LAPORAN AKHIR
PENELITIAN FUNDAMENTAL
SINTESIS TURUNAN EURIKUMANON, KAJIAN AKTIVITAS DAN
KEAMANANNYA SEBAGAI ANTIKANKER
Tahun ke-1 dari rencana 1 tahun
Ketua / Anggota Tim
Dr. HANIFAH YUSUF, M.KES, APT / 0011095703
dr. DARMA SATRIA, M.Si / 0011088301
dr. ZULKARNAIN, M.Sc / 0025098302
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA
NOVEMBER 2014
LAPORAN AKHIR
PENELITIAN FUNDAMENTAL
SINTESIS TURUNAN EURIKUMANON, KAJIAN AKTIVITAS DAN
KEAMANANNYA SEBAGAI ANTIKANKER
Tahun ke-1 dari rencana 1 tahun
Ketua / Anggota Tim
Dr. HANIFAH YUSUF, M.KES, APT / 0011095703
dr. DARMA SATRIA, M.Si / 0011088301
dr. ZULKARNAIN, M.Sc / 0025098302
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA
NOVEMBER 2014
RINGKASAN
Eurikumanon dari akar tumbuhan pasak bumi (Eurycoma longifolia, Jack) telah
terbukti memiliki aktivitas antikanker. Penelitian tentang “Sintesis Turunan
Eurikumanon, Kajian Aktivitas dan Keamanannya Sebagai Antikanker”
bertujuan untuk mendapatkan antikanker baru. Penelitian ini diawali dengan
ekstraksi serbuk akar pasak bumi dengan metanol, kemudian difraksinasi dan
isolasi. Eurikumanon yang diperoleh ditentukan strukturnya secara spektroskopi.
Selanjutnya eurikumanon ini digunakan sebagai starting material untuk
mensintesis turunannya secara esterifikasi dengan farmakofor asetilklorida,
butirilklorida, valerilklorida, para-metoksi benzoilklorida dan suksinat anhidrida.
Eurikumanon dan turunannya diuji aktivitas antikankernya secara in vitro dengan
metode MTT assay terhadap sel T47D, MCF-7, Hela, WIDR dan sel Vero.
Aktivitas antikanker (nilai IC50) ditentukan secara analisis regresi linear. Nilai
IC50 merupakan konsentrasi senyawa uji yang mampu menghambat pertumbuhan
50% sel kanker. Hasil ekstraksi diperoleh ± 60g (6%) ekstrak kental dan fraksinasi
terhadap ekstrak ini diperoleh 25 g (2,5%) fraksi terkonsentrasi eurikumanon.
Isolasi eurikumanon dari fraksi ini diperoleh eurikumanon 0,04%. Hasil sintesis
turunan eurikumanon diperoleh eurikumanon triasetat 65,25% (C26H30O12 ,BM
534,58); eurikumanon dibutirat 60,35% ( C28H36O11, BM 548,94); eurikumanon
monovalerat 55,10% (C25H32O10 ,BM 492,82; eurikumanon dimetoksibenzoat
50,10% (C36H36O13 , BM 676); dan eurikumanon disuksinat 65,25% (C28H30O15 ,
BM 606,86). Hasil uji eurikumanon terhadap sel T47D (IC50 1,17 ± 0,09 µg/mL),
MCF-7(IC50 3,96 ± 0,02 µg/mL), Hela (IC50 2,95 ± 0,08 µg/mL),WIDR (IC50 1,45
± 0,01 µg/mL) dan sel Vero (IC50 609,89 ± 29,77 µg/mL). Turunan eurikumanon
yaitu eurikumanon triasetat memiliki aktivitas antikanker terhadap T47D (IC50
1,08 ± 0,07µg/mL), MCF-7 (IC50 3,09 ± 0,03 µg/mL) dan Hela (IC50 1,21 ± 0,05
µg/mL).Tetapi eurikumanon triasetat tidak aktif terhadap sel WIDR (IC50 25,06 ±
0,59 µg/mL) dan tidak aman terhadap sel Vero (IC50 1,74 ± 0,99 µg/mL).
Eurikumanon dan turunannya yaitu eurikumanon dibutirat, eurikumanon
monovalerat dan eurikumanon dimetoksibenzoat memiliki indeks selektivitas >3
dan termasuk dalam kategori selektivitas tinggi (aman), tetapi senyawa tersebut
tidak memiliki aktivitas terhadap sel kanker T47D, MCF-7, Hela dan WIDR.
Eurikumanon disuksinat tidak aktif terhadap sel kanker T47D, MCF-7, Hela,
WIDR dan sel Vero.
PRAKATA
Alhamdulillahirabbilaalamin, segala puji dan syukur dipanjatkan ke hadirat Allah
SWT atas Rahmat dan HidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan
penulisan laporan kemajuan penelitian hibah fundamental yang berjudul “Sintesis
Turunan Eurikumanon, Kajian Aktivitas dan Keamanannya Sebagai
Antikanker ”. Penelitian ini dilakukan dalam upaya menemukan antikanker baru
dan diharapkan dapat membantu mengatasi permasalahan kanker. Penulis
menyadari dalam melakukan penelitian dan penulisan laporan masih banyak
keterbatasan, namun dengan bantuan moril dan materil dari berbagai pihak
semuanya dapat diselesaikan.
Laporan ini dibuat dalam rangka mempertanggungjawabkan penggunaan dana
penelitian yang telah diberikan kepada kami dan pada kesempatan ini peneliti
mengucapkan terimakasih kepada:
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Republik Indonesia, yang telah memberikan dana penelitian ini.
2. Rektor Universitas Syiah Kuala Darussalam Banda Aceh, yang telah
memberikan kesempatan untuk mengikuti penelitian ini.
3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Syiah Kuala dan seluruh staf, yang telah
memberi arahan agar kami ikut dalam program penelitian ini
4. Kepala Bagian/ Laboratorium Farmakologi & Terapi Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada serta staf yang telah memberi fasilitas selama kami
melakukan penelitian.
5. Kepala Bagian / Laboratorium Parasistologi Fakultas Kedokteran Universitas
Gadjah Mada serta staf yang telah memberi fasilitas selama kami melakukan
penelitian
6. Terimakasih juga disampaikan kepada keluarga dan semua pihak yang telah
membantu dan memberikan dorongan selama pelaksanaan penelitian ini.
Semoga Allah SWT membalas dengan kebaikan dan rahmat yang berlimpah.
Amin Ya Rabbal Alamin.
