

Eurikumanon dan turunannya diuji aktivitas antikankernya secara in vitro dengan

metode MTT assay terhadap sel T47D, MCF-7, Hela, WIDR dan sel Vero.

Aktivitas antikanker (nilai IC50) ditentukan secara analisis regresi linear. Nilai

IC50 merupakan konsentrasi senyawa uji yang mampu menghambat pertumbuhan

50% sel kanker. Hasil ekstraksi diperoleh ± 60g (6%) ekstrak kental dan fraksinasi

terhadap ekstrak ini diperoleh 25 g (2,5%) fraksi terkonsentrasi eurikumanon.

Isolasi eurikumanon dari fraksi ini diperoleh eurikumanon 0,04%. Hasil sintesis

turunan eurikumanon diperoleh eurikumanon triasetat 65,25% (C26H30O12 ,BM

534,58); eurikumanon dibutirat 60,35% ( C28H36O11, BM 548,94); eurikumanon

monovalerat 55,10% (C25H32O10 ,BM 492,82; eurikumanon dimetoksibenzoat

50,10% (C36H36O13 , BM 676); dan eurikumanon disuksinat 65,25% (C28H30O15 ,

BM 606,86). Hasil uji eurikumanon terhadap sel T47D (IC50 1,17 ± 0,09 µg/mL),

MCF-7(IC50 3,96 ± 0,02 µg/mL), Hela (IC50 2,95 ± 0,08 µg/mL),WIDR (IC50 1,45

± 0,01 µg/mL) dan sel Vero (IC50 609,89 ± 29,77 µg/mL). Turunan eurikumanon

yaitu eurikumanon triasetat memiliki aktivitas antikanker terhadap T47D (IC50

1,08 ± 0,07µg/mL), MCF-7 (IC50 3,09 ± 0,03 µg/mL) dan Hela (IC50 1,21 ± 0,05

µg/mL).Tetapi eurikumanon triasetat tidak aktif terhadap sel WIDR (IC50 25,06 ±

0,59 µg/mL) dan tidak aman terhadap sel Vero (IC50 1,74 ± 0,99 µg/mL).

Eurikumanon dan turunannya yaitu eurikumanon dibutirat, eurikumanon

monovalerat dan eurikumanon dimetoksibenzoat memiliki indeks selektivitas >3

dan termasuk dalam kategori selektivitas tinggi (aman), tetapi senyawa tersebut

tidak memiliki aktivitas terhadap sel kanker T47D, MCF-7, Hela dan WIDR.

Eurikumanon disuksinat tidak aktif terhadap sel kanker T47D, MCF-7, Hela,

WIDR dan sel Vero.

PRAKATA

Alhamdulillahirabbilaalamin, segala puji dan syukur dipanjatkan ke hadirat Allah

SWT atas Rahmat dan HidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan

penulisan laporan kemajuan penelitian hibah fundamental yang berjudul “Sintesis

Turunan Eurikumanon, Kajian Aktivitas dan Keamanannya Sebagai

Antikanker ”. Penelitian ini dilakukan dalam upaya menemukan antikanker baru

dan diharapkan dapat membantu mengatasi permasalahan kanker. Penulis

menyadari dalam melakukan penelitian dan penulisan laporan masih banyak

keterbatasan, namun dengan bantuan moril dan materil dari berbagai pihak

semuanya dapat diselesaikan.

Laporan ini dibuat dalam rangka mempertanggungjawabkan penggunaan dana

penelitian yang telah diberikan kepada kami dan pada kesempatan ini peneliti

mengucapkan terimakasih kepada:

1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan dan

Kebudayaan Republik Indonesia, yang telah memberikan dana penelitian ini.

2. Rektor Universitas Syiah Kuala Darussalam Banda Aceh, yang telah

memberikan kesempatan untuk mengikuti penelitian ini.

3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Syiah Kuala dan seluruh staf, yang telah

memberi arahan agar kami ikut dalam program penelitian ini

4. Kepala Bagian/ Laboratorium Farmakologi & Terapi Fakultas Kedokteran

Universitas Gadjah Mada serta staf yang telah memberi fasilitas selama kami

melakukan penelitian.

5. Kepala Bagian / Laboratorium Parasistologi Fakultas Kedokteran Universitas

Gadjah Mada serta staf yang telah memberi fasilitas selama kami melakukan

penelitian

6. Terimakasih juga disampaikan kepada keluarga dan semua pihak yang telah

membantu dan memberikan dorongan selama pelaksanaan penelitian ini.

Semoga Allah SWT membalas dengan kebaikan dan rahmat yang berlimpah.

Amin Ya Rabbal Alamin.

Banda Aceh, 10 November 2014

Ketua Tim Peneliti

Hanifah Yusuf

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL ........................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN.......................................................... iii

RINGKASAN ....... ................................................... iv

PRAKATA ....................................................... v

DAFTAR ISI ........................................................... vi

DAFTAR TABEL ....................................................... vii

DAFTAR GAMBAR ....................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................... ix

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Penelitian................................................. 1

1.2. Permasalahan Penelitian........................................................ 2

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengembangan Antikanker Melalui Modifikasi Struktur...... 3

2.2. Aktivitas Antikanker Senyawa Kuasinoid dari Akar

Pasak Bumi (Eurycoma longifolia, Jack)......................... 4

2.3. Studi Pendahuluan Yang Telah Dilaksanakan Dan Hasil

Yang Dicapai ......................................................... 4

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1. Tujuan Penelitian ....................................................... 6

3.2. Manfaat Penelitian ....................................................... 6

BAB 4. METODE PENELITIAN

4.1. Jenis, Rancangan dan Subyek Penelitian........................ 7

4.2. Tempat Penelitian ....................................................... 7

4.3. Bahan-Bahan Penelitian .................................................. 7

4.4. Alat-Alat Penelitian ....................................................... 8

4.5. Cara penelitian .............................................................. 9

4.5.1. Ekstraksi, fraksinasi dan isolasi senyawa eurikumanon 9

4.5.2. Sintesis Turunan Euriumanon .................................... 11

4.5.3. Uji aktivitas antikanker turunan eurikumanon .......... 12

4.5.4. Uji sitotoksisitas turunan eurikumano terhadap sel Vero 14

BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Isolasi Eurikumanon dari Akar Pasak Bumi ................ 15

5.2. Identifikasi Struktur Kimia Eurikumanon (Isolat 2)..... 17

5.2.1. Interpretasi spektrum UV eurikumanon (Isolat 2)..... 17

5.2.2. Interpretasi spektrum IR eurikumanon (Isolat 2)....... 18

5.2.3. Interpretasi spektrum LC-MS ESI Ion Positif

eurikumanon (Isolat 2)..... .......................................... 19

5.2.4. Interpretasi spektrum 1

H-NMR eurikumanon (Isolat 2) 20

5.2.5. Interpretasi spektrum 13

C_NMR eurikumanon (Isolat 2) 21

5.3. Hasil Sintesis Turunan Eurikumanon .......................... 28

5.3.1. Eurikumanon triasetat ............................................... 28

5.3.2. Eurikumanon dibutirat ............................................... 29

5.3.3. Eurikumanon monovalerat ........................................ 29

5.3.4. Eurikumanon dimetoksibenzoat ................................ 29

5.3.5. Eurikumanon disuksinat ........................................... 29

5.4. Hasil Uji Aktivitas Antikanker Eurikumanon dan Turunannya 29

5.5. Indeks Selektivitas Eurikumanon dan Turunannya ....... 31

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan ..................................................... 34

6.2. Saran ..................................................... 35

DAFTAR PUSTAKA ..................................................... 36

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Gugus fungsional eurikumanon (isolat 2)

berdasarkan spektrum IR.................................... 19

Tabel 2. Nilai IC50 eurikumanon dan turunannya pada sel

normal (Vero) dan sel kanker (T47D, MCF-7, Hela

dan WIDR)......................................................... 30

Tabel 3. Nilai indeks selektivitas (IS) eurikumanon dan

turunannya pada sel kanker (T47D, MCF-7, Hela

dan WIDR)........................................................ 32

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur eurikumanon ................................. 3

Gambar 2. Bagan penelitian terhadap akar pasak bumi 10

Gambar 3. Bagan ekstraksi, fraksinasi, isolasi eurikumanon 11

Gambar 4. Bagan sintesis turunan eurikumanon ........... 12

Gambar 5. Bagan Uji Sitotoksisitas terhadap sel Vero.. 14

Gambar 6. Profil KLT-p eurikumanon (isolat 2) di bawah

Lampu UV pada λ 254 nm dengan fase diam

Silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat –

Etanol-air (100 : 30 : 1) .............................. 16

Gambar 7. Spektrum UV eurikumanon (isolat 2)......... 17

Gambar 8. Spektrum IR eurikumanon (isolat 2) .......... 18

Gambar 9. Kromatogram LC eurikumanon (isolat 2)... 20

Gambar 10. Spektrum MS eurikumanon (isolat 2) ........ 20

Gambar 11. Spektrum 13

C-NMR eurikumanon (isolat 2) 22

Gambar 12. Spektrum DEPT Slate eurikumanon (isolat 2) 23

Gambar 13. Spektrum 1H-NMR eurikumanon (isolat 2) 23

Gambar 14. Spektrum 1H-

1H-COSY eurikumanon (isolat 2) 24

Gambar 15. Spektrum HMQC eurikumanon (isolat 2)... 25

Gambar 16. Spektrum HMBC eurikumanon (isolat 2)... 26

Gambar 17. Korelasi HMBC eurikumanon (isolat 2)..... 27

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Penelitian

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) melaporkan kematian akibat penyakit

kanker sekitar 13% setiap tahunnya (WHO, 2010). Insidensi kanker terbanyak

adalah kanker payudara 22,9% dan kanker leher rahim (serviks) 8,8% dari total

kanker pada wanita (World Cancer Research Fund Internasional, 2008).

Permasalahan kanker semakin rumit, karena kebanyakan kasus dijumpai pada

stadium lanjut yang menyebabkan angka bertahan hidup (survival rate) rendah,

dan membutuhkan biaya mahal untuk penanganannya.

Secara umum keberhasilan terapi kanker relatif masih rendah, hal ini

disebabkan adanya keterbatasan dalam penggunaan antikanker terkait dengan

keamanannya, karena hampir semua antikanker selain membunuh sel kanker juga

menyebabkan kerusakan dan kematian pada sel-sel normal. Faktor biaya yang

mahal juga menjadi kendala utama dalam menurunkan morbiditas dan mortalitas

akibat kanker termasuk adanya resistensi terhadap antikanker. Oleh karena itu

diperlukan upaya penemuan dan pengembangan antikanker baru yang lebih

potensial, aman dan murah. Ada beberapa strategi dalam upaya penemuan dan

pengembangan antikanker baru, diantaranya melalui semisintesis, sintesis murni

dan eksplorasi bahan alam yang sudah terbukti khasiatnya (Gibbs, 2000).

Salah satu tumbuhan yang berkhasiat antikanker adalah akar tumbuhan

pasak bumi (Eurycoma longifolia, Jack), famili Simarubaceae. Akar tumbuhan ini

mengandung senyawa kuasinoid, alkaloid kantin-6-on, alkaloid β karbolin,

turunan triterpen trikullan, turunan skualen dan bifenolneolignan (Guo et al.,

2005; Kuo et al., 2004). Pasak bumi (E. longifolia Jack.) dinyatakan berkhasiat

sebagai tonik, afrodisiak, antikanker, antipiretik, antiulcer, antiinflammasi,

antidiabetes dan antimalaria (Kuo et al., 2003). Secara in vitro, ekstrak etanol akar

pasak bumi memiliki aktivitas antiproliferatif terhadap sel kanker payudara MCF-

7 dan T47D (Nurhanan, 2005; Nurani, et al., 2008). Penelitian ekstrak etanol akar

pasak bumi terhadap kanker payudara tikus yang diinduksi dengan DMBA

membuktikan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas antikanker (Nurani dan

Akrom 2009). Alkaloid β karbolin dan kuasinoid dari akar pasak bumi memiliki

khasiat antikanker (Kuo et al., 2003, Kardono et al 1991). Kuasinoid

eurikumanon dari akar pasak bumi asal Kalimantan terbukti memiliki aktivitas

antikanker terhadap sel karsinoma nasofaring dengan nilai IC50 1,9µg/mL,

fibrosarcoma 0,2µg/mL, melanoma 8,2µg/mL, kanker paru 14,3µg/mL, kanker

payudara 1,1µg/mL dan kanker kolon 1,2µg/mL (Kardono et al. 1991).

Pada penelitian ini eurikumanon dipilih sebagai senyawa target untuk

sintesis senyawa turunannya, karena daya hambat pertumbuhan sel kanker lebih

potensial dan senyawa ini terdapat dalam konsentrasi tinggi di dalam akar pasak

bumi (Chan et al., 2004). Tujuan sintesis turunan eurikumanon adalah untuk

mendapatkan senyawa baru yang kemungkinan memiliki potensi lebih baik dari

senyawa asal, spesifik, sensitif, aman, murah dan mudah digunakan. Pereaksi

untuk mensintesis turunan eurikumanon adalah asetilklorida, butanoilklorida,

valerilklorida, suksinat anhidrida dan metoksibenzoilklorida. Senyawa hasil

semisintesis akan diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap beberapa sel kanker

MCF-7, T47D, Hela, WIDR termasuk uji keamanannya terhadap sel Vero.

Penelitian tentang sintesis turunan eurikumanon sebagai antikanker sebatas

pengetahuan peneliti belum pernah dilakukan. Penelitian ini diharapkan akan

memberi kontribusi yang positif terhadap perkembangan terapi kanker dan

antikanker yang dihasilkan hendaknya sesuai dengan harapan serta berpeluang

besar untuk dipatenkan atau mendapatkan hak atas kekayaan intelektual (HAKI).

1.2. Permasalahan Penelitian

Berdasarkan hal-hal tersebut diatas, maka rumusan masalah penelitian

adalah:

1. Apakah hasil sintesis turunan eurikumanon dari eurikumanon akar pasak

bumi dengan senyawa pereaksi asetilklorida, butanoilklorida,

valerilklorida, suksinat anhidrida dan metoksibenzoil klorida memiliki

aktivitas antikanker terhadap sel Hela, MCF-7, T47D dan WIDR secara

in vitro ?

2. Bagaimana keamanan eurikumanon dan turunannya terhadap sel normal

(sel Vero) secara in vitro ?

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengembangan Antikanker Melalui Modifikasi Struktur

Kanker merupakan penyakit akibat rusaknya mekanisme pengaturan

perilaku sel yaitu mekanisme pertumbuhan dan differensiasi sel. Pada kanker sel-

sel tumbuh tidak terkendali dan menginvasi jaringan dan organ lainnya sehingga

terjadi gangguan pada situs yang bersangkutan. Terapi kanker saat ini adalah

secara kemoterapi, pembedahan, dan radioterapi yang relatif kurang efektif untuk

menurunkan tingginya insidensi, angka kematian dan meningkatkan angka

harapan hidup penderita. Oleh karena itu pengembangan terapi kanker merupakan

tantangan utama dalam riset kanker, salah satunya adalah upaya penemuan dan

pengembangan antikanker baru yang efektif, selektif dan aman.

Sintesis obat melalui modifikasi struktur kimia akan menghasilkan senyawa

dengan karakteristik yang berbeda sifat fisikokimia maupun sifat

farmakologisnya. Tujuannya adalah untuk mendapatkan senyawa yang lebih

potensial, spesifik, aman untuk dikembangkan sebagai obat baru atau

prekursornya (Lee dan Nguyen, 1993). Kar (2004) menyatakan bahwa perubahan

struktur molekul suatu senyawa akan menyebabkan adanya variasi dalam sifat

fisikokimia dan aktivitas farmakologisnya.

Eurikumanon merupakan kuasinoid pentasiklik yang dapat dimodifikasi

strukturnya melalui sintesis untuk mendapatkan turunannya yang diharapkan

memiliki aktivitas antikanker lebih potensial dari senyawa asal. Struktur kimia

eurikumanon ditunjukkan pada Gambar 1.

O

O

O

H H

OH

OH

HO

H

OH O

1

2

3

45

6

7

89

10

11

12

13

14

15

1617

18

1920

21

OH

Gambar 1. Struktur Eurikumanon

Karakteristik struktur kimia eurikumanon adanya α – β keton tidak jenuh

dan beberapa gugus OH yang sangat reaktif karena dapat berinteraksi dengan

senyawa pereaksi yang digunakan pada sintesis. Kerangka lakton pada

eurikumanon dapat berkonyugasi dengan senyawa yang bersifat nukleofilik.

Substitusi gugus OH pada atom C-1, C-12 dan C-15 dengan senyawa pereaksi

diperkirakan dapat meningkatkan aktivitas biologinya, karena adanya ikatan

hidrogen intramolekul antara gugus hidroksi (OH) dan oksigen (O) dari enone

pada cincin A, C dan D yang berperan sebagai akseptor nukleofil (Kupchan et al.,

1970).

Substitusi gugus OH pada eurikumanon dalam penelitian ini, dilakukan

tanpa memperhatikan pada posisi atom C yang mana substitusi terjadi. Hasil

sintesis diharapkan akan terbentuk turunan eurikumanon yaitu senyawa

eurikumanon asetat, eurikumanon butirat, eurikumanon valerat, eurikumanon

suksinat dan eurikumanon metoksibenzoat.

2.2. Aktivitas Antikanker Senyawa Kuasinoid dari Akar Pasak Bumi

Ekstrak metanol, butanol, dan kloroform akar pasak bumi memiliki efek

sitotoksik terhadap sel KB, DU-145, RD, MCF-7, CaOV-3, serta MDBK

(Nurhanan, et al., 2005). Eurikumanon dari ekstrak akar pasak bumi sangat

potensial sebagai antikanker dan strukturnya memiliki ikatan rangkap terkonjugasi

dan ikatan α-ß karbonil yang tidak jenuh (Jiwajinda, et.al., 1991; Jiwajinda, et.al.,

2002). Senyawa dengan kerangka seperti ini umumnya memiliki aktivitas

antioksidan yang kuat dan dapat digunakan sebagai penghambat proses

karsinogenesis (Meiyanto, 1999).

2.3. Studi Pendahuluan Yang Telah Dilaksanakan dan Hasil Yang Dicapai

Uji aktivitas ekstrak air, metanol dan kloroform akar pasak bumi (E.

longifolia) membuktikan bahwa ekstrak metanol akar pasak bumi memiliki

aktivitas antikanker pada kultur sel HeLa dengan nilai IC50 berkisar 46,9 – 58,6

μg/mL (Mustofa & Qamariah, 2004). Ekstrak etanol mempunyai potensi

antikanker dan antiproliferatif terhadap sel T47D dibandingkan ekstrak kloroform,

dan air (Nurani, et al., 2008).

Uji toksisitas akut ekstrak metanol akar pasak bumi pada mencit Swiss

diperoleh nilai LD50 sekitar 6128,71 mg/kgBB (Sholikhah & Wijayanti, 2009),

sedangkan pada tikus putih 7498,94 mg/kg BB (Mawaddah, 2011). Eurikumanon

dari ekstrak akar pasak bumi asal Kalimantan terbukti memiliki aktivitas

antikanker terhadap sel karsinoma nasofaring 1,9µg/mL, fibrosarcoma 0,2µg/mL,

melanoma 8,2µg/mL, kanker paru 14,3µg/mL, kanker payudara 1,1µg/mL dan

kanker kolon 1,2µg/mL (Kardono et al. 1991).

Modifikasi struktur kimia eurikumanon melalui semisintesis telah dilakukan

oleh Chan et al. (2005) yaitu 15-O-isovalerileurikumanon, 1,15-di-O-

isovalerileurikumanon, 1,15-di-O-3,3-dimetilakriloileurikumanon dan 1,15-di-O-

benzoileurikumanon. Senyawa-senyawa tersebut telah diuji aktivitasnya sebagai

antiplasmodium dan hasilnya menunjukkan bahwa senyawa monoasil

eurikumanon memiliki aktivitas antiplasmodium yang sebanding dengan aktivitas

eurikumanon, tetapi sitotoksisitasnya pada sel Vero lebih rendah, sedangkan

senyawa diasil eurikumanon menunjukkan aktivitas antiplasmodium dan

sitotoksisitasnya terhadap sel Vero yang lebih rendah dari eurikumanon.

Penelitian pengembangan senyawa aktif dari akar pasak bumi telah

dilakukan sejak tahun 2002 (Mustofa & Sholikhah, 2002). Kajian aktivitas

antikanker dan antimalaria secara in vitro dan in vivo dari berbagai ekstrak akar

pasak bumi telah membuktikan bahwa fraksi mengandung eurikumanon

merupakan fraksi aktif, baik sebagai antimalaria maupun sebagai antikanker.

Yusuf et al. (2013) telah mengisolasi, mengidentifikasi dan membuktikan 4

senyawa dari ekstrak akar pasak bumi sebagai antimalaria in vitro. Pada penelitian

ini senyawa eurikumanon dari akar pasak bumi disintesis turunannya untuk diuji

aktivitasnya sebagai antikanker secara in vitro.

BAB 3

TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1. Tujuan Penelitian

Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menemukan senyawa

antikanker baru dari turunan eurikumanon dan secara khusus bertujuan untuk :

1. Mengkaji hasil sintesis turunan eurikumanon sebagai antikanker

terhadap sel Hela, MCF-7, T47D dan WIDR secara in vitro

2. Mengkaji keamanan eurikumanon dan turunannya terhadap sel Vero

secara in vitro.

3.2. Manfaat Penelitian

1. Penelitian ini diharapkan bermanfaat dalam upaya mendapatkan

antikanker baru turunan eurikomanon

2. Hasil penelitian ini memiliki potensi untuk dipatenkan atau mendapatkan

hak atas kekayaan intelektual (HAKI).

3. Secara konseptual keilmuan, penelitian ini penting karena dapat

mengungkapkan bukti-bukti ilmiah tentang aktivitas senyawa turunan

eurikumanon sebagai antikanker.

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1. Jenis, Rancangan dan Subyek Penelitian

Isolasi eurikumanon dari serbuk akar pasak bumi (E. longifolia, Jack.),

semisintesis dan analisis struktur eurikumanon dan turunannya merupakan

penelitian eksploratif. Uji aktivitas antikanker dan sitotoksisitas terhadap sel Vero,

merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan menggunakan “post-test

only with control group design”. Subyek penelitian menggunakan sel kanker

(Hela, MCF-7, T47D, WIDR) dan sel Vero.

4.2. Tempat Penelitian

Proses ekstraksi, fraksinasi, isolasi, sintesis turunan eurikumanon akan

dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan Terapeutik FK Unsyiah Banda Aceh,

sedangkan uji aktivitas antikanker akan dilakukan di Laboratorium Parasitologi

FK UGM Yogyakarta.

4.3. Bahan – Bahan Penelitian

1. Akar pasak bumi yang digunakan diambil dari tumbuhan yang berumur 6

tahun yang tumbuh di Hutan Taman Pendidikan Fakultas Kehutanan

Universitas Lambung Mangkurat, Banjar Baru Kalimantan Selatan. Akar

tersebut telah dideterminasi oleh ahli biologi farmasi di Laboratorium

Farmakognosi yaitu : Prof. Dr. Wahyono, SU, Apt dengan nomor spesimen

BF/123/Ident/Det/III/2010.

2. Bahan-bahan untuk proses ekstraksi, fraksinansi, isolasi dan identifikasi

senyawa eurikumanon adalah serbuk akar pasak bumi, eurikumanon standar

(Chromadex, Inc), metanol (Merck), kloroform (Merck), etil asetat (Merck),

etanol (Merck), akuades, plat aluminium silika gel GF254 (Merck), silika gel

60 (Merck), dan silika gel 60 PF254 (Merck).

3. Bahan-bahan untuk proses sintesis turunan eurikumanon adalah

eurikumanon dari akar pasak bumi, asetil klorida (Merck), butiril klorida

(Sigma), valeril klorida (Sigma), para-metoksibenzoil klorida (Sigma)

suksinat anhidrida (Sigma), piridin (Merck), kloroform (Merck), natrium

sulfat anhidrat (Merck), akuades, etil asetat (Merck), natrium klorida, asam

klorida (Merck), etanol (Merck), dan metanol (Merck).

4. Bahan-bahan untuk uji aktivitas antikanker dan sitotoksisitas secara in vitro

adalah eurikumanon, turunan eurikumanon, Sel Hela, MCF-7, T47D,

WIDR, Vero, medium RPMI 1640 (Sigma), HCl (Merck), NaOH (Merck)

HEPES (Sigma), Phosphat Buffer Saline (Gibco) Fungizon (Gibco),

Doksorubisin (Dexa Medica), Fetal Bovine Serum (Sigma), Penisillin-

Streptomisin (Gibco), akuades steril (Kimia Farma), dimetil sulfoksida

(Merck), etanol (Merck), medium M199, thiazolil blue tetrazolium bromide

(MTT), SDS (sodium dodesil sulfat) dan HCl 0,01M.

5. Bahan-bahan untuk identifikasi struktur adalah metanol terdeteurisasi

(CD3OD), kloroform terdeteurisasi (CDCl3), tetrametilsilan, eurikumanon

dan turunannya.

4.4. Alat-Alat Penelitian

1. Alat-alat untuk ekstraksi, fraksinasi, isolasi dan sintesis adalah timbangan

listrik (Sartorius), alat ekstraktor, vacum rotary evaporator, alat-alat gelas,

corong Buchner, alat-alat untuk KLTp, alat-alat untuk KCV, pipa kapiler,

oven, termometer, penangas es, labu leher tiga, statif, pendingin bola,

pengaduk magnetik, lampu UV, kertas saring, lempeng kaca ukuran 20 x 20

cm dan rak untuk lempeng kaca.

2. Alat-alat untuk identifikasi turunan eurikumanon dengan spesifikasi sebagai

berikut spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 240, FTIR Shimadzu 8300 PC;

NMR spektrofotometer JEOL JNM A-500 yang bekerja pada 500MHz (1H-

NMR) dan 125MHz (13

C-NMR) dan LC-MS Mariner Biospektrometri

Hitachi L 6200 dengan sistem ESI (Electrospray Ionisation) Positive Ion.

3. Alat-alat untuk uji aktivitas antikanker dan sitotoksisitas secara in vitro

adalah candle jar (desikkator), lilin cap benteng, filter 0,22 µm (Millex),

incubator (NAPCO) Model 6200, laminar air flow cabinet (Lab Conco,

Purifier Delta Series 36213), culture flask (Nalgene Nunc International,

Denmark), centrifuge eppendorf (seri 5415 D, Jerman), pipet steril, tabung

steril, tabung nitrogen cair (Thermolyne, Biocane TM 4

7 cane), wing INT

Terumo No 19, micropipet (Autoclavable, Nichipet, Japan), microplate

dengan 96 sumuran (Nalgene Nunc International, Denmark), screw capped

conical tubes (Sterilin, Ltd, UK), tabung eppendorf, blue tip, yellow tip,

glass obyek, timbangan listrik, hemositometer (Newbauer), vortex (Genie),

alat-alat gelas dan microscope convocal (Nikon YS 100), Elisa Reader (Bio-

Rad Benchmark Jepang) dan mikroskop.