Banda Aceh, 10 November 2014
Ketua Tim Peneliti
Hanifah Yusuf
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL ........................................................... i
HALAMAN PENGESAHAN.......................................................... iii
RINGKASAN ....... ................................................... iv
PRAKATA ....................................................... v
DAFTAR ISI ........................................................... vi
DAFTAR TABEL ....................................................... vii
DAFTAR GAMBAR ....................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................... ix
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Penelitian................................................. 1
1.2. Permasalahan Penelitian........................................................ 2
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengembangan Antikanker Melalui Modifikasi Struktur...... 3
2.2. Aktivitas Antikanker Senyawa Kuasinoid dari Akar
Pasak Bumi (Eurycoma longifolia, Jack)......................... 4
2.3. Studi Pendahuluan Yang Telah Dilaksanakan Dan Hasil
Yang Dicapai ......................................................... 4
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan Penelitian ....................................................... 6
3.2. Manfaat Penelitian ....................................................... 6
BAB 4. METODE PENELITIAN
4.1. Jenis, Rancangan dan Subyek Penelitian........................ 7
4.2. Tempat Penelitian ....................................................... 7
4.3. Bahan-Bahan Penelitian .................................................. 7
4.4. Alat-Alat Penelitian ....................................................... 8
4.5. Cara penelitian .............................................................. 9
4.5.1. Ekstraksi, fraksinasi dan isolasi senyawa eurikumanon 9
4.5.2. Sintesis Turunan Euriumanon .................................... 11
4.5.3. Uji aktivitas antikanker turunan eurikumanon .......... 12
4.5.4. Uji sitotoksisitas turunan eurikumano terhadap sel Vero 14
BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Isolasi Eurikumanon dari Akar Pasak Bumi ................ 15
5.2. Identifikasi Struktur Kimia Eurikumanon (Isolat 2)..... 17
5.2.1. Interpretasi spektrum UV eurikumanon (Isolat 2)..... 17
5.2.2. Interpretasi spektrum IR eurikumanon (Isolat 2)....... 18
5.2.3. Interpretasi spektrum LC-MS ESI Ion Positif
eurikumanon (Isolat 2)..... .......................................... 19
5.2.4. Interpretasi spektrum 1
H-NMR eurikumanon (Isolat 2) 20
5.2.5. Interpretasi spektrum 13
C_NMR eurikumanon (Isolat 2) 21
5.3. Hasil Sintesis Turunan Eurikumanon .......................... 28
5.3.1. Eurikumanon triasetat ............................................... 28
5.3.2. Eurikumanon dibutirat ............................................... 29
5.3.3. Eurikumanon monovalerat ........................................ 29
5.3.4. Eurikumanon dimetoksibenzoat ................................ 29
5.3.5. Eurikumanon disuksinat ........................................... 29
5.4. Hasil Uji Aktivitas Antikanker Eurikumanon dan Turunannya 29
5.5. Indeks Selektivitas Eurikumanon dan Turunannya ....... 31
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan ..................................................... 34
6.2. Saran ..................................................... 35
DAFTAR PUSTAKA ..................................................... 36
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Gugus fungsional eurikumanon (isolat 2)
berdasarkan spektrum IR.................................... 19
Tabel 2. Nilai IC50 eurikumanon dan turunannya pada sel
normal (Vero) dan sel kanker (T47D, MCF-7, Hela
dan WIDR)......................................................... 30
Tabel 3. Nilai indeks selektivitas (IS) eurikumanon dan
turunannya pada sel kanker (T47D, MCF-7, Hela
dan WIDR)........................................................ 32
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur eurikumanon ................................. 3
Gambar 2. Bagan penelitian terhadap akar pasak bumi 10
Gambar 3. Bagan ekstraksi, fraksinasi, isolasi eurikumanon 11
Gambar 4. Bagan sintesis turunan eurikumanon ........... 12
Gambar 5. Bagan Uji Sitotoksisitas terhadap sel Vero.. 14
Gambar 6. Profil KLT-p eurikumanon (isolat 2) di bawah
Lampu UV pada λ 254 nm dengan fase diam
Silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat –
Etanol-air (100 : 30 : 1) .............................. 16
Gambar 7. Spektrum UV eurikumanon (isolat 2)......... 17
Gambar 8. Spektrum IR eurikumanon (isolat 2) .......... 18
Gambar 9. Kromatogram LC eurikumanon (isolat 2)... 20
Gambar 10. Spektrum MS eurikumanon (isolat 2) ........ 20
Gambar 11. Spektrum 13
C-NMR eurikumanon (isolat 2) 22
Gambar 12. Spektrum DEPT Slate eurikumanon (isolat 2) 23
Gambar 13. Spektrum 1H-NMR eurikumanon (isolat 2) 23
Gambar 14. Spektrum 1H-
1H-COSY eurikumanon (isolat 2) 24
Gambar 15. Spektrum HMQC eurikumanon (isolat 2)... 25
Gambar 16. Spektrum HMBC eurikumanon (isolat 2)... 26
Gambar 17. Korelasi HMBC eurikumanon (isolat 2)..... 27
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Penelitian
Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) melaporkan kematian akibat penyakit
kanker sekitar 13% setiap tahunnya (WHO, 2010). Insidensi kanker terbanyak
adalah kanker payudara 22,9% dan kanker leher rahim (serviks) 8,8% dari total
kanker pada wanita (World Cancer Research Fund Internasional, 2008).
Permasalahan kanker semakin rumit, karena kebanyakan kasus dijumpai pada
stadium lanjut yang menyebabkan angka bertahan hidup (survival rate) rendah,
dan membutuhkan biaya mahal untuk penanganannya.
Secara umum keberhasilan terapi kanker relatif masih rendah, hal ini
disebabkan adanya keterbatasan dalam penggunaan antikanker terkait dengan
keamanannya, karena hampir semua antikanker selain membunuh sel kanker juga
menyebabkan kerusakan dan kematian pada sel-sel normal. Faktor biaya yang
mahal juga menjadi kendala utama dalam menurunkan morbiditas dan mortalitas
akibat kanker termasuk adanya resistensi terhadap antikanker. Oleh karena itu
diperlukan upaya penemuan dan pengembangan antikanker baru yang lebih
potensial, aman dan murah. Ada beberapa strategi dalam upaya penemuan dan
pengembangan antikanker baru, diantaranya melalui semisintesis, sintesis murni
dan eksplorasi bahan alam yang sudah terbukti khasiatnya (Gibbs, 2000).
Salah satu tumbuhan yang berkhasiat antikanker adalah akar tumbuhan
pasak bumi (Eurycoma longifolia, Jack), famili Simarubaceae. Akar tumbuhan ini
mengandung senyawa kuasinoid, alkaloid kantin-6-on, alkaloid β karbolin,
turunan triterpen trikullan, turunan skualen dan bifenolneolignan (Guo et al.,
2005; Kuo et al., 2004). Pasak bumi (E. longifolia Jack.) dinyatakan berkhasiat
sebagai tonik, afrodisiak, antikanker, antipiretik, antiulcer, antiinflammasi,
antidiabetes dan antimalaria (Kuo et al., 2003). Secara in vitro, ekstrak etanol akar
pasak bumi memiliki aktivitas antiproliferatif terhadap sel kanker payudara MCF-
7 dan T47D (Nurhanan, 2005; Nurani, et al., 2008). Penelitian ekstrak etanol akar
pasak bumi terhadap kanker payudara tikus yang diinduksi dengan DMBA
membuktikan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas antikanker (Nurani dan
Akrom 2009). Alkaloid β karbolin dan kuasinoid dari akar pasak bumi memiliki
khasiat antikanker (Kuo et al., 2003, Kardono et al 1991). Kuasinoid
eurikumanon dari akar pasak bumi asal Kalimantan terbukti memiliki aktivitas
antikanker terhadap sel karsinoma nasofaring dengan nilai IC50 1,9µg/mL,
fibrosarcoma 0,2µg/mL, melanoma 8,2µg/mL, kanker paru 14,3µg/mL, kanker
payudara 1,1µg/mL dan kanker kolon 1,2µg/mL (Kardono et al. 1991).
Pada penelitian ini eurikumanon dipilih sebagai senyawa target untuk
sintesis senyawa turunannya, karena daya hambat pertumbuhan sel kanker lebih
potensial dan senyawa ini terdapat dalam konsentrasi tinggi di dalam akar pasak
bumi (Chan et al., 2004). Tujuan sintesis turunan eurikumanon adalah untuk
mendapatkan senyawa baru yang kemungkinan memiliki potensi lebih baik dari
senyawa asal, spesifik, sensitif, aman, murah dan mudah digunakan. Pereaksi
untuk mensintesis turunan eurikumanon adalah asetilklorida, butanoilklorida,
valerilklorida, suksinat anhidrida dan metoksibenzoilklorida. Senyawa hasil
semisintesis akan diuji aktivitas sitotoksiknya terhadap beberapa sel kanker
MCF-7, T47D, Hela, WIDR termasuk uji keamanannya terhadap sel Vero.
Penelitian tentang sintesis turunan eurikumanon sebagai antikanker sebatas
pengetahuan peneliti belum pernah dilakukan. Penelitian ini diharapkan akan
memberi kontribusi yang positif terhadap perkembangan terapi kanker dan
antikanker yang dihasilkan hendaknya sesuai dengan harapan serta berpeluang
besar untuk dipatenkan atau mendapatkan hak atas kekayaan intelektual (HAKI).
1.2. Permasalahan Penelitian
Berdasarkan hal-hal tersebut diatas, maka rumusan masalah penelitian
adalah:
1. Apakah hasil sintesis turunan eurikumanon dari eurikumanon akar pasak
bumi dengan senyawa pereaksi asetilklorida, butanoilklorida,
valerilklorida, suksinat anhidrida dan metoksibenzoil klorida memiliki
aktivitas antikanker terhadap sel Hela, MCF-7, T47D dan WIDR secara
in vitro ?
2. Bagaimana keamanan eurikumanon dan turunannya terhadap sel normal
(sel Vero) secara in vitro ?