4.5. Cara Penelitian

4.5.1. Ekstraksi , Fraksinasi dan Isolasi Senyawa Eurikumanon

Isolasi eurikumunanon diawali dengan ekstraksi serbuk akar pasak bumi

secara maserasi dengan metanol, kemudian divakum evaporasi sampai diperoleh

ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental, difraksinasi dengan kloroform-metanol

menggunakan metode Simplex Lattice Design (SLD). Fraksi yang mengandung

eurikumanon dikumpulkan dan diisolasi eurikumanonnya secara kromatografi

lapisan tipis preparatif (KLT-p). Eurikumanon yang diperoleh dimurnikan dan

ditentukan struktur kimianya secara analisis spektroskopi 1D dan 2D. Bagan

isolasi senyawa eurikumanon dari akar pasak bumi disajikan dalam Gambar 3.

UV NMR

Uji antioksidan

MS

IR

Akar Pasak Bumi

Keterangan: Tulisan tebal sudah dilakukan (bold)

Tulisan biasa belum dilakukan

UV Determinasi, Ekstraksi

Fraksinasi, Isolasi dan

purifikasi

IR

RR

R NMR

Identifikasi struktur

Isolat 2 (Eurikumanon)

Eurikumanon dan 3 isolat

lain

MS

Penelitian: Uji aktivitas antimalaria 4

isolat dari ekstrak akar pasak bumi

Uji aktivitas antiplasmodium

Uji mekanisme aksi antimalaria dan

antikanker

Uji Toksisitas akut EAPB

MS

Eurikumanon Hasil Isolasi dari Ekstrak Akar Pasak Bumi

(Eurycoma longifolia, Jack), Uji Aktivitas Antimalaria dan

Antikanker Secara In Vitro

Semisintesis Eurikumanon dengan pereaksi asetilklorida, butanoilklorida, valerilklorida,

klorbenzoilklorida dan metoksibenzoilklorida, uji aktivitas sebagai antikanker secara In Vitro

Rekomendasi struktur yang rasional, uji aktivitas dan keamanan antikanker dan

antimalaria secara in vivo pada hewan coba

Pengembangan struktur turunan eurikumanon dan analisa hubungan antara struktur-

aktivitasnya sebagai antikanker dan antimalaria

Uji sitotoksisitas pada sel Vero

Kajian Farmakokinetika Turunan Eurikumanon pada Hewan Coba

UJI KLINIK TAHAP I

Gambar 2. Bagan Penelitian Terhadap Akar Pasak Bumi

Identifikasi isolat, 1, 3 dan 4

Maserasi, MeOH (5 liter), 5 X

Vakum evaporasi

PemurnianKLT-p

Gambar 3. Bagan Ekstraksi, Fraksinasi dan Isolasi Eurikumanon

4.5.2. Sintesis Turunan Eurikumanon

Sejumlah eurikumanon dimasukkan ke dalam labu leher tiga yang

dilengkapi dengan pendingin bola yang terhubung dengan air keran, termometer,

corong penetes, pengaduk magnetik dan penangas es. Eurikumanon dilarutkan

dengan 1 mL piridin, lalu ditambah senyawa pereaksi (asetilklorida, butanoil

klorida, valerilklorida, suksinilanhidrida dan metoksibenzoil klorida) di dalam

10mL kloroform. Campuran ini direfluks selama beberapa jam, bila telah

terbentuk produk, didinginkan dan ditambah 10 mL HCl 2 M. Selanjutnya

Identifikasi Serbuk

Akar Pasak Bumi Filtrat

Ekstrak kental Akar Pasak Bumi

Monitor eurikumanon, KLT, SUV

Isolat Eurikumanon dikerok

secara terpisah dan

dimurnikan

Eurikumanon dan turunannya digunakan untuk uji aktivitas

antikanker,sitoksisitasnya terhadap sel Vero secara in vitro dan identifikasi struktur

kimianya ditentukan melalui analisa spektroskopi SUV, IR, NMR dan MS

Monitor eurikumanon, KLT, SUV

Fraksi2 mengandung eurikumanon

dikumpulkan

Eurikumanon murni

digunakan untuk semisintesis

KCV, FG KMA gradien polaritas

Monitor eurikumanon, KLT, SUV

Bukti kemurnian secara KLT dan analisa

spektroskopi 1D dan 2D

Pereaksi asetilklorida, butanoilklorida,

valerilklorida, suksinat anhidrida dan

metoksibenzoilklorida

Serbuk Kering Akar Pasak Bumi (1 kg)

diekstraksi dengan etilasetat, lalu lapisan etilasetat dicuci dengan 10mL air.

Selanjutnya lapisan etilasetat ditambah natrium sulfat anhidrat dan dikeringkan.

Bagan semisintesis turunan eurikumanon ditunjukkan pada Gambar 4.

1. ( T= 00C, aduk-aduk, 1 jam, penangas es

2.

Pereaksi + 10 mL CHCl3

Refluks, ± 8 jam, T= 600C, KLT monitoring

HCl 2M, 10mL

Ekstraksi dengan Etil asetat

Lapisan Etil asetat dicuci dengan Akuades

Pisahkan lapisan Akuades dan Etil asetat

3. Loform

Gambar 4. Bagan Sintesis Turunan Eurikumanon

4.5.3. Uji Aktivitas Antikanker Turunan Eurikumanon

1.Kultur Sel kanker

Sel kanker (Hela, MCF-7, T47D, WIDR) dan sel Vero diambil dari tangki

nitrogen cair, dicairkan pada suhu 37oC, lalu dimasukkan ke dalam conical tube

dan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit di dalam ruang laminair

air flowt. Endapan sel ditambah media penumbuh, kemudian dipindahkan ke

dalam culture flask dan diinkubasikan dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.

Setiap hari perkembangbiakan sel kanker dan Vero diamati dan media penumbuh

diganti dengan media baru. Suspensi sel dibagi menjadi beberapa kultur dalam

culture flask steril, lalu diinkubasi dalam inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC.

Campuran Eurikumanon

+ 1 mL Piridin

Turunan eurikumanon

Lapisan Etil asetat Residu

Natrium sulfat anhidrat

2. Panen sel

Setelah jumlah sel cukup, medium diganti dengan medium baru dan sel

dilepas dari dinding culture flask, kemudian dipindahkan ke dalam conical tube

steril dan ditambah medium PBS sampai volume 10 ml. Selanjutnya disentrifus

pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Kemudian sel dicuci 2 kali

menggunakan medium yang sama, dan dihitung jumlah selnya menggunakan

hemocytometer. Lalu suspensi sel ditambah dengan sejumlah medium sampai

diperoleh konsentrasi 5 x 104 sel/100 l dan sel ini siap digunakan untuk uji .

3. Pembuatan Larutan Uji Turunan Eurikumanon

Pembuatan larutan uji dilakukan secara aseptis dimulai dengan larutan stok

yang dibuat dengan melarutkan masing-masing senyawa uji 10 mg dalam 100 uL

DMSO pro kultur. Selanjutnya dibuat serial konsentrasi larutan uji dalam media

penumbuh dan uji disaring dengan filter 0,2 m ke dalam conical tube steril.

4. Uji Aktivitas Antikanker

Sel Hela, MCF-7, T47D dan WIDR yang telah dikulturkan dalam media

DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin, dimasukkan ke dalam sumuran

mikroplat dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam bersama

senyawa uji dan doxorubicin dalam serial konsentrasi tertentu. Pada akhir

inkubasi, kepada masing-masing sumuran ditambahkan 10 l MTT kadar 5

mg/ml. Kemudian diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37o C. Sel yang hidup

akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Reaksi MTT dihentikan

dengan reagen stopper SDS 10 % dalam 0,01 % HCl sebanyak 100 ul, lalu

diinkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada

panjang gelombang 550 nm.

Analisis statistik pada uji aktivitas antikanker menggunakan analisis

regresi probit untuk menentukan nilai IC50 dari masing-masing senyawa. Analisis

regresi probit diperoleh dari konversi persentase viability cells, yang dihitung

dengan menggunakan rumus :

% viability cells = [(A-B)/(C-B) ] x 100 %

A : Absorbansi perlakuan

B : Absorbansi medium

C : Absorbansi sel kontrol

4.5.4. Uji Sitotoksisitas Turunan Eurikumanon Terhadap Sel Vero

Cara kultur sel Vero sama dengan sel kanker, uji sitotoksisitas terhadap sel

Vero menggunakan mikroplat 96 sumuran dengan cara memasukkan 100µl media

komplit yang mengandung 10.000 sel Vero. Mikrokultur diinkubasi selama 24

jam pada suhu 370C di dalam inkubator 5% CO2. Setelah itu 100µl senyawa uji

dari berbagai konsentrasi ditambahkan dan sebagai kontrol negatif adalah

sumuran yang mengandung sel Vero dengan media komplit dan sumuran berisi

media. Mikrokultur tersebut diinkubasi kembali selama 24 jam pada temperatur

370C dalam inkubator 5% CO2.

Setelah itu media dibuang, lalu ditambahkan 100µl media komplit dan 10µl

thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT 5mg/ml) dan diinkubasi selama 4 jam

pada temperatur 370C dalam inkubator 5% CO2. Selanjutnya ditambahkan 100µl

SDS dalam HCl 0,01 % ke dalam mikroplat dan diinkubasi kembali selama 18

jam pada temperatur kamar dan absorbansinya dibaca (untuk sel hidup) dengan

Elisa reader pada panjang gelombang 595nm. Analisa statistik sama seperti pada

uji aktivitas antikanker. Bagan uji sitotoksisitas (antikanker) terhadap sel MCF-7,

T47D, Hela, WIDR dan sel Vero secara umum ditunjukkan pada Gambar 5.

Gambar 5. Bagan Uji Sitotoksisitas (Keamanan) Terhadap Sel Vero

100 µl media komplit (10.000 sel kanker dan sel Vero)

/sumuran, diinkubasi CO2, 370C , 24 jam

Tambahkan 100 µl obat uji, kontrol negatif sel Vero + media komplit,

sumuran berisi media komplit, diinkubasi CO2, 370C, 24 jam

Media dibuang

Tambah 100 µl media komplit dan 10 µl MTT, diinkubasi CO2, 370C, 4 jam

Tambah 100 µl SDS 10% dalam HCl 0,01 %, diinkubasi pada temperatur kamar , 18 jam.

Baca absorbansi dengan Elisa Reader pada panjang gelombang 595 nm

BAB 5

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Isolasi Eurikumanon dari Akar Pasak Bumi

Proses isolasi eurikumanon diawali dengan maserasi akar pasak bumi

dengan metanol. Ekstrak cair yang diperoleh, divakumevaporasi pada temperatur

400C. Ekstrak kental yang diperoleh 60 g (6%) dan keberadaan eurikumanon

dipantau secara KLT dengan menggunakan plat aluminium silika gel GF254 yang

dielusi dengan fase gerak yang terdiri dari kloroform : metanol : air (6,5 : 2,5 :

0,4), lalu hasilnya dibandingkan dengan eurikumanon standar dari Chromadex

Inc. Hasil pemantauan menunjukkan bahwa ekstrak akar pasak bumi mengandung

eurikumanon yang ditandai dengan adanya bercak berfluoresensi warna ungu

yang sejajar dengan bercak eurikumanon standar dari Chromadex Inc dibawah

lampu UV pada λ 254 nm dan tidak berpendar pada λ 366 nm.

Proses isolasi eurikumanon dari ekstrak tersebut dilakukan secara bertahap

melalui fraksinasi dengan fase gerak yang berbeda-beda polaritasnya secara

kromatografi cair vakum dengan fase diam silika gel G60 dan 110 mL fase gerak

yang terdiri dari kloroform : metanol : air dalam ratio perbandingan 5:5:1; 3:7:1;

1:9:1. Hasil fraksinasi 6 fraksi (fraksi I, II, III, IV, V dan VI), dan masing-masing

fraksi ditampung di dalam cawan porselin sebanyak 50 mL. Hasil pemantauan

terhadap fraksi-fraksi ini, diperoleh bahwa eurikumanon terkonsentrasi pada

fraksi I dan II, lalu kedua fraksi ini digabung dan dievaporasi dan diperoleh fraksi

eurikumanon 25 g (2,5%).

Isolasi eurikumanon dari fraksi eurikumanon (FE) dilakukan secara KLT-p

dengan menotolkan fraksi tersebut dalam bentuk pita pada lempeng kaca silika gel

GF254 ukuran 20 X 20 cm, lalu dielusi dengan fase gerak yang terdiri dari

kloroform : metanol: air (80: 30). Hasil pemantauan menunjukkan bahwa ada pita

berfluoresensi warna biru terang yang ditandai sebagai isolat 1 dan pita berwarna

ungu sebagai isolat 2 yang diduga sebagai eurikumanon dibawah lampu UV pada

λ 254 nm dan pada λ 366 nm isolat 1 terlihat berupa pita berfluoresensi warna

biru, sedangkan isolat 2 tidak berpendar.

Kedua isolat tersebut dikerok secara terpisah yang diawali oleh isolat 2

karena isolat tersebut diperkirakan eurikumanon. Pemurnian dilakukan secara

KLTp menggunakan fase gerak kloroform : metanol : air (80 : 30). Hasilnya isolat

2 memperlihatkan satu pita di bawah lampu UV pada λ 254 nm, tetapi dibawah

lampu UV λ366 nm memperlihatkan 2 pita yang sangat rapat yaitu pita berwarna

kuning kecoklatan yang diberi tanda dengan isolat 3. Pemurnian isolat 2 dilakukan

berulang kali menggunakan fase gerak yang sama dengan berbagai rasio

perbandingan yang tujuannya untuk memisahkan isolat 2 dari isolat 3, ternyata

isolat tersebut tetap sulit dipisahkan meskipun sudah dilakukan dengan multiple

elution system.

Isolat 3 yang berdekatan dengan isolat 2 dipisahkan dengan menggunakan

fase gerak yang terdiri dari etilasetat : etanol : air dengan perbandingan 100 : 30 :

1. Pada penggunaan fase gerak ini diperoleh bercak isolat 2 berupa satu pita yang

berfluoresensi warna ungu dengan nilai retensi faktor (Rf) = 0,72 dan dapat

dianggap sudah murni bila isolat tersebut tetap menunjukkan satu pita dengan tiga

jenis fase gerak. Kadar isolat 2 yang diperoleh sekitar 0,04% (Gambar 6).

Gambar 6. Profil KLTp eurikumanon (isolat 2) di bawah lampu UV λ 254 nm

dengan fase diam silika GF254 dan fase gerak yang terdiri dari

etilasetat : etanol : air (100 : 30 : 1)

5.2. Identifikasi Struktur Kimia Eurikumanon (Isolat 2)

Isolat 2 yang diduga sebagai eurikumanon diidentifikasi strukturnya melalui

analisis spektroskopi UV, IR, NMR-1D dan 2D serta LC-MS ESI ion positif. Data

berupa spektra UV, IR, 1H-NMR,

13C-NMR, DEPT dan LC-MS ESI ion positif

diperkuat dengan data analisis spektroskopi 2D yaitu, COSY, HMQC dan HMBC.

Hasil interpretasi dibandingkan dengan data referensi eurikumanon yang

diidentifikasi oleh peneliti lain seperti Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991);

Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004) ternyata hasilnya sesuai dengan struktur

eurikumanon.

5.2.1. Interpretasi spektrum UV eurikumanon (isolat 2)

Spektrum UV isolat 2 memberikan serapan maksimum pada 237,5 nm

(Gambar 7). Spektrum tersebut menjelaskan bahwa isolat 2 tidak banyak memiliki

ikatan rangkap atau ikatan tidak jenuh, sehingga serapan energi

elektromagnetiknya berada di daerah ultraviolet. Hal ini sejalan dengan profil

KLT-p yang hanya berfluoresensi warna ungu di bawah lampu UV pada λ 254

nm dan tidak berpendar pada 366 nm.

Gambar 7. Spektrum UV eurikumanon (isolat 2)

5.2.2. Interpretasi spektrum IR eurikumanon (isolat 2)

Analisis spektrum IR isolat 2 (Gambar 8) memberi gambaran berupa pita

serapan pada bilangan gelombang tertentu (Tabel 1). Pita melebar pada 3379,29

menunjukkan bahwa isolat 2 memiliki gugus OH, sedangkan pita pada 1732,08

adalah serapan gugus karbonil (C=O) dari lakton. Hal ini dipertegas pita pada

1055,06 yang mengindikasikan adanya gugus -C-O-C. Gugus keton (C=O) tidak

jenuh α, β terlihat pada 1674,21 dan gugus C=C terdapat pada 1650. Absorpsi

ikatan rangkap Csp2-H (CH2 alifatik) yaitu gugus metilen terdapat pada 2980,02

dan dipertegas oleh serapan pada 1518,33. Gugus CH3 alifatik terdapat pada

2879,72 yaitu gugus metil dan diperkuat oleh adanya serapan pada 1381,03. Hasil

analisis spektroskopi IR menyatakan bahwa isolat 2 memiliki gugus fungsional

OH, C=O, -C-O-C-, C=C, -CH2 dan –CH3 pada struktur kimianya dan hal ini

sesuai dengan struktur kimia senyawa eurikumanon. Gugus fungsi yang diperoleh

pada penelitian ini ternyata sesuai dengan yang didapat oleh Chan et al. (1986);

Kardono et al. (1991); Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004).

Gambar 8. Spektrum IR eurikumanon (isolat 2)

Tabel 1. Gugus fungsional eurikumanon (isolat 2) berdasarkan spektrum IR

No Bilangan gelombang (cm-1

) Gugus fungsional

1. 3379,29 Hidroksil (OH)

2. 2980,02; 1518,33 Hidrokarbon alifatik (Csp2-H), -CH2

3. 2879,72; 1381,03 Hidrokarbon alifatik (Csp3-H), -CH3

4. 1732,08 C = O lakton

5. 1674,21 C = O keton tidak jenuh α, β

6. 1618,28 C = C

7. 1055,06 -C-O-C-

5.2.3. Interpretasi spektrum LC-MS ESI ion positif eurikumanon (isolat 2)

Kromatogram LC memberi informasi bahwa isolat 2 belum murni (Gambar

9). Puncak pada waktu retensi 2,4 menit diduga berasal dari isolat 2. Analisis

spektrum MS (Gambar 10) memberi informasi bahwa isolat 2 memiliki puncak

ion molekul semu pada m/z 409,02 [M+H)+ (Eichhorn and Knepper, 2001).,

sehingga bobot molekulnya adalah 408,02 dengan formula C20H24O9. Hal ini

sesuai dengan yang diperoleh Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991); Tada et

al. (1991) dan Kuo et al. (2004).

Gambar 9. Kromatogram LC eurikumanon ( isolat 2)

Gambar 10. Spektrum MS eurikumanon (isolat 2)

5.2.4. Interpretasi spektrum 1H-NMR eurikumanon (isolat 2)

Analisis spektroskopi NMR merupakan analisis yang sangat penting dalam

menentukan kerangka struktur kimia suatu senyawa, karena spektra yang muncul

memberi gambaran tentang jumlah dan jenis atom hidrogen maupun karbon

(Pavia et al., 2009; Mistry, 2009). Identifikasi isolat 2 dilakukan secara

spektroskopi NMR satu dimensi (1H-NMR,

13C-NMR, DEPT) dan dua dimensi

(COSY, HMQC, HMBC). Spektrum 13

C-NMR isolat 2 (Gambar 11)

memperlihatkan adanya 20 signal resonansi yang memberikan informasi adanya

20 atom karbon. Spektrum DEPT (Gambar 12) memberi informasi bahwa isolat 2

memiliki 8 atom karbon kuarterner, 7 gugus metin, 3 metilen dan 2 gugus metil.

Secara garis besar data tersebut sesuai dengan struktur eurikumanon.

Signal yang paling downfield (δ 6,06, 1H) pada spektrum 1H-NMR (Gambar

13) merupakan resonansi proton posisi 3 cincin 3-sikloheksen-2on (cincin A).

Dua signal masing-masing dengan tinggi integrasi 1H yang muncul pada δ 5,56

dan 5,44 berasal dari dua proton metilen terminal pada posisi 21 yang tidak

ekivalen. Proton metin pada posisi 7 yang terikat pada oksigen δ-lakton yang

muncul pada δ 4,80 (1H) berupa triplet (J = 2,6 Hz), karena mengadakan kopling

dengan dua proton metilen pada posisi 6. Signal resonansi pada δ 4,73; 4,31; dan

3,96 masing-masing berupa singlet (1H) berturut-turut berasal dari proton metin

hidroksi pada posisi 12; 1 dan 15. Dua buah doublet masing-masing dengan

tetapan kopling 9,1 Hz dan tinggi integrasi 1H pada δ 3,89 dan 3,74 merupakan

signal resonansi proton metilen yang tidak ekivalen pada cincin tetrahidrofuran

posisi 20. Proton metin pada posisi 9 muncul singlet (1H) pada δ 3,07, sedangkan

proton metin pada posisi 5 muncul sebagai doublet (broad) pada δ 3,03. Dua buah

multiplet (1H) yang muncul pada δ 2,07 dan 2,34 merupakan signal resonansi dua

proton metilen pada posisi 6, sedangkan 2 buah singlet (3H) pada δ 2,03 dan 1,20

berasal dari dua buah gugus metil pada posisi 18 dan 19.

5.2.5. Interpretasi spektrum 13

C-NMR eurikumanon (isolat 2)

Pada spektrum 13

C-NMR, signal pada 198,95 dan 174,65 berturut-turut

merupakan resonansi gugus karbonil keton pada posisi 2 dan karbonil lakton pada

posisi 16. Resonansi empat karbon oleifenik pada posisi 3 dan 4 serta 13 dan 21

berturut-turut muncul pada δ 126,04; 165,26; 146,23; serta 121,64. Karbon metin

hidroksi (C-1, C-12, C-14, dan C-15) memperlihatkan resonansinya berturut-turut

pada δ 84,40; 80,92; 79,44 dan 71,82. Karbon metin hidroksi pada posisi 11 yang

terikat pada oksigen tetrahidrofuran muncul pada δ 109,27. Signal resonansi

karbon metin hidroksi yang terikat pada oksigen δ lakton muncul pada δ 77,19.

Signal yang muncul pada δ 53,21; 48,12 dan 46,58 berasal dari 3 karbon

kuarterner pada posisi 8, 9 dan 10, sedangkan karbon metin (C-5), metilen (C-6)

dan 2 karbon metil (C-18 dan C-19) berturut-turut muncul pada δ 42,90; 26,19;

23,01 dan 10,14.

Pada spektrum 1H-

1H COSY (Gambar 14), adanya cross peak antara signal

resonansi proton pada δ 5,43 dan 5,55; δ 3,73 dan 3,89 serta δ 2,02 dan 2,28

memperlihatkan adanya kopling geminal berturut-turut antara H-21a dengan H-

21b; H -20a dengan H-20b dan H-6a dengan H-6b. Kopling visinal terdapat antara

H-5 dan H-6a serta H-7 dengan H-6a dan H-6b terlihat dengan adanya cross peak

berturut-turut antara signal resonansi pada δ 3,03 dengan δ 2,02; δ 4,79 dengan δ

2,02 dan δ 2,28.

Verifikasi kerangka eurikumanon dapat dilihat pada spektrum HMBC

(Gambar 15) yang menggambarkan korelasi antara 1H-

13C dan beberapa korelasi

penting yang mendukung kerangka karbon eurikumanon dapat dilihat pada

Gambar 16 dan 17. Keberadaan cincin sikloheksenon (cincin A) ditunjukkan

dengan adanya korelasi antara signal resonansi H-3 dengan C-1, C-5 dan C-18;

signal H-1 dengan C-2, C-5, C-9 dan C-10 serta H-5 dengan C-4. Adanya kopling

sejauh tiga ikatan antara H-7 dengan C-5 dan C-9, H-6b dengan C-7 dan C-8 serta

adanya long range coupling antara H-6b dengan C-9 memberi konfirmasi bahwa

terdapat cincin sikloheksana (cincin B), sedangkan keberadaan cincin C

(sikloheksena) yang mengandung metilen terminal ditunjukkan dengan adanya

korelasi antara signal resonansi H-21a dengan C-14 serta korelasi antara H-21b

dengan C-13 maupun C-14.

Korelasi antara H-15 dengan C-14 menunjukkan keberadaan cincin δ lakton

(cincin D), sedangkan adanya kopling antara H-20a dengan C-7 dan C-14 dan

antara H-20b dengan C-8, C-9 dan C-14 memberi informasi adanya cincin

tetrahidrofuran (cincin E). Berdasarkan analisis spektroskopi tersebut di atas,

maka dapat dipastikan bahwa isolat 2 adalah eurikumanon. Data yang diperoleh

pada penelitian ini ada kemiripan dengan data yang dilaporkan Kardono et al.

(1991); Kuo et al. (2004), Tada et al. (1991) dan Chan et al. (1986).

Gambar 11. Spektrum 13

C-NMR eurikumanon ( isolat 2)

Gambar 12. Spektrum DEPT slate eurikumanon (isolat 2)

Gambar 13. Spektrum 1H-NMR eurikumanon (isolat 2)

5.3. Hasil Sintesis Turunan Eurikumanon

Penemuan obat melalui skrining bahan-bahan alam memberi peluang untuk

mendapatkan senyawa penuntun dengan struktur molekul baru. Senyawa tersebut

dapat dikembangkan untuk mendapatkan turunannya yang mempunyai aktivitas

lebih baik, selektif dengan toksisitas yang lebih rendah. Eurikumanon memiliki

struktur molekul unik yang berbeda dengan antikanker lainnya. Senyawa ini

mempunyai gugus alkohol alisiklik yang dapat diesterifikasi. Bentuk ester tersebut

akan menurunkan polaritas, apalagi bila gugus asilnya mempunyai rantai yang

panjang. Obat-obat dengan polaritas rendah (non polar) tidak terionisasi, sehingga

penetrasinya mudah ke dalam membran lipid menuju target site pada reseptor.

Gugus alkohol alisiklik dari eurikumanon dapat diesterifikasi dengan

asilklorida dan anhidrida asam karboksilat. Esterifikasi ini dilakukan dengan

mereaksikan eurikumanon yang telah dilarutkan di dalam piridin pada temperatur

sangat rendah (00C) dengan asetilklorida, butirilklorida, valerilklorida,

metoksibenzoilklorida dan suksinatanhidrida. Esterifikasi pada gugus alkohol

alisiklik ini dapat terjadi lebih dari satu, karena eurikumanon memiliki lima

gugus OH alisiklik. Reaksi tersebut terbentuk pada gugus OH eurikumanon

dengan oksigen dari asilklorida atau dan anhidrida asam karboksilat. Pada reaksi

ini oksigen karbonil dari asilklorida dan anhidrida asam karboksilat akan

mengalami protonisasi sehingga sangat peka terhadap serangan nukleofil

(nucleophilic attack).

5.3.1. Eurikumanon triasetat

Esterifikasi terhadap eurikumanon menggunakan asetilklorida, diawali

dengan serangan nukleofil gugus OH eurikumanon ke gugus oksigen karbonil

asetilklorida yang sangat reaktif dan menghasilkan senyawa intermediet

tetrahedral. Selanjutnya pasangan elektron dari oksigen memaksa keluar gugus

pergi (klorida) dan menghasilkan eurikumanon triasetat. Eurikumanon triasetat

yang dihasilkan berupa kolloid berwarna kuning muda, berbau aromatis dengan

titik lebur antara 225-2270C. Reaksi tersebut menghasilkan rendemen rata-rata

65,25%. Formula eurikumanon triasetat adalah C26H30O12 dengan BM 534,58.