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengembangan Antikanker Melalui Modifikasi Struktur
Kanker merupakan penyakit akibat rusaknya mekanisme pengaturan
perilaku sel yaitu mekanisme pertumbuhan dan differensiasi sel. Pada kanker sel-
sel tumbuh tidak terkendali dan menginvasi jaringan dan organ lainnya sehingga
terjadi gangguan pada situs yang bersangkutan. Terapi kanker saat ini adalah
secara kemoterapi, pembedahan, dan radioterapi yang relatif kurang efektif untuk
menurunkan tingginya insidensi, angka kematian dan meningkatkan angka
harapan hidup penderita. Oleh karena itu pengembangan terapi kanker merupakan
tantangan utama dalam riset kanker, salah satunya adalah upaya penemuan dan
pengembangan antikanker baru yang efektif, selektif dan aman.
Sintesis obat melalui modifikasi struktur kimia akan menghasilkan senyawa
dengan karakteristik yang berbeda sifat fisikokimia maupun sifat
farmakologisnya. Tujuannya adalah untuk mendapatkan senyawa yang lebih
potensial, spesifik, aman untuk dikembangkan sebagai obat baru atau
prekursornya (Lee dan Nguyen, 1993). Kar (2004) menyatakan bahwa perubahan
struktur molekul suatu senyawa akan menyebabkan adanya variasi dalam sifat
fisikokimia dan aktivitas farmakologisnya.
Eurikumanon merupakan kuasinoid pentasiklik yang dapat dimodifikasi
strukturnya melalui sintesis untuk mendapatkan turunannya yang diharapkan
memiliki aktivitas antikanker lebih potensial dari senyawa asal. Struktur kimia
eurikumanon ditunjukkan pada Gambar 1.
O
O
O
H H
OH
OH
HO
H
OH O
1
2
3
45
6
7
89
10
11
12
13
14
15
1617
18
1920
21
OH
Gambar 1. Struktur Eurikumanon
Karakteristik struktur kimia eurikumanon adanya α – β keton tidak jenuh
dan beberapa gugus OH yang sangat reaktif karena dapat berinteraksi dengan
senyawa pereaksi yang digunakan pada sintesis. Kerangka lakton pada
eurikumanon dapat berkonyugasi dengan senyawa yang bersifat nukleofilik.
Substitusi gugus OH pada atom C-1, C-12 dan C-15 dengan senyawa pereaksi
diperkirakan dapat meningkatkan aktivitas biologinya, karena adanya ikatan
hidrogen intramolekul antara gugus hidroksi (OH) dan oksigen (O) dari enone
pada cincin A, C dan D yang berperan sebagai akseptor nukleofil (Kupchan et al.,
1970).
Substitusi gugus OH pada eurikumanon dalam penelitian ini, dilakukan
tanpa memperhatikan pada posisi atom C yang mana substitusi terjadi. Hasil
sintesis diharapkan akan terbentuk turunan eurikumanon yaitu senyawa
eurikumanon asetat, eurikumanon butirat, eurikumanon valerat, eurikumanon
suksinat dan eurikumanon metoksibenzoat.
2.2. Aktivitas Antikanker Senyawa Kuasinoid dari Akar Pasak Bumi
Ekstrak metanol, butanol, dan kloroform akar pasak bumi memiliki efek
sitotoksik terhadap sel KB, DU-145, RD, MCF-7, CaOV-3, serta MDBK
(Nurhanan, et al., 2005). Eurikumanon dari ekstrak akar pasak bumi sangat
potensial sebagai antikanker dan strukturnya memiliki ikatan rangkap terkonjugasi
dan ikatan α-ß karbonil yang tidak jenuh (Jiwajinda, et.al., 1991; Jiwajinda, et.al.,
2002). Senyawa dengan kerangka seperti ini umumnya memiliki aktivitas
antioksidan yang kuat dan dapat digunakan sebagai penghambat proses
karsinogenesis (Meiyanto, 1999).
2.3. Studi Pendahuluan Yang Telah Dilaksanakan dan Hasil Yang Dicapai
Uji aktivitas ekstrak air, metanol dan kloroform akar pasak bumi (E.
longifolia) membuktikan bahwa ekstrak metanol akar pasak bumi memiliki
aktivitas antikanker pada kultur sel HeLa dengan nilai IC50 berkisar 46,9 – 58,6
μg/mL (Mustofa & Qamariah, 2004). Ekstrak etanol mempunyai potensi
antikanker dan antiproliferatif terhadap sel T47D dibandingkan ekstrak kloroform,
dan air (Nurani, et al., 2008).
Uji toksisitas akut ekstrak metanol akar pasak bumi pada mencit Swiss
diperoleh nilai LD50 sekitar 6128,71 mg/kgBB (Sholikhah & Wijayanti, 2009),
sedangkan pada tikus putih 7498,94 mg/kg BB (Mawaddah, 2011). Eurikumanon
dari ekstrak akar pasak bumi asal Kalimantan terbukti memiliki aktivitas
antikanker terhadap sel karsinoma nasofaring 1,9µg/mL, fibrosarcoma 0,2µg/mL,
melanoma 8,2µg/mL, kanker paru 14,3µg/mL, kanker payudara 1,1µg/mL dan
kanker kolon 1,2µg/mL (Kardono et al. 1991).
Modifikasi struktur kimia eurikumanon melalui semisintesis telah dilakukan
oleh Chan et al. (2005) yaitu 15-O-isovalerileurikumanon, 1,15-di-O-
isovalerileurikumanon, 1,15-di-O-3,3-dimetilakriloileurikumanon dan 1,15-di-O-
benzoileurikumanon. Senyawa-senyawa tersebut telah diuji aktivitasnya sebagai
antiplasmodium dan hasilnya menunjukkan bahwa senyawa monoasil
eurikumanon memiliki aktivitas antiplasmodium yang sebanding dengan aktivitas
eurikumanon, tetapi sitotoksisitasnya pada sel Vero lebih rendah, sedangkan
senyawa diasil eurikumanon menunjukkan aktivitas antiplasmodium dan
sitotoksisitasnya terhadap sel Vero yang lebih rendah dari eurikumanon.
Penelitian pengembangan senyawa aktif dari akar pasak bumi telah
dilakukan sejak tahun 2002 (Mustofa & Sholikhah, 2002). Kajian aktivitas
antikanker dan antimalaria secara in vitro dan in vivo dari berbagai ekstrak akar
pasak bumi telah membuktikan bahwa fraksi mengandung eurikumanon
merupakan fraksi aktif, baik sebagai antimalaria maupun sebagai antikanker.
Yusuf et al. (2013) telah mengisolasi, mengidentifikasi dan membuktikan 4
senyawa dari ekstrak akar pasak bumi sebagai antimalaria in vitro. Pada penelitian
ini senyawa eurikumanon dari akar pasak bumi disintesis turunannya untuk diuji
aktivitasnya sebagai antikanker secara in vitro.
BAB 3
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menemukan senyawa
antikanker baru dari turunan eurikumanon dan secara khusus bertujuan untuk :
1. Mengkaji hasil sintesis turunan eurikumanon sebagai antikanker
terhadap sel Hela, MCF-7, T47D dan WIDR secara in vitro
2. Mengkaji keamanan eurikumanon dan turunannya terhadap sel Vero
secara in vitro.
3.2. Manfaat Penelitian
1. Penelitian ini diharapkan bermanfaat dalam upaya mendapatkan
antikanker baru turunan eurikomanon
2. Hasil penelitian ini memiliki potensi untuk dipatenkan atau mendapatkan
hak atas kekayaan intelektual (HAKI).
3. Secara konseptual keilmuan, penelitian ini penting karena dapat
mengungkapkan bukti-bukti ilmiah tentang aktivitas senyawa turunan
eurikumanon sebagai antikanker.
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1. Jenis, Rancangan dan Subyek Penelitian
Isolasi eurikumanon dari serbuk akar pasak bumi (E. longifolia, Jack.),
semisintesis dan analisis struktur eurikumanon dan turunannya merupakan
penelitian eksploratif. Uji aktivitas antikanker dan sitotoksisitas terhadap sel Vero,
merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan menggunakan “post-test
only with control group design”. Subyek penelitian menggunakan sel kanker
(Hela, MCF-7, T47D, WIDR) dan sel Vero.