5.3.2. Eurikumanon dibutirat

Reaksi esterifikasi antara eurikumanon dan butirilklorida menghasilkan

senyawa eurikumanon dibutirat berupa kolloid berwarna kuning kecoklatan,

berbau aromatis dengan titik lebur 241-2430C. Reaksi tersebut memberi hasil rata-

rata 60,35%. Formula eurikumanon dibutirat adalah C28H36O11 dan BM 548,94.

5.3.3. Eurikumanon monovalerat

Reaksi esterifikasi antara eurikumanon dengan valeril klorida menghasilkan

eurikumanon monovalerat berupa senyawa berwarna kuning muda, berbau khas

dengan titik lebur antara 235-2370C dan rendemen rata-rata 55,10%. Formula

eurikumanon monovalerat adalah C25H32O10 dan BM 492,82.

5.3.4. Eurikumanon dimetoksibenzoat

Reaksi sintesis antara eurikumanon dan para-metoksibenzoilklorida

menghasilkan eurikumanon dimetoksibenzoat berupa serbuk berwarna putih,

berbau aromatis dengan titik lebur antara 225-2280C. Reaksi tersebut memberi

hasil rata-rata 50,10%. dengan formula C36H36O13 dan BM 676.

5.3.5. Eurikumanon disuksinat

Reaksi sintesis antara eurikumanon dengan suksinatanhidrida menghasilkan

eurikumanon disuksinat, berupa senyawa berwarna kuning muda, berbau aromatis

dengan titik lebur antara 251-2540C. Rendemen yang diperoleh rata-rata 65,25%

dengan formula C28H30O15 dan BM 606,86.

5.4. Hasil Uji Aktivitas Antikanker

Hasil uji antikanker eurikumanon dan turunannya melalui hambatan

pertumbuhan sel kanker T47D, MCF-7, Hela, WIDR dan sel normal Vero

diperoleh nilai IC50 yang berbeda-beda (Tabel 1). Perbedaan ini kemungkinan

disebabkan karena senyawa uji memiliki target kerja yang berbeda-beda, yang

masih membutuhkan suatu pengkajian lebih lanjut. Berdasarkan kajian terhadap

nilai IC50 yang diperoleh terlihat eurikumanon merupakan senyawa yang lebih

aktif dari turunannya sebagai antikanker. Hal ini terlihat dari nilai IC50 1,17 ±

0,09; 3,96 ± 0,02; 2,95 ± 0,08; 1,45 ± 0,01 µg/mL pada sel T47D, MCF-7, Hela

dan WIDR secara berturut-turut. Sedangkan terhadap sel Vero, eurikumanon

termasuk bahan yang aman, sehingga sangat memungkinkan untuk dilanjutkan

penelitiannya secara in vivo (IC50 = 609,89 ± 29,77 µg/mL).

Tabel 2. Nilai IC50 eurikumanon dan turunannya pada sel normal (Vero)

dan sel kanker (T47D, MCF-7, Hela, WIDR)

Senyawa uji Nilai IC50 (µg/mL) Vero T47D MCF-7 Hela WIDR

Eurikumanon 609,89 ± 29,77 1,17 ± 0,09 3,96 ± 0,02 2,95 ± 0,08 1,45 ± 0,01

E triasetat 1,74 ± 0,99 1,08 ± 0,07 3,09 ± 0,03 1,21 ± 0,05 25,06 ± 0,59

E dibutirat 219,29 ± 11,38 25,16 ± 2,25 21,56 ± 4,55 29,32 ± 1,25 149,42 ± 12,50

E monovalerat 92,40 ± 7,51 25,59 ± 1,31 22,48 ± 1,25 30,14 ± 1,89 91.88 ± 8,90

E dimetoksi benzoat 13.226 ± 6.98 102,77 ± 2,56 38,83 ± 2,55 66,65 ± 1,90 51,61 ± 2,37

E disuksinat 12,75 ± 2,88 218,94 ± 9,30 198,87 ± 5,50 166,67 ± 12,34 145,39 ± 6,67

Doxorubicin 3,54 ± 0,64 1,97 ± 0,05 4,68 ± 0,10 3,51 ± 0,05 41,81 ± 2,25

5-Fluouracil 280,54 ± 10,11 4,03 ± 0,23 3,16 ± 0,11 1, 99 ± 0,01 5,41 ± 1,33

Uji aktivitas antikanker turunan eurikumanon yaitu eurikumanon triasetat

pada sel kanker T47D, MCF-7, Hela, WIDR diperoleh nilai IC50 berturut-turut

1,08 ± 0,07; 3,09 ± 0,03; 1,21 ± 0,05; 25,06 ± 0,59 µg/mL, tetapi senyawa ini

tidak aman terhadap sel normal, hal ini ditunjukkan oleh nilai IC50 sebesar 1,74 ±

0,99 µg/mL. Eurikumanon dibutirat memiliki nilai IC50 pada sel kanker tersebut diatas

sebesar 25,16 ± 2,25; 21,56 ± 4,55; 29,32 ± 1,25; 149,42 ± 12,50 µg/mL dan aman

terhadap sel Vero dengan nilai IC50 219,29 ± 11,38 µg/mL. Uji terhadap sel

kanker yang sama juga sebanding dengan eurikumanon monovalerat (IC50 25,59

± 1,31; 22,48 ± 1,25; 30,14 ± 1,89 µg/mL), akan tetapi tidak demikian terhadap

sel Vero dan WIDR. Eurikumanon dibutirat memiliki IC50 yang sebanding pada

sel Vero dan WIDR ( 92,40 ± 7,51 dan 91,88 ± 8,90 µg/mL).

Aktivitas antikanker eurikumanon dimetoksi benzoat terhadap sel kanker

yang digunakan pada penelitian ini adalah 102,77 ± 2,56; 38,83 ± 2,55; 66,65 ±

1,90; dan 51,66 ± 2,37 µg/mL, sedangkan terhadap sel Vero 132.26 ± 6.98

µg/mL. Salah satu turunan eurikumanon yang diesterifikasi dengan anhidrida

asam karboksilat adalah eurikumanon disuksinat, memiliki nilai IC50 terhadap sel

kanker yang sama yaitu 218,94 ± 9,30; 198,87 ± 5,50; 166,67 ± 12,34 dan 51,61 ±

2,37; 145,39 ± 10,11 µg/mL, sedangkan terhadap sel Vero 12,75 ± 2,88 µg/mL.

Pada penelitian ini digunakan doxorubicin dan 5-fluorourasil sebagai pembanding

dan dari hasil uji diperoleh nilai IC50 Doxorubicin terhadap sel kanker tersebut

diatas adalah sebagai berikut : 1,97 ± 0,05; 4,68 ± 0,10; 3,51 ± 0,05 dan 41,81 ±

2,25 µg/mL. Disamping itu nilai aktivitas sitotoksiknya terhadap sel Vero adalah

3,54 ± 0,64 µg/mL. Aktivitas antikanker 5-fluorourasil terhadap sel kanker ini

adalah 4,03 ± 0,23; 3,16 ± 0,11; 1,99 ± 0,01; 5,41 ± 1,33 µg/mL dan pada sel

Vero 280,54 ± 10,11µg/mL.

Menurut Likhitwitayawuid et al .1993, senyawa murni yang diuji

aktivitasnya terhadap sel kanker dengan nilai IC50 ≤ 4 µg/mL, maka senyawa

tersebut dapat dikategorikan ke dalam senyawa yang sangat aktif dan pengujian

terhadap senyawa tersebut dapat dilanjutkan ke uji preklinik dengan

menggunakan hewan coba. Kategori aktivitas antikanker yang dikemukakan oleh

peneliti lain (Shier, 1991) adalah bila senyawa memiliki nilai IC50 ≤ 5 µg/mL

(sangat aktif); IC50 5,0 – 10,0 µg/mL (aktivitas sedang) dan IC50 10 – 25 µg/mL

(aktivitas lemah).

5.5. Indeks Selektivitas Eurikumanon dan Turunannya

Dalam upaya pengembangan antikanker baru yang bekerja selektif terhadap

sel kanker, diperlukan parameter-parameter tertentu dalam menilai selektivitasnya

baik secara in vitro maupun secara in vivo. Secara in vitro selektivitas antikanker

diukur dari perbandingan antara nilai aktivitas sitotoksik senyawa uji (IC50)

terhadap sel Vero (sel normal) dengan nilai aktivitas sitotoksik (IC50) senyawa uji

yang sama terhadap sel kanker. Nilai ini disebut dengan nilai indeks selektivitas

atau indeks sitotoksisitas (IS). Tabel 2 memberi informasi tentang nilai indeks

selektivitas (IS) eurikumanon dan turunannya. Koech et al. (2005) menyatakan

bahwa senyawa dengan nilai IS ≤ 1 mengindikasikan bahwa senyawa tersebut

tidak selektif (sangat toksik), selektivitas dengan nilai IS ≤ 2 (toksik) dan

senyawa uji dikatakan selektif (aman) bila memiliki nilai IS ≥ 3. Nilai indeks

selektivitas ini tidak berlaku, bila masa inkubasi pada uji aktivitas sitotoksik lebih

dari 24 jam (Jenett-Siem et al., 1999, Ilias and Someylenko, 2007). Syarifah et al.

2011, membuat kategori indeks selektivitas antikanker dengan membagi dalam 3

(tiga) kategori skor yaitu skor 1 = tidak selektif (IS ≤ 1), skor 2 = selektivitas

sedang (IS > 1 < 5) dan skor 3 = selektif (IS ≥ 5).

Tabel 3. Nilai indeks selektivitas (IS) eurikumanon dan turunannya

pada sel kanker (T47D, MCF-7, Hela, WIDR)

Senyawa uji Nilai IS T47D MCF-7 Hela WIDR

Eurikumanon 521,27 154 206,54 420,20

E triasetat 1,61 0,56 1.44 0,07

E dibutirat 8,72 10,17 7,48 1,47

E monovalerat 3,61 3,41 3,07 1,00

E dimetoksi benzoat 128,70 340,61 198,44 256,27

E disuksinat 0,05 0,06 0,08 0,09

Doxorubicin 1,80 0,76 1,01 0,08

5-Fluouracil 69,61 88,78 140,97 52,86

Berdasarkan pernyataan Koech et al. (2005), maka turunan eurikumanon

yang toksik terhadap sel T47D adalah eurikumanon triasetat (IS = 1,61), dan

eurikumanon disuksinat sangat toksik (IS = 0,05), sedangkan eurikumanon yang

digunakan sebagai starting material pada penelitian, eurikumanon dibutirat,

eurikumanon monovalerat dan eurikumanon dimetoksi benzoat termasuk dalam

kategori aman dengan nilai IS berturut-turut 521,27; 8,72; 3,61 dan 128,7. Kontrol

positif yang digunakan pada penelitian ini adalah doxorubicin (IS = 1,80) dan 5-

fluorourasil (IS = 69,61).

Eurikumanon dan 3 (tiga) turunannya yaitu eurikumanon dibutirat,

eurikumanon monovalerat dan eurikumanon dimetoksi benzoat terhadap sel

kanker MCF-7 termasuk dalam kategori aman (IS = 154; 10,17; 3,41; 340,61),

sedangkan yang sangat toksik adalah eurikumanon triasetat dan eurikumanon

disuksinat (IS = 0,56 dan 0,06). Doxorubicin dan 5-fluorourasil memiliki nilai IS

076 dan 88,78. Pada sel Hela kategori aman dimiliki oleh eurikumanon (IS =

206,54), eurikumanon dibutirat (IS = 7,48), eurikumanon monovalerat (IS = 3,07),

eurikumanon dimetoksibenzoat (IS = 198,44) dan kontrol positif 5-fluorourasil (IS

= 140,97). Hasil uji terhadap sel WIDR senyawa yang termasuk dalam kategori

aman adalah eurikumanon (IS = 420,20), eurikumanon dimetoksibenzoat (IS =

256,27) dan kontrol positif 5-fluorourasil (IS = 52,86). Turunan eurikumanon

kategori toksik adalah eurikumanon dibutirat (IS = 1,47) dan eurikumanon

monovalerat (IS = 1), sedangkan kategori sangat toksik dimiliki oleh senyawa

eurikumanon triasetat (IS = 0,07 dan eurikumanon disuksinat (IS = 0,09). Kontrol

positif doxorubicin memiliki nilai IS = 0,08. Hasil pengkajian yang mendalam

dapat dijelaskan bahwa hanya eurikumanon dan eurikumanon dimetoksibenzoat

yang memiliki indeks selektivitas yang lebih besar dari 3, tetapi eurikumanon

dimetoksibenzoat tidak memiliki aktivitas antikanker terhadap sel T47D, MCF-7,

Hela dan WIDR berdasarkan kategori yang dikemukakan oleh Shier. (1991).

Hasil penelitian ini membuktikan bahwa eurikumanon memiliki aktivitas

antikanker terhadap sel T47D, MCF-7, Hela dan WIDR dan aman terhadap sel

normal (sel Vero). Turunan eurikumanon semisintesis yang memiliki aktivitas

antikanker terhadap sel tersebut diatas kecuali WIDR hanya eurikumanon

triasetat, tetapi senyawa ini tidak aman terhadap sel Vero atau sel normal.

Faktor-faktor yang menjadi pertimbangan dalam menilai selektivitas

antikanker adalah konsentrasi senyawa uji yang mampu memberikan aktivitas

antikanker maksimal dan aktivitas sitotoksik minimal terhadap sel normal. Bila

hal ini sudah terpenuhi, maka dapat senyawa tersebut dapat dilanjutkan

pengujiannya ke hewan coba. Adapun penggunaan sel Vero sebagai acuan dalam

menentukan sitotoksisitas secara in vitro hanyalah sebagai acuan dalam

memperkirakan keamanannya dan masih ada parameter-parameter lain yang

menjadi standar agar antikanker dapat digunakan secara klinis.