4.2. Tempat Penelitian
Proses ekstraksi, fraksinasi, isolasi, sintesis turunan eurikumanon akan
dilakukan di Laboratorium Farmakologi dan Terapeutik FK Unsyiah Banda Aceh,
sedangkan uji aktivitas antikanker akan dilakukan di Laboratorium Parasitologi
FK UGM Yogyakarta.
4.3. Bahan – Bahan Penelitian
1. Akar pasak bumi yang digunakan diambil dari tumbuhan yang berumur 6
tahun yang tumbuh di Hutan Taman Pendidikan Fakultas Kehutanan
Universitas Lambung Mangkurat, Banjar Baru Kalimantan Selatan. Akar
tersebut telah dideterminasi oleh ahli biologi farmasi di Laboratorium
Farmakognosi yaitu : Prof. Dr. Wahyono, SU, Apt dengan nomor spesimen
BF/123/Ident/Det/III/2010.
2. Bahan-bahan untuk proses ekstraksi, fraksinansi, isolasi dan identifikasi
senyawa eurikumanon adalah serbuk akar pasak bumi, eurikumanon standar
(Chromadex, Inc), metanol (Merck), kloroform (Merck), etil asetat (Merck),
etanol (Merck), akuades, plat aluminium silika gel GF254 (Merck), silika gel
60 (Merck), dan silika gel 60 PF254 (Merck).
3. Bahan-bahan untuk proses sintesis turunan eurikumanon adalah
eurikumanon dari akar pasak bumi, asetil klorida (Merck), butiril klorida
(Sigma), valeril klorida (Sigma), para-metoksibenzoil klorida (Sigma)
suksinat anhidrida (Sigma), piridin (Merck), kloroform (Merck), natrium
sulfat anhidrat (Merck), akuades, etil asetat (Merck), natrium klorida, asam
klorida (Merck), etanol (Merck), dan metanol (Merck).
4. Bahan-bahan untuk uji aktivitas antikanker dan sitotoksisitas secara in vitro
adalah eurikumanon, turunan eurikumanon, Sel Hela, MCF-7, T47D,
WIDR, Vero, medium RPMI 1640 (Sigma), HCl (Merck), NaOH (Merck)
HEPES (Sigma), Phosphat Buffer Saline (Gibco) Fungizon (Gibco),
Doksorubisin (Dexa Medica), Fetal Bovine Serum (Sigma), Penisillin-
Streptomisin (Gibco), akuades steril (Kimia Farma), dimetil sulfoksida
(Merck), etanol (Merck), medium M199, thiazolil blue tetrazolium bromide
(MTT), SDS (sodium dodesil sulfat) dan HCl 0,01M.
5. Bahan-bahan untuk identifikasi struktur adalah metanol terdeteurisasi
(CD3OD), kloroform terdeteurisasi (CDCl3), tetrametilsilan, eurikumanon
dan turunannya.
4.4. Alat-Alat Penelitian
1. Alat-alat untuk ekstraksi, fraksinasi, isolasi dan sintesis adalah timbangan
listrik (Sartorius), alat ekstraktor, vacum rotary evaporator, alat-alat gelas,
corong Buchner, alat-alat untuk KLTp, alat-alat untuk KCV, pipa kapiler,
oven, termometer, penangas es, labu leher tiga, statif, pendingin bola,
pengaduk magnetik, lampu UV, kertas saring, lempeng kaca ukuran 20 x 20
cm dan rak untuk lempeng kaca.
2. Alat-alat untuk identifikasi turunan eurikumanon dengan spesifikasi sebagai
berikut spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 240, FTIR Shimadzu 8300 PC;
NMR spektrofotometer JEOL JNM A-500 yang bekerja pada 500MHz (1H-
NMR) dan 125MHz (13
C-NMR) dan LC-MS Mariner Biospektrometri
Hitachi L 6200 dengan sistem ESI (Electrospray Ionisation) Positive Ion.
3. Alat-alat untuk uji aktivitas antikanker dan sitotoksisitas secara in vitro
adalah candle jar (desikkator), lilin cap benteng, filter 0,22 µm (Millex),
incubator (NAPCO) Model 6200, laminar air flow cabinet (Lab Conco,
Purifier Delta Series 36213), culture flask (Nalgene Nunc International,
Denmark), centrifuge eppendorf (seri 5415 D, Jerman), pipet steril, tabung
steril, tabung nitrogen cair (Thermolyne, Biocane TM 4
7 cane), wing INT
Terumo No 19, micropipet (Autoclavable, Nichipet, Japan), microplate
dengan 96 sumuran (Nalgene Nunc International, Denmark), screw capped
conical tubes (Sterilin, Ltd, UK), tabung eppendorf, blue tip, yellow tip,
glass obyek, timbangan listrik, hemositometer (Newbauer), vortex (Genie),
alat-alat gelas dan microscope convocal (Nikon YS 100), Elisa Reader (Bio-
Rad Benchmark Jepang) dan mikroskop.
4.5. Cara Penelitian
4.5.1. Ekstraksi , Fraksinasi dan Isolasi Senyawa Eurikumanon
Isolasi eurikumunanon diawali dengan ekstraksi serbuk akar pasak bumi
secara maserasi dengan metanol, kemudian divakum evaporasi sampai diperoleh
ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental, difraksinasi dengan kloroform-metanol
menggunakan metode Simplex Lattice Design (SLD). Fraksi yang mengandung
eurikumanon dikumpulkan dan diisolasi eurikumanonnya secara kromatografi
lapisan tipis preparatif (KLT-p). Eurikumanon yang diperoleh dimurnikan dan
ditentukan struktur kimianya secara analisis spektroskopi 1D dan 2D. Bagan
isolasi senyawa eurikumanon dari akar pasak bumi disajikan dalam Gambar 3.
UV NMR
Uji antioksidan
MS
IR
Akar Pasak Bumi
Keterangan: Tulisan tebal sudah dilakukan (bold)
Tulisan biasa belum dilakukan
UV Determinasi, Ekstraksi
Fraksinasi, Isolasi dan
purifikasi
IR
RR
R NMR
Identifikasi struktur
Isolat 2 (Eurikumanon)
Eurikumanon dan 3 isolat
lain
MS
Penelitian: Uji aktivitas antimalaria 4
isolat dari ekstrak akar pasak bumi
Uji aktivitas antiplasmodium
Uji mekanisme aksi antimalaria dan
antikanker
Uji Toksisitas akut EAPB
MS
Eurikumanon Hasil Isolasi dari Ekstrak Akar Pasak Bumi
(Eurycoma longifolia, Jack), Uji Aktivitas Antimalaria dan
Antikanker Secara In Vitro
Semisintesis Eurikumanon dengan pereaksi asetilklorida, butanoilklorida, valerilklorida,
klorbenzoilklorida dan metoksibenzoilklorida, uji aktivitas sebagai antikanker secara In Vitro
Rekomendasi struktur yang rasional, uji aktivitas dan keamanan antikanker dan
antimalaria secara in vivo pada hewan coba
Pengembangan struktur turunan eurikumanon dan analisa hubungan antara struktur-
aktivitasnya sebagai antikanker dan antimalaria
Uji sitotoksisitas pada sel Vero
Kajian Farmakokinetika Turunan Eurikumanon pada Hewan Coba
UJI KLINIK TAHAP I
Gambar 2. Bagan Penelitian Terhadap Akar Pasak Bumi
Identifikasi isolat, 1, 3 dan 4
Maserasi, MeOH (5 liter), 5 X
Vakum evaporasi
PemurnianKLT-p
Gambar 3. Bagan Ekstraksi, Fraksinasi dan Isolasi Eurikumanon
4.5.2. Sintesis Turunan Eurikumanon
Sejumlah eurikumanon dimasukkan ke dalam labu leher tiga yang
dilengkapi dengan pendingin bola yang terhubung dengan air keran, termometer,
corong penetes, pengaduk magnetik dan penangas es. Eurikumanon dilarutkan
dengan 1 mL piridin, lalu ditambah senyawa pereaksi (asetilklorida, butanoil
klorida, valerilklorida, suksinilanhidrida dan metoksibenzoil klorida) di dalam
10mL kloroform. Campuran ini direfluks selama beberapa jam, bila telah
terbentuk produk, didinginkan dan ditambah 10 mL HCl 2 M. Selanjutnya
Identifikasi Serbuk
Akar Pasak Bumi Filtrat
Ekstrak kental Akar Pasak Bumi
Monitor eurikumanon, KLT, SUV
Isolat Eurikumanon dikerok
secara terpisah dan
dimurnikan
Eurikumanon dan turunannya digunakan untuk uji aktivitas
antikanker,sitoksisitasnya terhadap sel Vero secara in vitro dan identifikasi struktur
kimianya ditentukan melalui analisa spektroskopi SUV, IR, NMR dan MS
Monitor eurikumanon, KLT, SUV
Fraksi2 mengandung eurikumanon
dikumpulkan
Eurikumanon murni
digunakan untuk semisintesis
KCV, FG KMA gradien polaritas
Monitor eurikumanon, KLT, SUV
Bukti kemurnian secara KLT dan analisa
spektroskopi 1D dan 2D
Pereaksi asetilklorida, butanoilklorida,
valerilklorida, suksinat anhidrida dan
metoksibenzoilklorida
Serbuk Kering Akar Pasak Bumi (1 kg)
diekstraksi dengan etilasetat, lalu lapisan etilasetat dicuci dengan 10mL air.
Selanjutnya lapisan etilasetat ditambah natrium sulfat anhidrat dan dikeringkan.
Bagan semisintesis turunan eurikumanon ditunjukkan pada Gambar 4.
1. ( T= 00C, aduk-aduk, 1 jam, penangas es
2.
Pereaksi + 10 mL CHCl3
Refluks, ± 8 jam, T= 600C, KLT monitoring
HCl 2M, 10mL
Ekstraksi dengan Etil asetat
Lapisan Etil asetat dicuci dengan Akuades
Pisahkan lapisan Akuades dan Etil asetat
3. Loform
Gambar 4. Bagan Sintesis Turunan Eurikumanon
4.5.3. Uji Aktivitas Antikanker Turunan Eurikumanon
1.Kultur Sel kanker
Sel kanker (Hela, MCF-7, T47D, WIDR) dan sel Vero diambil dari tangki
nitrogen cair, dicairkan pada suhu 37oC, lalu dimasukkan ke dalam conical tube
dan disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit di dalam ruang laminair
air flowt. Endapan sel ditambah media penumbuh, kemudian dipindahkan ke
dalam culture flask dan diinkubasikan dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC.
Setiap hari perkembangbiakan sel kanker dan Vero diamati dan media penumbuh
diganti dengan media baru. Suspensi sel dibagi menjadi beberapa kultur dalam
culture flask steril, lalu diinkubasi dalam inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC.
Campuran Eurikumanon
+ 1 mL Piridin
Turunan eurikumanon
Lapisan Etil asetat Residu
Natrium sulfat anhidrat
2. Panen sel
Setelah jumlah sel cukup, medium diganti dengan medium baru dan sel
dilepas dari dinding culture flask, kemudian dipindahkan ke dalam conical tube
steril dan ditambah medium PBS sampai volume 10 ml. Selanjutnya disentrifus
pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Kemudian sel dicuci 2 kali
menggunakan medium yang sama, dan dihitung jumlah selnya menggunakan
hemocytometer. Lalu suspensi sel ditambah dengan sejumlah medium sampai
diperoleh konsentrasi 5 x 104 sel/100 l dan sel ini siap digunakan untuk uji .
3. Pembuatan Larutan Uji Turunan Eurikumanon
Pembuatan larutan uji dilakukan secara aseptis dimulai dengan larutan stok
yang dibuat dengan melarutkan masing-masing senyawa uji 10 mg dalam 100 uL
DMSO pro kultur. Selanjutnya dibuat serial konsentrasi larutan uji dalam media
penumbuh dan uji disaring dengan filter 0,2 m ke dalam conical tube steril.
4. Uji Aktivitas Antikanker
Sel Hela, MCF-7, T47D dan WIDR yang telah dikulturkan dalam media
DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin, dimasukkan ke dalam sumuran
mikroplat dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam bersama
senyawa uji dan doxorubicin dalam serial konsentrasi tertentu. Pada akhir
inkubasi, kepada masing-masing sumuran ditambahkan 10 l MTT kadar 5
mg/ml. Kemudian diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37o C. Sel yang hidup
akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Reaksi MTT dihentikan
dengan reagen stopper SDS 10 % dalam 0,01 % HCl sebanyak 100 ul, lalu
diinkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada
panjang gelombang 550 nm.
Analisis statistik pada uji aktivitas antikanker menggunakan analisis
regresi probit untuk menentukan nilai IC50 dari masing-masing senyawa. Analisis
regresi probit diperoleh dari konversi persentase viability cells, yang dihitung
dengan menggunakan rumus :
% viability cells = [(A-B)/(C-B) ] x 100 %
A : Absorbansi perlakuan
B : Absorbansi medium
C : Absorbansi sel kontrol
4.5.4. Uji Sitotoksisitas Turunan Eurikumanon Terhadap Sel Vero
Cara kultur sel Vero sama dengan sel kanker, uji sitotoksisitas terhadap sel
Vero menggunakan mikroplat 96 sumuran dengan cara memasukkan 100µl media
komplit yang mengandung 10.000 sel Vero. Mikrokultur diinkubasi selama 24
jam pada suhu 370C di dalam inkubator 5% CO2. Setelah itu 100µl senyawa uji
dari berbagai konsentrasi ditambahkan dan sebagai kontrol negatif adalah
sumuran yang mengandung sel Vero dengan media komplit dan sumuran berisi
media. Mikrokultur tersebut diinkubasi kembali selama 24 jam pada temperatur
370C dalam inkubator 5% CO2.
Setelah itu media dibuang, lalu ditambahkan 100µl media komplit dan 10µl
thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT 5mg/ml) dan diinkubasi selama 4 jam
pada temperatur 370C dalam inkubator 5% CO2. Selanjutnya ditambahkan 100µl
SDS dalam HCl 0,01 % ke dalam mikroplat dan diinkubasi kembali selama 18
jam pada temperatur kamar dan absorbansinya dibaca (untuk sel hidup) dengan
Elisa reader pada panjang gelombang 595nm. Analisa statistik sama seperti pada
uji aktivitas antikanker. Bagan uji sitotoksisitas (antikanker) terhadap sel MCF-7,
T47D, Hela, WIDR dan sel Vero secara umum ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5. Bagan Uji Sitotoksisitas (Keamanan) Terhadap Sel Vero
100 µl media komplit (10.000 sel kanker dan sel Vero)
/sumuran, diinkubasi CO2, 370C , 24 jam
Tambahkan 100 µl obat uji, kontrol negatif sel Vero + media komplit,
sumuran berisi media komplit, diinkubasi CO2, 370C, 24 jam
Media dibuang
Tambah 100 µl media komplit dan 10 µl MTT, diinkubasi CO2, 370C, 4 jam
Tambah 100 µl SDS 10% dalam HCl 0,01 %, diinkubasi pada temperatur kamar , 18 jam.
Baca absorbansi dengan Elisa Reader pada panjang gelombang 595 nm
BAB 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Isolasi Eurikumanon dari Akar Pasak Bumi
Proses isolasi eurikumanon diawali dengan maserasi akar pasak bumi
dengan metanol. Ekstrak cair yang diperoleh, divakumevaporasi pada temperatur
400C. Ekstrak kental yang diperoleh 60 g (6%) dan keberadaan eurikumanon
dipantau secara KLT dengan menggunakan plat aluminium silika gel GF254 yang
dielusi dengan fase gerak yang terdiri dari kloroform : metanol : air (6,5 : 2,5 :
0,4), lalu hasilnya dibandingkan dengan eurikumanon standar dari Chromadex
Inc. Hasil pemantauan menunjukkan bahwa ekstrak akar pasak bumi mengandung
eurikumanon yang ditandai dengan adanya bercak berfluoresensi warna ungu
yang sejajar dengan bercak eurikumanon standar dari Chromadex Inc dibawah
lampu UV pada λ 254 nm dan tidak berpendar pada λ 366 nm.