BAB 6

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan

1. Maserasi akar pasak bumi (E. longifolia, Jack.) menghasilkan ekstrak

kental akar pasak bumi ± 6,0% dan fraksinasi ekstrak ini secara KCV

dengan fase diam silika gel 60 dan campuran fase gerak yang terdiri dari

kloroform : metanol : air (5 : 5 : 1) menghasilkan fraksi eurikumanon ±

2,5%. Isolasi eurikumanon dari fraksi ini secara KLT-p dengan fase diam

silika gel 60 PF254 dan campuran fase gerak yang terdiri dari etilasetat :

etanol : air dengan perbandingan 100 : 30 : 1 menghasilkan eurikumanon ±

0,04 %.

2. Sintesis eurikumanon dengan asetilklorida, butirilklorida, valerilklorida,

metoksibenzoilklorida dan suksinat anhidrida menghasilkan senyawa

turunan eurikumanon sebagai berikut: eurikumanon triasetat 65,25%

(formula C26H30O12 dengan BM 534,58); eurikumanon dibutirat 60,35% (

formula C28H36O11 dan BM 548,94); eurikumanon monovalerat 55,10%

(formula C25H32O10 dan BM 492,82; eurikumanon dimetoksibenzoat

50,10% (formula C36H36O13 dan BM 676); dan eurikumanon disuksinat

65,25% (formula C28H30O15 dan BM 606,86).

3. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa eurikumanon memiliki aktivitas

antikanker terhadap sel T47D (IC50 1,17 ± 0,09 µg/mL), MCF-7(IC50 3,96

± 0,02 µg/mL), Hela (IC50 2,95 ± 0,08 µg/mL) dan WIDR (IC50 1,45 ±

0,01 µg/mL) dan aman terhadap sel normal (IC50 609,89 ± 29,77 µg/mL).

Turunan eurikumanon semisintesis yaitu eurikumanon triasetat memiliki

aktivitas antikanker terhadap T47D (IC50 1,08 ± 0,07µg/mL), MCF-7 (IC50

3,09 ± 0,03 µg/mL) dan Hela (IC50 1,21 ± 0,05 µg/mL).Tetapi

eurikumanon triasetat tidak aktif terhadap sel WIDR (IC50 25,06 ± 0,59

µg/mL) dan tidak aman terhadap sel Vero atau sel normal (IC50 1,74 ±

0,99 µg/mL).

4. Eurikumanon dan turunannya yaitu eurikumanon dibutirat, eurikumanon

monovalerat dan eurikumanon dimetoksibenzoat memiliki indeks

selektivitas >3 dan termasuk dalam kategori selektivitas tinggi (aman),

tetapi senyawa turunan eurikumanon ini tidak memiliki aktivitas terhadap

sel kanker T47D, MCF-7, Hela dan WIDR.

6.2. Saran

1. Proses isolasi eurikumanon pada penelitian ini memerlukan banyak waktu,

reagen, biaya, pengalaman dan ketrampilan khusus. Oleh karena itu

disarankan pada masa yang akan datang isolasi dilakukan dengan

menggunakan membran yang khusus dirancang untuk mengisolasi

senyawa tersebut (eurikumanon).

2. Mengingat eurikumanon sangat potensial terhadap sel kanker T47D, MCF-

7, Hela dan WIDR, maka perlu dipertimbangkan pengembangan senyawa

ini menjadi senyawa baru melalui modifikasi struktur selain secara

esterifikasi, sehingga dapat diperoleh senyawa turunannya yang lebih baik,

aman dan dapat mencegah atau memperlambat terjadinya resistensi sel

kanker terhadap antikanker.

3. Syarat suatu antikanker adalah memiliki aktivitas yang potensial dan aman,

hal ini secara in vitro sudah dipenuhi oleh eurikumanon. Oleh karena itu

diperlukan penelitian lanjutan secara in vivo dengan menggunakan hewan

model.

4. Pada masa yang akan datang kemungkinan besar eurikumanon berpotensi

terhadap berbagai jenis kanker, sehingga untuk penggunaan klinis secara

global perlu dipertimbangkan cara total sintesis eurikumanon. Dengan

demikian upaya penebangan besar-besaran terhadap tumbuhan Eurycoma

longifolia, Jack dapat dicegah.

DAFTAR PUSTAKA

Badisa, R.B., Darlingreed, S.F., Joseph, P., Cooperwood, J.S., Latinwo, L.M., and

Goodman, C.B. 2009. Selective Cytotoxic Activities of Two Novel

Synthetic Drugs on Human Breast Carcinoma MCF-7 Cells. Anticancer

Research. 29: 2993 – 2996.

Boik J. 2001. Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press,

Minnesota.

Chan, K.L., Choo C.Y., Abdullah N.R., Ismail Z., 2004, Penelitian

Antiplasmodium Eurycoma longifolia Jack menggunakan uji kadar laktat

dehydrogenase pada Plasmodium falciparum, Laporan Penelitian, School of

Pharmaceutical Sciences, Universiti Sains Malaysia, Penang 11800,

Malaysia

Chan, K.L., Choo, C.Y., Abdullah, N.R. 2005. Semisynthetic 15-O-acyl and 1,15-

di-O-acyleurycumanone from Eurycoma longifolia Jack as Potential

Antimalarials. Planta Med 71. 967 – 969.

Chan, K.L., O’Neill, M.J., Phillipson, J.D., and Warhurst, D.C. 1986. Plants as

Source of Antimalarial Drugs. Part 3. Eurycoma longifolia. Planta Medica

52(2): 105 – 107.

Guo, Z., Vangapandu, S., Sindelar, R.W., Walker, L.A., and Sindelar, R.D. 2005.

Biologically Active Quassinoid and Their Chemistry: Potensial Leads

forDrug Design. Curr Med Chem 12: 190-193.

Jenett-Siems, K., Mockenhaupt, F.P., Bienzle, U., Gupta, M.P., and Eich, E. 1999.

In Vitro Antiplasmodial Activity of Central American Medicinal Plants.

Tropical Medicine International Health . 4 (9): 611 – 615.

Jiwajinda, S., Santisopasri V., Murakami A., Sugiyama H., Gasquet M., Riad E.,

Balansard G., Ohigashi H., 2001, In vitro anti-tumor promoting and anti-

parasitic activities of the quassinoids from Eurycoma longifolia, A

Medicinal Plant in Southeast Asia, J. Ethnopharmacol, Sep 1; 82 (10): 55

Jiwajinda, S., Santisopasri, V., Murakami, A., Kawanaka, M., Kawanaka, H.,

Gasqult, M., Eilas, R., Balansard, G., and Ohigashi, H. 2002. In Vitro

Antitumor Promoting and Antiparasitic Activities of The Quassinoids from

Eurycoma longifolia A Medicinal Plant in Southeast Asia. Journal of

Ethnopharmacology. 82: 55 – 58.

Kar, A. 2004. Advanced Practical Medicinal Chemistry. New Age International

Publisher, New Delhi .

Kardono, L.B.S., Angerhofer, C.K., Tsauri, S., Padmawinata, K., Pezzuto, J.M.,

Kinghorn, A.D., 1991. Cytotoxic and Antimalarial Constituents of The

Roots of Eurycoma longifolia. J Nat Prod, 54, 1360-1367.

Koech, A., Tamez, P., Pezzuto, J and Soejarto, D. 2005. Evaluation of Plants

Used For Antimalarial Treatment by The Massal of Kenya. J.

Ethnopharmacol. 101: 95-99.

Kuo, P.C., Damu A.G., Lee K.H., Wu T.S., 2003, Cytotoxic and Antimalarial

beta-carboline alkaloids from the roots of Eurycoma longifolia, J. Nat

Product, Oct; 66 (10): 1324-1327

Kuo, P.C., Damu, A.G., Lee, K.K., Wu, T.S. 2004. Cytotoxic and Antimalarial

Constituent from The Roots of Eurycoma longifolia, J. Bioorg Med Chem,

12: 537 -544.

Kupchan, S.M., Fessler, D.C., Eakin, M.A., and Giacobbe, T.J. 1970. Reaction of

Alpha Methylen Lactone Tumor Promoter Inhibitors with Model Biological

Nucleophiles. Science 168, 376 – 377.

Lee, V.T., Nguyen, N.S.,1993. Constituents of Eurycoma longifolia Jack. J Org

Chem 35, 1104-1109.

Likhitwitayawuid , K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M., Cordell, G.A.,

and Ruangrungsi, N. 1993. Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the

bulbs of Crinum amabile. J. Nat. Prod ., 56: 1331-1338.

Mawaddah, R.D. 2011. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Akar Pasak Bumi (Eurycoma

longifolia. Jack) Pada Tiksus Putih (Rattus norvegicus). Skripsi. Fakultas

Kedokteran Universitas Syiah Kuala Banda Aceh.

Meiyanto, E. 1999, Kurkumin sebagai obat kanker: Menelusuri mekanisme

aksinya, Majalah Famasi Indonesia, 10, (4): 224-236

Mustofa & Qamariah,N. 2004. Aktivitas antiplasmodial In Vitro dan sitotoksik

Ekstrak Air, Metanol dan Kloroform Akar Pasak Bumi (Eurycoma

longifolia Jack Yang Secara Tradisional Digunakan Untuk pengobatan

Malaria di Kalimantan Selatan. Medika, 3(XXX): 147 – 152.

Nurani, L.H., Mubarika, S., Pramono, S., Mustofa, 2008, The Cytotoxicity of

Extract of Eurycoma longifolia Jack Root on T47D Cell Line, Proceeding,

International Symposium, Cancer, Ahmad Dahlan University

Nurhanan, M.Y., Azimathol H.L.P., Mohd I.A., Moch S.M.A., 2005, Cytotoxic

Effect of the Root Extracts of Eurycoma longifolia Jack, Phytother.Res, 19,

994-996

Shier, W.T. 1991. Mammalian Cell Culture On 5 A day: A laboratory manual of

low cost methods. Nat. Inst of Biotech and Appl. Micro : 64 – 71.

Sholikhah, E.N. & Wijayanti, M.A., 2009, Uji Toksisitas Akut dan Penentuan

Dosis Efektif Ekstrak Tersandar Akar Pasak Bumi (Eurycoma longifolia

Jack.) sebagai Antimalaria pada Hewan Coba. Laporan Penelitian, Fakultas

Kedokteran UGM

Syarifah, S.M.M., Nurhanan, M.Y., Hafiz, M.J., Ilham, M,A., Getha, K., Asiah,

O., Norhayati, I. Sahara, L.H., Suryanti, A.S. 2011. Potential anticancer

compound from Cerbera odollam . Journal of Tropical Forest Science

23(1): 89–96.

Tada, H., Yasuda, F., Otani, K., Dotenchi, M., Ishihara, Y., and Shiro, W. 1991.

New Antiulcer Quassinoids from Eurycoma longifolia. European Journal of

Medicinal Chemistry. 26: 345 – 349.

World Cancer Research Fund Internasional. 2008.

World Health Organization. 2010. Cancer Report. Geneva

Yusuf, H., Mustofa.,Wijayanti, M.A., Susidarti, R.A. Asih, P.B.S., Suryawati dan

Sofia. 2013. A New Quassinoid of Four Isolated Compounds from Extract

Eurycoma longifolia, Jack Roots and Their In itro Antimalarial Activity.

International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical

Sciences. 4: 728 – 734.

LAMPIRAN

1. Instrumen

Instrumen utama yang dibutuhkan pada isolasi eurikumanon adalah:

timbangan, panci ekstraktor, alat pengaduk, penyaring buchner, kertas saring,

vakum evaporator, kromatografi cair vakum, alat kromatografi lapisan tipis, alat

kromatografi lapisan tipis preparatif dan alat-alat gelas lainnya. Instrumen yang

dibutuhkan pada semisintesis turunan eurikumanon adalah labu leher tiga,

termometer, corong tetes, penangas es, pendingin bola, pengaduk panas magnetik,

lemari asam dan alat-alat gelas. Instrumen utama yang dibutuhkan pada uji

aktivitas antikanker adalah laminar air flow, inkubator CO2, autoclave, tabung gas

dan alat-alat gelas.

2. Personalia tenaga peneliti beserta kualifikasinya

Hibah penelitian fundamental dengan judul “Sintesis Turunan

Eurikumanon, Kajian Aktivitas dan Keamanannya Sebagai Antikanker ini

diteliti oleh Dr. Hanifah Yusuf, M.Kes, Apt yang saat ini merupakan salah satu

staf pengajar pada Bagian Farmakologi dan Terapi Fakultas Kedokteran

Universitas Syiah Kuala Banda Aceh. Peneliti memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S-1) dan lulus sebagai profesi Apoteker pada Tahun 1985 di jurusan Farmasi

FMIPA Universitas Sumatera Utara Medan. Gelar Magister Kesehatan diperoleh

pada pendidikan Strata S-2 dalam bidang kajian Farmakologi Jurusan Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan pada tahin 2001. Pada

bulan Januari 2014 telah menyelesaikan Program Doktor di bidang Farmakologi

dan Terapi pada Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta .

3. Biodata Ketua dan Anggota Tim Peneliti

A. Identitas Ketua Tim Peneliti

1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. Hanifah Yusuf, M.Kes., Apt

2 Jenis Kelamin Perempuan

3 Jabatan Fungsional Lektor Kepala pada Bagian Farmakologi FK Unsyiah

4 NIP/NIK/Identitas lainnya 195709111987032001

5 NIDN 00110957

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh, 11 September 1957

7 E-mail hans_yusuf1104@yahoo.com

8 Alamat Rumah Jln Hamzah Fansuri No 15 Sektor Utara

Kopelma Darussalam B.Aceh 23111

9 Nomor Telepon/Faks/ HP +628126938484

10 Alamat Kantor Bagian Farmakologi FK Unsyiah, Darussalam

Jl.Tgk.Tanoh Abee, Darussalam Banda Aceh, 23111

11 Nomor Telepon/Faks Telp 0651-7551843

12 Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = 8 orang; S-2 = orang; S-3 = orang

13 Mata Kuliah yg Diampu 1. Farmakologi Kedokteran

2. Farmakologi Keperawatan

3. Farmakologi Kefarmasian

4. Farmakoekonomi

5. Farmakoepidemiologi

6. Farmakologi klinik

7. Farmakoterapi

8. Farmakologi Eksperimental

B. Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan

Tinggi

FMIPA USU PPS-USU PDIKK-UGM

Bidang Ilmu Farmasi Farmakologi Farmakologi

Tahun Masuk-

Lulus

1976-1984 1998-2001 2008-

JudulSkripsi/Thesis

/Disertasi

Pengaruh Bahan

Pengikat Pada

Pembuatan Tablet

Dari Bahan

Simplisia

Efek Analgesia

Ekstrak Daun

Klausena (Clausena

anisata) dengan

Metode “Rat Tail

Flick Test”

Modifikasi Struktur

Eurikumanon Hasil Isolasi

dari Akar Pasak Bumi

(Eurycoma longifolia, Jack),

Uji Aktivitas

Antiplasmodium dan

Hubungan Kuantitatif antara

Struktur Aktivitas

Nama Pembimbing/

Promotor

Dra. Meyzoni Mian Prof.Dr.dr.

Pandapotan

Pandjaitan, SpFK

Prof.Dr.Mustofa, M.Kes.,Apt

C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian Pendanaan

Sumber* Jumlah

(Juta Rp)

1 2009 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif

Antimalaria dari Fraksi N-Heksan Daun

Nimba (Azadirachta indica A.Juss)

IM-HERE

30

2 2012 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antimalaria

dari Ekstrak Akar Pasak Bumi (Eurycoma

longifolia, Jack.) Sebagai “Tropical

Medicine” dalam Upaya Pemberantasan

Malaria Akibat Dampak Kebencanaan

DIKTI 50

3 2013 Semisintesis Senyawa Turunan Eurikumanon

Hasil Isolasi dari Akar Pasak Bumi (Eurycoma

DIKTI 50

longifolia, Jack.) dan Uji Aktivitas

Antiplasmodium Secara In Vitro

4 2014 Sintesis Turunan Eurikumanon, Kajian

Aktivitas dan Keamanannya Sebagai

Antikanker

DIKTI 45

5 2014 Pengembangan Antimalaria Baru Turunan

Eurikumanon Hasil Semisintesis Berdasarkan

Analisis HKSA dan Kajian Mekanisme

Kerjanya

RISTEK 150

D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan

Sumber* Jumlah

(Juta Rp)

E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir

No Judul Artikel Ilmiah Volume/

Nomor/Tahun

Nama Jurnal

1 Antimalarial activity of Azadirachta indica

A.Juss To Plasmodium berghei in Mus

musculus

ISBN 978-602-

8892-17-9

Proceedings of

International Seminar’

Think Globally Act

Locally: Entering The

Global Market of

Animal Health and

Livestock Through

Utilizing Local

resources Based On

green Vision” 2009

2 The antimalarial activity of the extract of the

neem leaves (Azadirachta indica A.Juss) on

Plasmodium falciparum in vitro

IS089-208X Proceedings of Annual

International

Conference (AIC)

2011

3 Antimalarial Activity of Hexane Extract of

Neem Leaves on Mice (Mus musculus)

IRJPAS, Vol-II,

Issue-I, Feb-2012

has released.

ISSN 2277-4149

Int. Res J Pharm.

App Sci.

www.irjpas.com

4 The Acute Toxicity of Methanolic Extract of

Eurycoma longifolia, Jack Roots and

Histopatholoic Changes of Rat Vital Organs

IRJPAS,

Int. Res J Pharm.

App Sci., 2013;

3(3):13-17

ISSN 2277-4149

Int. Res J Pharm. App

Sci..

www.irjpas.com

5 A New Quassinoid of Four Isolated

Compounds from Extract of Eurycoma

longifolia, Jack Roots and Their In Vitro

Antimalarial Activity

International Journal

of Research In

Pharmaceutical and

Biomedical Sciences

Vol 4 (3): 728 - 734

ISSN 2229 – 3701

IJRPBS

www.ijrpbsonline.co

m

6. Semisynthesis and Biological Evaluation of

Eurycomanone Derivatives As New

Antimalarial

IRJPAS,

Int. Res J Pharm.

App Sci., 2013;

3(6): 4-7. ISSN

2277-4149

Int. Res J Pharm. App

Sci..

www.irjpas.com

F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah

Dalam 5 Tahun Terakhir

No Nama Pertemuan

Ilmiah / Seminar

Judul Artikel Ilmiah Waktu dan

Tempat

1 International Seminar’ Think Globally Act

Locally: Entering The Global Market of

Animal Health and Livestock Through

Utilizing Local resources Based On green

Vision”

Antimalarial activity of

Azadirachta indica

A.Juss To Plasmodium

berghei in Mus

musculus

4-5 Oktober

2010, Banda

Aceh

2 Annual International Conference (AIC)

2011

The antimalarial

activity of the extract of

the neem leaves

(Azadirachta indica

A.Juss) on Plasmodium

falciparum in vitro

29-30 November

2011, Banda

aceh

3 Seminar Hasil Penelitian Hibah Unggulan

Perguruan Tinggi (DIKTI)

Isolasi dan Identifikasi

Senyawa Antimalaria

dari Ekstrak Akar Pasak

Bumi (Eurycoma

longifolia, Jack.)

Sebagai “Tropical

Medicine” dalam

Upaya Pemberantasan

Malaria Akibat

Dampak Kebencanaan

Lembaga

Penelitian

Universitas

Syiah Kuala,

Banda Aceh

(Tahun 2012)

4 Seminar Hasil Penelitian Hibah Disertasi

Doktor (DIKTI)

Semisintesis Turunan

Eurikumanon Hasil

Isolasi dari Akar Pasak

Bumi (Eurycoma

longifolia, Jack) dan

Uji Aktivitas

Antiplasmodium Secara

In Vitro

Lembaga

Penelitian

Universitas

Syiah Kuala,

Banda Aceh

(Tahun 2013)

5 Seminar Hasil Penelitian Insentif Sistem

Inovasi Nasional 2014 (RISTEK)

Pengembangan

Antimalaria Baru

Turunan Eurikumanon

Hasil Semisintesis

Berdasarkan Analisis

HKSA dan Kajian

Mekanisme Kerjanya

Kementerian

RISTEK RI

Bandung 1 – 3

Oktober 2014

6 Seminar Hasil Penelitian Fundamental 2014

(DIKTI) Sintesis Turunan

Eurikumanon, Kajian

Aktivitas dan

Keamanannya

Sebagai Antikanker

Lemlit Unsyiah

Banda Aceh

(Tanggal 21

November 2014)

4. FORMULIR EVALUASI ATAS CAPAIAN LUARAN KEGIATAN

Ketua : Dra. Hanifah Yusuf, M.Kes, Apt

Perguruan Tinggi : Universitas Syiah Kuala

Judul : Semisintesis Senyawa Turunan Eurikumanon Hasil Isolasi dari

Akar Pasak Bumi (Eurycoma longifolia, Jack.) dan Uji

Aktivitas Antiplasmodium Secara In Vitro

Waktu Kegiatan : Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun

Luaran yang direncanakan dan capaian tertulisdalam proposal awal

No Luaran yang direncanakan Capaian

1. Publikasi di jurnal internasional Belum dikirim untuk

dipublikasi di Jurnal

Internasional

1. Publikasi Ilmiah

Keterangan

Artikel Jurnal ke-1

Nama jurnal yang dituju Aceh International Journal of Science

and Technology

Klasifikasi jurnal Internasional

Impact factor jurnal

Judul artikel

Status naskah (beri tanda)

- Draft artikel

- Sudah dikirim ke jurnal

- Sedang ditelaah

- Sedang direvisi

- Revisi sudah dikirim ulang

- Sudah diterima

- Sudah terbit

2. Buku Ajar

Buku Ajar ke-1

Judul :

Penulis :

Penerbit :

3. Pembicara Pada Pertemuan Ilmiah (Seminar/ Simposium)

Judul makalah

Nama pertemuan ilmiah

Tempat pelaksanaan

Waktu pelaksanaan

- Draft makalah

- Sudah dikirim

- Sedang direview

- Sudah dilaksanakan

Biodata Anggota Tim Peneliti I

A. Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr. Darma Satria,M.Si L

2 Jenis Kelamin Laki-laki

3 Jabatan Fungsional Asissten Ahli di Bagian Patologi Anatomi FK

Unsyiah

4 NIP/NIK/Identitas lainnya 19830811 200604 1 002

5 NIDN 0011088301

6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh/ 11 Agustus 1983

7 E-mail darm212@yahoo.com/darm212@ gmail.com

8 Alamat Rumah Jl. Hasan Saleh No.12, Neusu Jaya, Banda

Aceh 9 Nomor Telepon/Faks/ HP 085260084649

10 Alamat Kantor Bagian Patologi Anatomi FK Unsyiah,

Kopelma Darussalam

Jl.Tgk.Tanoh Abee, Darussalam Banda Aceh,

23111

11 Nomor Telepon/Faks Telp 0651-7551843

12 Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = orang; S-2 = orang; S-3 = orang

13 Mata Kuliah yg Diampu Patologi Anatomi

B. Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan

Tinggi

Universitas Syiah

Kuala

Universitas Airlangga

Bidang Ilmu Kedokteran Patobiologi

Tahun Masuk-Lulus

JudulSkripsi/Thesis/Di

sertasi

Pengaruh pemberian asam

askorbat dosis tinggi secara

intravena terhadap gambaran

histopatologis glomerulus,

tubulus dan peroksidasi lipid

pada ginjal tikus putih (Rattus

norvegicus strain Wistar

Nama

Pembimbing/Promotor

C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian Pendanaan

Sumber* Jumlah

(Juta

Rp)

1 2007 Faktor-faktor yang Mempengaruhi

Kejadian Preeklampsia Berat (PEB) dan

Eklampsia di RSUDZA Tahun 2007

(Tanpa publikasi)

Mandiri

Biodata Anggota Tim Peneliti II

A. Identitas Diri

1 Nama Lengkap (dengan

gelar)

dr.Zulkarnain, M.Sc

2. Jenis Kelamin Laki-Laki

3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli di Bagian Fisiologi FK Unsyiah

4 NIP/NIK/Identitas lainnya 19830925 2008121004

5 NIDN 0025098302

6 Tempat dan Tanggal Lahir Kiran Krueng/ 25 September 1983

7 E-mail zulkarnain@unsyiah.ac.id

8 Alamat Rumah Jl. Singgah Mata Lr. Glee Pulot No 40,

Blower Banda Aceh

9 Nomor Telepon/Faks/ HP 085277728024

10 Alamat Kantor Bagian Fisiologi FK Unsyiah, Darussalam

Jl.Tgk.Tanoh Abee, Darussalam Banda

Aceh, 23111

11 Nomor Telepon/Faks 0651-7551843

12 Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = orang; S-2 = orang; S-3 = orang

13 Mata Kuliah yg Diampu Fisiologi Kedokteran

A. Riwayat Pendidikan

S-1 S-2 S-3

Nama Perguruan Tinggi Universitas

Syiah Kuala

Universitas Gadjah

Mada

-

Bidang Ilmu Kedokteran Fisiologi -

Tahun Masuk-Lulus -

JudulSkripsi/Thesis/Disertasi Ekspresi

Caspase-3 Sel

Leydig Tikus

Sprague

Dawley yang

Diinduksi

Streptozotocin

Dosis Rendah

-

Nama Pembimbing/Promotor -

C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir

No Tahun Judul Penelitian Pendanaan

Sumber* Jumlah

(Juta

Rp)

1 2010

Pengaruh Dukungan Keluarga, Pengetahuan

dan Pendidikan Penderita Tuberkulosiss (TB

Paru) Terhadap Kepatuhan Minum Obat

DIKTI

THE ACTIVITY OF EURYCOMANONE DERIVATIVES AS

ANTICANCER

1Hanifah Yusuf,

2Darma Satria,

3Zulkarnain

1Departement of Pharmacology and Therapeutic Faculty of Medicine University of Syiah Kuala Banda Aceh,

Indonesia 2Departement of Pathology Anatomi Faculty of Medicine University of Syiah Kuala Banda Aceh, Indonesia

3Departement of Physiology Faculty of Medicine University of Syiah Kuala Banda Aceh, Indonesia

Email: hans_yusuf1104@yahoo.com

ABSTRACT

Eurycomanone from the roots of Eurycoma longifolia Jack, has been reported to

exhibit anticancer activity. Five of ester eurycomanone derivatives: eurycomanone

triacetate, eurycomanone dibutyrate, eurycomanone monovalerate, eurycomanone

dimethoxybenzoate and eurycomanone disuccinate were synthesized for knowing

their potencies on cancer cells T47D, MCF-7, Hela, WIDR and normal cells. The

activity of eurycomanone derivatives as anticancer were evaluated by a MTT

colorimetric assay method. The results showed that eurycomanone has anticancer

activity on T47D, MCF-7, Hela, WIDR cancer cells with values IC50 (1,17 ± 0,09;

3,96 ± 0,02; 2,95 ± 0,08; 1,45 ± 0,01 µg/mL, respectively and no toxic to Vero

cells (IC50 609,89 ± 29,77 µg/mL). Eurycomanone triacetate has IC50 values 1,08

± 0,07; 3,09 ± 0,03; 1,21 ± 0,05 µg/mL and no activity on WIDR cancer cells

(IC50 = 25,06 ± 0,59 µg/mL) but toxic to Vero cells (IC50 = 1,74 ± 0,99 µg/mL).