Proses isolasi eurikumanon dari ekstrak tersebut dilakukan secara bertahap
melalui fraksinasi dengan fase gerak yang berbeda-beda polaritasnya secara
kromatografi cair vakum dengan fase diam silika gel G60 dan 110 mL fase gerak
yang terdiri dari kloroform : metanol : air dalam ratio perbandingan 5:5:1; 3:7:1;
1:9:1. Hasil fraksinasi 6 fraksi (fraksi I, II, III, IV, V dan VI), dan masing-masing
fraksi ditampung di dalam cawan porselin sebanyak 50 mL. Hasil pemantauan
terhadap fraksi-fraksi ini, diperoleh bahwa eurikumanon terkonsentrasi pada
fraksi I dan II, lalu kedua fraksi ini digabung dan dievaporasi dan diperoleh fraksi
eurikumanon 25 g (2,5%).
Isolasi eurikumanon dari fraksi eurikumanon (FE) dilakukan secara KLT-p
dengan menotolkan fraksi tersebut dalam bentuk pita pada lempeng kaca silika gel
GF254 ukuran 20 X 20 cm, lalu dielusi dengan fase gerak yang terdiri dari
kloroform : metanol: air (80: 30). Hasil pemantauan menunjukkan bahwa ada pita
berfluoresensi warna biru terang yang ditandai sebagai isolat 1 dan pita berwarna
ungu sebagai isolat 2 yang diduga sebagai eurikumanon dibawah lampu UV pada
λ 254 nm dan pada λ 366 nm isolat 1 terlihat berupa pita berfluoresensi warna
biru, sedangkan isolat 2 tidak berpendar.
Kedua isolat tersebut dikerok secara terpisah yang diawali oleh isolat 2
karena isolat tersebut diperkirakan eurikumanon. Pemurnian dilakukan secara
KLTp menggunakan fase gerak kloroform : metanol : air (80 : 30). Hasilnya isolat
2 memperlihatkan satu pita di bawah lampu UV pada λ 254 nm, tetapi dibawah
lampu UV λ366 nm memperlihatkan 2 pita yang sangat rapat yaitu pita berwarna
kuning kecoklatan yang diberi tanda dengan isolat 3. Pemurnian isolat 2 dilakukan
berulang kali menggunakan fase gerak yang sama dengan berbagai rasio
perbandingan yang tujuannya untuk memisahkan isolat 2 dari isolat 3, ternyata
isolat tersebut tetap sulit dipisahkan meskipun sudah dilakukan dengan multiple
elution system.
Isolat 3 yang berdekatan dengan isolat 2 dipisahkan dengan menggunakan
fase gerak yang terdiri dari etilasetat : etanol : air dengan perbandingan 100 : 30 :
1. Pada penggunaan fase gerak ini diperoleh bercak isolat 2 berupa satu pita yang
berfluoresensi warna ungu dengan nilai retensi faktor (Rf) = 0,72 dan dapat
dianggap sudah murni bila isolat tersebut tetap menunjukkan satu pita dengan tiga
jenis fase gerak. Kadar isolat 2 yang diperoleh sekitar 0,04% (Gambar 6).
Gambar 6. Profil KLTp eurikumanon (isolat 2) di bawah lampu UV λ 254 nm
dengan fase diam silika GF254 dan fase gerak yang terdiri dari
etilasetat : etanol : air (100 : 30 : 1)
5.2. Identifikasi Struktur Kimia Eurikumanon (Isolat 2)
Isolat 2 yang diduga sebagai eurikumanon diidentifikasi strukturnya melalui
analisis spektroskopi UV, IR, NMR-1D dan 2D serta LC-MS ESI ion positif. Data
berupa spektra UV, IR, 1H-NMR,
13C-NMR, DEPT dan LC-MS ESI ion positif
diperkuat dengan data analisis spektroskopi 2D yaitu, COSY, HMQC dan HMBC.
Hasil interpretasi dibandingkan dengan data referensi eurikumanon yang
diidentifikasi oleh peneliti lain seperti Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991);
Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004) ternyata hasilnya sesuai dengan struktur
eurikumanon.
5.2.1. Interpretasi spektrum UV eurikumanon (isolat 2)
Spektrum UV isolat 2 memberikan serapan maksimum pada 237,5 nm
(Gambar 7). Spektrum tersebut menjelaskan bahwa isolat 2 tidak banyak memiliki
ikatan rangkap atau ikatan tidak jenuh, sehingga serapan energi
elektromagnetiknya berada di daerah ultraviolet. Hal ini sejalan dengan profil
KLT-p yang hanya berfluoresensi warna ungu di bawah lampu UV pada λ 254
nm dan tidak berpendar pada 366 nm.
Gambar 7. Spektrum UV eurikumanon (isolat 2)
5.2.2. Interpretasi spektrum IR eurikumanon (isolat 2)
Analisis spektrum IR isolat 2 (Gambar 8) memberi gambaran berupa pita
serapan pada bilangan gelombang tertentu (Tabel 1). Pita melebar pada 3379,29
menunjukkan bahwa isolat 2 memiliki gugus OH, sedangkan pita pada 1732,08
adalah serapan gugus karbonil (C=O) dari lakton. Hal ini dipertegas pita pada
1055,06 yang mengindikasikan adanya gugus -C-O-C. Gugus keton (C=O) tidak
jenuh α, β terlihat pada 1674,21 dan gugus C=C terdapat pada 1650. Absorpsi
ikatan rangkap Csp2-H (CH2 alifatik) yaitu gugus metilen terdapat pada 2980,02
dan dipertegas oleh serapan pada 1518,33. Gugus CH3 alifatik terdapat pada
2879,72 yaitu gugus metil dan diperkuat oleh adanya serapan pada 1381,03. Hasil
analisis spektroskopi IR menyatakan bahwa isolat 2 memiliki gugus fungsional
OH, C=O, -C-O-C-, C=C, -CH2 dan –CH3 pada struktur kimianya dan hal ini
sesuai dengan struktur kimia senyawa eurikumanon. Gugus fungsi yang diperoleh
pada penelitian ini ternyata sesuai dengan yang didapat oleh Chan et al. (1986);
Kardono et al. (1991); Tada et al. (1991); dan Kuo et al. (2004).
Gambar 8. Spektrum IR eurikumanon (isolat 2)
Tabel 1. Gugus fungsional eurikumanon (isolat 2) berdasarkan spektrum IR
No Bilangan gelombang (cm-1
) Gugus fungsional
1. 3379,29 Hidroksil (OH)
2. 2980,02; 1518,33 Hidrokarbon alifatik (Csp2-H), -CH2
3. 2879,72; 1381,03 Hidrokarbon alifatik (Csp3-H), -CH3
4. 1732,08 C = O lakton
5. 1674,21 C = O keton tidak jenuh α, β
6. 1618,28 C = C
7. 1055,06 -C-O-C-
5.2.3. Interpretasi spektrum LC-MS ESI ion positif eurikumanon (isolat 2)
Kromatogram LC memberi informasi bahwa isolat 2 belum murni (Gambar
9). Puncak pada waktu retensi 2,4 menit diduga berasal dari isolat 2. Analisis
spektrum MS (Gambar 10) memberi informasi bahwa isolat 2 memiliki puncak
ion molekul semu pada m/z 409,02 [M+H)+ (Eichhorn and Knepper, 2001).,
sehingga bobot molekulnya adalah 408,02 dengan formula C20H24O9. Hal ini
sesuai dengan yang diperoleh Chan et al. (1986); Kardono et al. (1991); Tada et
al. (1991) dan Kuo et al. (2004).
Gambar 9. Kromatogram LC eurikumanon ( isolat 2)
Gambar 10. Spektrum MS eurikumanon (isolat 2)
5.2.4. Interpretasi spektrum 1H-NMR eurikumanon (isolat 2)
Analisis spektroskopi NMR merupakan analisis yang sangat penting dalam
menentukan kerangka struktur kimia suatu senyawa, karena spektra yang muncul
memberi gambaran tentang jumlah dan jenis atom hidrogen maupun karbon
(Pavia et al., 2009; Mistry, 2009). Identifikasi isolat 2 dilakukan secara
spektroskopi NMR satu dimensi (1H-NMR,
13C-NMR, DEPT) dan dua dimensi
(COSY, HMQC, HMBC). Spektrum 13
C-NMR isolat 2 (Gambar 11)
memperlihatkan adanya 20 signal resonansi yang memberikan informasi adanya
20 atom karbon. Spektrum DEPT (Gambar 12) memberi informasi bahwa isolat 2
memiliki 8 atom karbon kuarterner, 7 gugus metin, 3 metilen dan 2 gugus metil.
Secara garis besar data tersebut sesuai dengan struktur eurikumanon.
Signal yang paling downfield (δ 6,06, 1H) pada spektrum 1H-NMR (Gambar
13) merupakan resonansi proton posisi 3 cincin 3-sikloheksen-2on (cincin A).
Dua signal masing-masing dengan tinggi integrasi 1H yang muncul pada δ 5,56
dan 5,44 berasal dari dua proton metilen terminal pada posisi 21 yang tidak
ekivalen. Proton metin pada posisi 7 yang terikat pada oksigen δ-lakton yang
muncul pada δ 4,80 (1H) berupa triplet (J = 2,6 Hz), karena mengadakan kopling
dengan dua proton metilen pada posisi 6. Signal resonansi pada δ 4,73; 4,31; dan
3,96 masing-masing berupa singlet (1H) berturut-turut berasal dari proton metin
hidroksi pada posisi 12; 1 dan 15. Dua buah doublet masing-masing dengan
tetapan kopling 9,1 Hz dan tinggi integrasi 1H pada δ 3,89 dan 3,74 merupakan
signal resonansi proton metilen yang tidak ekivalen pada cincin tetrahidrofuran
posisi 20. Proton metin pada posisi 9 muncul singlet (1H) pada δ 3,07, sedangkan
proton metin pada posisi 5 muncul sebagai doublet (broad) pada δ 3,03. Dua buah
multiplet (1H) yang muncul pada δ 2,07 dan 2,34 merupakan signal resonansi dua
proton metilen pada posisi 6, sedangkan 2 buah singlet (3H) pada δ 2,03 dan 1,20
berasal dari dua buah gugus metil pada posisi 18 dan 19.
5.2.5. Interpretasi spektrum 13
C-NMR eurikumanon (isolat 2)
Pada spektrum 13
C-NMR, signal pada 198,95 dan 174,65 berturut-turut
merupakan resonansi gugus karbonil keton pada posisi 2 dan karbonil lakton pada
posisi 16. Resonansi empat karbon oleifenik pada posisi 3 dan 4 serta 13 dan 21
berturut-turut muncul pada δ 126,04; 165,26; 146,23; serta 121,64. Karbon metin
hidroksi (C-1, C-12, C-14, dan C-15) memperlihatkan resonansinya berturut-turut
pada δ 84,40; 80,92; 79,44 dan 71,82. Karbon metin hidroksi pada posisi 11 yang
terikat pada oksigen tetrahidrofuran muncul pada δ 109,27. Signal resonansi
karbon metin hidroksi yang terikat pada oksigen δ lakton muncul pada δ 77,19.
Signal yang muncul pada δ 53,21; 48,12 dan 46,58 berasal dari 3 karbon
kuarterner pada posisi 8, 9 dan 10, sedangkan karbon metin (C-5), metilen (C-6)
dan 2 karbon metil (C-18 dan C-19) berturut-turut muncul pada δ 42,90; 26,19;
23,01 dan 10,14.
Pada spektrum 1H-
1H COSY (Gambar 14), adanya cross peak antara signal
resonansi proton pada δ 5,43 dan 5,55; δ 3,73 dan 3,89 serta δ 2,02 dan 2,28
memperlihatkan adanya kopling geminal berturut-turut antara H-21a dengan H-
21b; H -20a dengan H-20b dan H-6a dengan H-6b. Kopling visinal terdapat antara
H-5 dan H-6a serta H-7 dengan H-6a dan H-6b terlihat dengan adanya cross peak
berturut-turut antara signal resonansi pada δ 3,03 dengan δ 2,02; δ 4,79 dengan δ
2,02 dan δ 2,28.
Verifikasi kerangka eurikumanon dapat dilihat pada spektrum HMBC
(Gambar 15) yang menggambarkan korelasi antara 1H-
13C dan beberapa korelasi
penting yang mendukung kerangka karbon eurikumanon dapat dilihat pada
Gambar 16 dan 17. Keberadaan cincin sikloheksenon (cincin A) ditunjukkan
dengan adanya korelasi antara signal resonansi H-3 dengan C-1, C-5 dan C-18;
signal H-1 dengan C-2, C-5, C-9 dan C-10 serta H-5 dengan C-4. Adanya kopling
sejauh tiga ikatan antara H-7 dengan C-5 dan C-9, H-6b dengan C-7 dan C-8 serta
adanya long range coupling antara H-6b dengan C-9 memberi konfirmasi bahwa
terdapat cincin sikloheksana (cincin B), sedangkan keberadaan cincin C
(sikloheksena) yang mengandung metilen terminal ditunjukkan dengan adanya
korelasi antara signal resonansi H-21a dengan C-14 serta korelasi antara H-21b
dengan C-13 maupun C-14.
Korelasi antara H-15 dengan C-14 menunjukkan keberadaan cincin δ lakton
(cincin D), sedangkan adanya kopling antara H-20a dengan C-7 dan C-14 dan
antara H-20b dengan C-8, C-9 dan C-14 memberi informasi adanya cincin
tetrahidrofuran (cincin E). Berdasarkan analisis spektroskopi tersebut di atas,
maka dapat dipastikan bahwa isolat 2 adalah eurikumanon. Data yang diperoleh
pada penelitian ini ada kemiripan dengan data yang dilaporkan Kardono et al.
(1991); Kuo et al. (2004), Tada et al. (1991) dan Chan et al. (1986).
Gambar 11. Spektrum 13
C-NMR eurikumanon ( isolat 2)
Gambar 12. Spektrum DEPT slate eurikumanon (isolat 2)
Gambar 13. Spektrum 1H-NMR eurikumanon (isolat 2)
5.3. Hasil Sintesis Turunan Eurikumanon
Penemuan obat melalui skrining bahan-bahan alam memberi peluang untuk
mendapatkan senyawa penuntun dengan struktur molekul baru. Senyawa tersebut
dapat dikembangkan untuk mendapatkan turunannya yang mempunyai aktivitas
lebih baik, selektif dengan toksisitas yang lebih rendah. Eurikumanon memiliki
struktur molekul unik yang berbeda dengan antikanker lainnya. Senyawa ini
mempunyai gugus alkohol alisiklik yang dapat diesterifikasi. Bentuk ester tersebut
akan menurunkan polaritas, apalagi bila gugus asilnya mempunyai rantai yang
panjang. Obat-obat dengan polaritas rendah (non polar) tidak terionisasi, sehingga
penetrasinya mudah ke dalam membran lipid menuju target site pada reseptor.
Gugus alkohol alisiklik dari eurikumanon dapat diesterifikasi dengan
asilklorida dan anhidrida asam karboksilat. Esterifikasi ini dilakukan dengan
mereaksikan eurikumanon yang telah dilarutkan di dalam piridin pada temperatur
sangat rendah (00C) dengan asetilklorida, butirilklorida, valerilklorida,
metoksibenzoilklorida dan suksinatanhidrida. Esterifikasi pada gugus alkohol
alisiklik ini dapat terjadi lebih dari satu, karena eurikumanon memiliki lima
gugus OH alisiklik. Reaksi tersebut terbentuk pada gugus OH eurikumanon
dengan oksigen dari asilklorida atau dan anhidrida asam karboksilat. Pada reaksi
ini oksigen karbonil dari asilklorida dan anhidrida asam karboksilat akan
mengalami protonisasi sehingga sangat peka terhadap serangan nukleofil
(nucleophilic attack).
5.3.1. Eurikumanon triasetat
Esterifikasi terhadap eurikumanon menggunakan asetilklorida, diawali
dengan serangan nukleofil gugus OH eurikumanon ke gugus oksigen karbonil
asetilklorida yang sangat reaktif dan menghasilkan senyawa intermediet
tetrahedral. Selanjutnya pasangan elektron dari oksigen memaksa keluar gugus
pergi (klorida) dan menghasilkan eurikumanon triasetat. Eurikumanon triasetat
yang dihasilkan berupa kolloid berwarna kuning muda, berbau aromatis dengan
titik lebur antara 225-2270C. Reaksi tersebut menghasilkan rendemen rata-rata
65,25%. Formula eurikumanon triasetat adalah C26H30O12 dengan BM 534,58.