Eurycomanone dibutyrate, eurycomanone monovalerate and eurycomanone

dimethoxybenzoate are safe to Vero cells with selectivity index more than 3, but

no activity on cancer cells. Eurycomanone disuccinate no activity on cancer cells

and also toxic to Vero cells.

Keywords : Anticancer, Eurycomanone, Eurycoma longifolia Jack, Synthesis

Introduction

Natural compounds from plants have been proven as a source of lead

compounds for developing of new drugs (1,2

). Eurycomanone is a natural

pentacyclic quassinoid obtained from the roots of Eurycoma longifolia Jack (3) in

the family Simaroubaceae. Eurycoma longifolia Jack (ElJ) or commercially

known as Tongkat Ali in Malaysia, Pasak Bumi in Indonesia, Tung Saw in

Thailand and Cay Ba Binh in Vietnam (4) is very popular plant as aphrodisiac and

usually taken after 4 years of cultivation for preparing pharmaceutical products(5).

Various natural compounds have been isolated and characterized from ElJ, mostly

from the roots. Natural compounds from ElJ have been reported to have a wide

pharmacological activities such as antimalarial (6,7,8

), anticancer (6,7,8,9,10

),

antipyretic (10

) and anti ulcer (11

). Eurycomanone is one of the major natural

quassinoids isolated from the roots of ElJ and has exhibited cytotoxic activities

against selected cancer cell lines (12,13

). Its pharmacological potency has been

proven in numerous in vitro and in vivo experimental laboratory. But until now

very limited efforts to develope this compound for obtaining its derivatives.

Therefore this investigation was conducted to examine the anticancer activity of

synthesized eurycomanone derivatives on selected cancer cells line.

In this study, design and synthesis of eurycomanone derivatives were done

by using eurycomanone natural compound and esterified without using protecting

agent by using pharmacophore agents such as acetyl chloride, butiryl chloride,

valeroyl chloride, para methoxy benzoyl chloride and succinate anhydride.

Materials and Methods:

Plant materials: The plant and roots of E. longifolia Jack were taken after 4

years of cultivation and identified by a specialist. The certificate of identification

with number BF/123/Ident/Det/III/2010.

Extraction:

The roots (10kg) of E. longifolia were cleaned with tap water and then dried in the

oven at 600C. The dried roots materials were ground into crude powder and stored

in the desiccators.

The crude powder was soaked in 30L methanol at room temperature and stirred

regularly. The liquid extract was filtered and concentrated in rotary evaporator at

400C to produce methanolic extract.

Isolation of eurycomanone

Before isolation the methanolic extract of ElJ was subjected to vacum liquid

chromatography by using stationer phase silica gel and the mixture chloroform:

methanol: water in ratio (5:5:1; 3:7:1: 1:9:1) as mobile phase. Fractions with

similar Rf values on thin layer chromatography (TLC) which were monitored at

UV lamp at 254 nm, then pooled and used for isolation of eurycomanone as

starting material for synthesizing. This fraction were used for isolation of

eurycomanone by PTLC using silica gel PF254 as stationer phase and the mixture

of ethylacetate: methanol : water in ratio 80: 20: 1 as mobile phase. Repeated

isolation and crystallization were done to get the pure compound. The structures

and its purity were confirmed by comparison with detailed spectroscopic data in

published reports (UV, IR, NMR, LCMS-ESI positive ion, DEPT, COSY, HMQC

and HMBC).

Synthesis of eurycomanone derivatives

Synthesis of eurycomanone derivatives can be performed by simple

esterification without using protecting agent. Eurycomanone which is isolated

from the E. longifolia roots (50 mg, 0,1225 mmol) was dissolved in cold pyridine

(1 mL) and pharmacophore agent (acetyl chloride, butiryl chloride, valeroyl

chloride, para methoxy benzoyl chloride and succinate anhydride 0,49 mmol,

respectively) dissolved in cold chloroform. The solution of pharmacophore agent

was added slowly to the eurycomanone solution at 00C and the reaction mixture

was stirred for 1 hour in ice bath. After that, the reaction mixture was refluxed and

stirred using magnetic heat stirrer at 500C – 55

0C for 6-8 hour and every 2 hours

checked the product by TLC. After esterification process ended, the mixture was

extracted three times with 10 ml of cold ethyl acetate. The ethyl acetate layer is

washed three times with 10 mL cold water and then dried with sodium sulfate

anhydrate. After filtration and drying, the cooled precipitate is poured in methanol

and preparing for detailed spectroscopic analysis.

Testing of Anticancer activity

The anticancer activity test of eurycomanone and its derivatives on Vero cells and

cancer cell lines (T47D, MCF-7, Hela, WIDR) were carried out by MTT

Colorimetric Assay methods (Mosman, 1983). The tested compounds were used

at concentration 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,57625, 0,78125 µg/mL and prepared

from the substock solutions by serial dilution of media to give a volume of 100 µL

in each microtitre plate well. The concentration of tested compounds were

prepared in triplicate. As standard drug used doxorubicine and 5 fluorouracil in

same concentration. Then each well was added with 100 µL with 104/

mL of cells

in complete growth media, respectively. As controls were used the cells and

media that were placed into 96 well microplate then incubated for 24 hours at

370C, 5% CO2 and 90% humidity. After incubation, the media was removed and

100 µL of new medium and 10 µL MTT was added. Then, it was incubated again

for 4 hours and next the media was aspirated and 100 µL SDS 10% in 0,001N

HCl added. The microplate was re-incubated for 24 hours in room temperature

and its absorbance was read at λ 405 nm (Vero cells) and 595 nm (cancer cell

lines) by ELISA reader. The IC50 value on Vero cells and cancer cell lines were

determined by probit or linear regression analysis.

Results:

The result of eurycomanone isolation

Investigating of new antimalarial compound was originated from pasak

bumi roots (E. longifolia, Jack.), we macerated the powdered of pasak bumi roots

with methanol and after evaporation the liquid extract in vacum condition gave ±

6% solid extract. Fractionation were done to the extract by vacum liqiud

chromatography (VLC) for obtaining the concentrated eurycomanone and yielded

± 2,5%. Isolation of eurycomanone from this fraction was performed by

preparative thin layer chromatography (TLC) and yielded ± 0,04%.

The result of synthesis eurycomanone derivatives

Eurycomanone is the potential quasinoid anticancer was structurally

esterified by using acyl chloride and carboxyclic anhydride to influence their

activity and cytotoxicity to cancer cell lines. Synthesis of its derivatives by

esterification is attempted with the aim of increasing activity, decreasing toxicity,

or improving other pharmacological profiles. In finding new anticancer with

better activity than previous compound, it was esterificated OH group in

eurycomanone structure by acetyl chloride, butiryl chloride, valeryl chloride,

para-methoxybenzoyl chloride and succinic anhydride. The result of esterification

gave eurycomanone triacetate (65,25%), eurycomanone dibutyrate (60,35%),

eurycomanone monovalerate (55,10%), eurycomanone dimethoxybenzoate

(60,10%) and eurycomanone disuccinate (65,25%).

The result of identifying eurycomanone and its derivatives by spectroscopic

analysis

Chemical structure of all tested compounds had been analyzed by

spectroscopic analysis. Eurycomanone as starting material has formula C20H24O9

(MW 408.02; m.p 2540-257

0C) and its derivatives eurycomanone triacetate

C26H30O12 (MW 537.58; m.p 225-2270C), eurycomanone dibutyrate C28H36O11

(MW 548,94; m.p 241-2430C), eurycomanone monovalerate C25H32O10

(MW492,8; m.p 235-2370C), eurycomanone dimethoxybenzoate C36H36O13 (MW

676,13; m.p 225-2280C) eurycomanone disuccinate C28H30O15 (MW 606,86, m.p

251-2540C).

The result of anticancer activity test

The evaluation of tested compounds on Vero cell is aimed for knowing the

safety of these compounds on normal cells. In addition, these compounds are also

used for examining their potencies in growth inhibition of cancer cell lines. The

test was performed by MTT colorimetric assay method which was modified (14,15

).

The IC50 and selectivity index values of these compounds on cancer cell lines and

Vero cells are showed in Table 1 and 2.

Discussion

Resistance to chemotherapy limits the effectiveness of chemotherapy drugs in

treating cancer. Several derivatives of eurycomanone: eurycomanone triacetate,

eurycomanone dibutyrate, eurycomanone monovalerate, eurycomanone

dimethoxybenzoate, eurycomanone disuccinate were synthesized. The

triacetylated eurycomanones (eurycomanone triacetate) exhibitted higher

anticancer activity on cancer cell lines (T47D, MCF-7, Hela), and no activity on

WIDR cell. Eurycomanone triacetate displayed comparable anticancer potency to

eurycomanone, except on WIDR cells and also toxic on Vero cells. The data in

Table 1 showed eurycomanone and triacetylated eurycomanone more potent than

monoacetylated and diacetylated eurycomanone to selected cancer cell lines

above.

Conclusion:

The data suggest that eurycomanone has anticancer activity on selected cancer cell

lines (T47D, MCF-7, Hela and WIDR) and safe to normal Vero cells. Its

derivatives eurycomanone triacetate have anticancer activity on those cells except

WIDR, but toxic on Vero cells.

References

1. Newman, D.J., Cragg, G.M., Snader, K.M. 2003. Natural products as sources

of new drugs over the period 1981–2002. J. Nat Prod. 66(7):1022-1037.

2. Kinghorn, A.D., Farnsworth, N.R., Soejarto, D.D., Cordell, G.A., Pezzuto,

J.M., Udeani, G.O., Wani, M.C., Wall. M.E., Navarro, H.A., Kramer, H.A.,

Menendez, A.T., Fairchild, C.R., Lane, K.E., Forenza, S., Vyas, D.M., Lam,

K.S., Shu, Y.Z. 1999. Novel strategies for the discovery of plant-derived

anticancer agents. Pure Appl Chem, 71:1611-1618.)

3. Darise, M., Kohda, H., Mizutani, K., Tanaka, O. 1982. Eurycomanone and

eurycomanol, quassinoids from the roots of Eurycoma longifolia.

Phytochemistry. 21:2091-2093

4. Kuo, P.C., Shi, L.S., Damu, A.G., Su, C.R., Huang, C.H., Ke, C.H. 2003.

Cytotoxic and antimalarial beta-carboline alkaloids from the roots of

Eurycoma longifolia. J Nat Prod. 66:1324-1327.

5. Chan, K.L., Lee, S.P.,Yuen, K.H. 1995. Antipyretic activity of quassinoids

from Eurycoma longifolia Jack. Planta Medica : 219 .

6. Chan, K.L., O’Neill, M.J., Phillipson, J.D., and Warhurst, D.C. 1986. Plants

as Source of Antimalarial Drugs. Part 3. Eurycoma longifolia. Planta Medica

52(2): 105 – 107.

7. Kardono, L.B.S., Angerhofer, C.K., Tsauri, S., Padmawinata, K., Pezzuto,

J.M., and Kinghorn, A.D., 1991. Cytotoxic and Antimalarial Constituents of

The Roots of Eurycoma longifolia. Journal of Natural Product. 54: 1360-

1367

8. Jiwajinda, S., Santisopasri, V., Murakami, A., Kawanaka, M., Kawanaka, H.,

Gasquet, M. 2002. In Vitro Anti-tumor promoting and Anti-parasitic

Activities of the Quassinoids from Eurycoma longifolia, a Medicinal Plant in

Southeast Asia. J. Ethnopharmacol. 82: 55–58.

9. Kuo, P.C., Damu, A.G., Lee, K.K., and Wu, T.S. 2004. Cytotoxic and

Antimalarial Constituent from The Roots of Eurycoma longifolia. Journal of

Bioorganic Medicinal Chemistry. 12: 537 -544.

10. Tee, T.T., Cheah, Y.H., Hawariah, L.P. 2007. F16, a fraction from Eurycoma

longifolia jack extract, induces apoptosis via a caspase-9-independent manner

in MCF-7 cells. Anticancer Res. 27:3425-3430.

11. Tada, H., Yasuda, F., Otani, K., Dotenchi, M., Ishihara, Y., and Shiro, W.

1991. New Antiulcer Quassinoids from Eurycoma longifolia. European

Journal of Medicinal Chemistry. 26: 345 – 349.

12. Wong, P., Cheong, W., Shu, M., Teh, C., Chan, K. and Bakar, S. A. 2012.

Eurycomanone Suppresses Expression of Lung Cancer Cell Tumor Markers,

Prohibitin, Annexin 1 and Endoplasmic Reticulum Protein 28.

Phytomedicine. 19: 138–144

13. Zakaria Y, Rahmat A, Pihie AH, Abdullah NR, Houghton PJ (2009)

Eurycomanone induce apoptosis in HepG2 cells via upregulation of p53.

Cancer Cell Int 9:16

14. Mosman, T. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Celluler Growth and

Survival Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of

Immunology Method. 65: 55 – 63.

15. Tada, H., Shiho, O., Kuroshima, K., Koyama, M., and Tsukamoto. 1986. An

Improved Colorometric Assay for Interleukin-2. Journal of Immunology

Method. 93 (2): 157-165.

ACKNOWLEDGEMENT

This study was supported by Ministry of Education and Culture of Indonesia. The

authors would like to thank University of Syiah Kuala for this grant. The authors

are grateful to Indonesian Institute of Sciences (LIPI) for analyzing our synthesis

compounds (Mrs.Sofa Fajriah for NMR analysis and Mrs. Puspa Dewi for helping

in LC-MS analysis).

Table 1. The IC50 of eurycomanone and its derivatives on selected cancer cell lines and Vero cells

Table 2. The selectivity index of eurycomanone and its derivetives on selected cancer cell lines

and Vero cells