5.3.2. Eurikumanon dibutirat
Reaksi esterifikasi antara eurikumanon dan butirilklorida menghasilkan
senyawa eurikumanon dibutirat berupa kolloid berwarna kuning kecoklatan,
berbau aromatis dengan titik lebur 241-2430C. Reaksi tersebut memberi hasil rata-
rata 60,35%. Formula eurikumanon dibutirat adalah C28H36O11 dan BM 548,94.
5.3.3. Eurikumanon monovalerat
Reaksi esterifikasi antara eurikumanon dengan valeril klorida menghasilkan
eurikumanon monovalerat berupa senyawa berwarna kuning muda, berbau khas
dengan titik lebur antara 235-2370C dan rendemen rata-rata 55,10%. Formula
eurikumanon monovalerat adalah C25H32O10 dan BM 492,82.
5.3.4. Eurikumanon dimetoksibenzoat
Reaksi sintesis antara eurikumanon dan para-metoksibenzoilklorida
menghasilkan eurikumanon dimetoksibenzoat berupa serbuk berwarna putih,
berbau aromatis dengan titik lebur antara 225-2280C. Reaksi tersebut memberi
hasil rata-rata 50,10%. dengan formula C36H36O13 dan BM 676.
5.3.5. Eurikumanon disuksinat
Reaksi sintesis antara eurikumanon dengan suksinatanhidrida menghasilkan
eurikumanon disuksinat, berupa senyawa berwarna kuning muda, berbau aromatis
dengan titik lebur antara 251-2540C. Rendemen yang diperoleh rata-rata 65,25%
dengan formula C28H30O15 dan BM 606,86.
5.4. Hasil Uji Aktivitas Antikanker
Hasil uji antikanker eurikumanon dan turunannya melalui hambatan
pertumbuhan sel kanker T47D, MCF-7, Hela, WIDR dan sel normal Vero
diperoleh nilai IC50 yang berbeda-beda (Tabel 1). Perbedaan ini kemungkinan
disebabkan karena senyawa uji memiliki target kerja yang berbeda-beda, yang
masih membutuhkan suatu pengkajian lebih lanjut. Berdasarkan kajian terhadap
nilai IC50 yang diperoleh terlihat eurikumanon merupakan senyawa yang lebih
aktif dari turunannya sebagai antikanker. Hal ini terlihat dari nilai IC50 1,17 ±
0,09; 3,96 ± 0,02; 2,95 ± 0,08; 1,45 ± 0,01 µg/mL pada sel T47D, MCF-7, Hela
dan WIDR secara berturut-turut. Sedangkan terhadap sel Vero, eurikumanon
termasuk bahan yang aman, sehingga sangat memungkinkan untuk dilanjutkan
penelitiannya secara in vivo (IC50 = 609,89 ± 29,77 µg/mL).
Tabel 2. Nilai IC50 eurikumanon dan turunannya pada sel normal (Vero)
dan sel kanker (T47D, MCF-7, Hela, WIDR)
Senyawa uji Nilai IC50 (µg/mL) Vero T47D MCF-7 Hela WIDR
Eurikumanon 609,89 ± 29,77 1,17 ± 0,09 3,96 ± 0,02 2,95 ± 0,08 1,45 ± 0,01
E triasetat 1,74 ± 0,99 1,08 ± 0,07 3,09 ± 0,03 1,21 ± 0,05 25,06 ± 0,59
E dibutirat 219,29 ± 11,38 25,16 ± 2,25 21,56 ± 4,55 29,32 ± 1,25 149,42 ± 12,50
E monovalerat 92,40 ± 7,51 25,59 ± 1,31 22,48 ± 1,25 30,14 ± 1,89 91.88 ± 8,90
E dimetoksi benzoat 13.226 ± 6.98 102,77 ± 2,56 38,83 ± 2,55 66,65 ± 1,90 51,61 ± 2,37
E disuksinat 12,75 ± 2,88 218,94 ± 9,30 198,87 ± 5,50 166,67 ± 12,34 145,39 ± 6,67
Doxorubicin 3,54 ± 0,64 1,97 ± 0,05 4,68 ± 0,10 3,51 ± 0,05 41,81 ± 2,25
5-Fluouracil 280,54 ± 10,11 4,03 ± 0,23 3,16 ± 0,11 1, 99 ± 0,01 5,41 ± 1,33
Uji aktivitas antikanker turunan eurikumanon yaitu eurikumanon triasetat
pada sel kanker T47D, MCF-7, Hela, WIDR diperoleh nilai IC50 berturut-turut
1,08 ± 0,07; 3,09 ± 0,03; 1,21 ± 0,05; 25,06 ± 0,59 µg/mL, tetapi senyawa ini
tidak aman terhadap sel normal, hal ini ditunjukkan oleh nilai IC50 sebesar 1,74 ±
0,99 µg/mL. Eurikumanon dibutirat memiliki nilai IC50 pada sel kanker tersebut diatas
sebesar 25,16 ± 2,25; 21,56 ± 4,55; 29,32 ± 1,25; 149,42 ± 12,50 µg/mL dan aman
terhadap sel Vero dengan nilai IC50 219,29 ± 11,38 µg/mL. Uji terhadap sel
kanker yang sama juga sebanding dengan eurikumanon monovalerat (IC50 25,59
± 1,31; 22,48 ± 1,25; 30,14 ± 1,89 µg/mL), akan tetapi tidak demikian terhadap
sel Vero dan WIDR. Eurikumanon dibutirat memiliki IC50 yang sebanding pada
sel Vero dan WIDR ( 92,40 ± 7,51 dan 91,88 ± 8,90 µg/mL).
Aktivitas antikanker eurikumanon dimetoksi benzoat terhadap sel kanker
yang digunakan pada penelitian ini adalah 102,77 ± 2,56; 38,83 ± 2,55; 66,65 ±
1,90; dan 51,66 ± 2,37 µg/mL, sedangkan terhadap sel Vero 132.26 ± 6.98
µg/mL. Salah satu turunan eurikumanon yang diesterifikasi dengan anhidrida
asam karboksilat adalah eurikumanon disuksinat, memiliki nilai IC50 terhadap sel
kanker yang sama yaitu 218,94 ± 9,30; 198,87 ± 5,50; 166,67 ± 12,34 dan 51,61 ±
2,37; 145,39 ± 10,11 µg/mL, sedangkan terhadap sel Vero 12,75 ± 2,88 µg/mL.
Pada penelitian ini digunakan doxorubicin dan 5-fluorourasil sebagai pembanding
dan dari hasil uji diperoleh nilai IC50 Doxorubicin terhadap sel kanker tersebut
diatas adalah sebagai berikut : 1,97 ± 0,05; 4,68 ± 0,10; 3,51 ± 0,05 dan 41,81 ±
2,25 µg/mL. Disamping itu nilai aktivitas sitotoksiknya terhadap sel Vero adalah
3,54 ± 0,64 µg/mL. Aktivitas antikanker 5-fluorourasil terhadap sel kanker ini
adalah 4,03 ± 0,23; 3,16 ± 0,11; 1,99 ± 0,01; 5,41 ± 1,33 µg/mL dan pada sel
Vero 280,54 ± 10,11µg/mL.
Menurut Likhitwitayawuid et al .1993, senyawa murni yang diuji
aktivitasnya terhadap sel kanker dengan nilai IC50 ≤ 4 µg/mL, maka senyawa
tersebut dapat dikategorikan ke dalam senyawa yang sangat aktif dan pengujian
terhadap senyawa tersebut dapat dilanjutkan ke uji preklinik dengan
menggunakan hewan coba. Kategori aktivitas antikanker yang dikemukakan oleh
peneliti lain (Shier, 1991) adalah bila senyawa memiliki nilai IC50 ≤ 5 µg/mL
(sangat aktif); IC50 5,0 – 10,0 µg/mL (aktivitas sedang) dan IC50 10 – 25 µg/mL
(aktivitas lemah).
5.5. Indeks Selektivitas Eurikumanon dan Turunannya
Dalam upaya pengembangan antikanker baru yang bekerja selektif terhadap
sel kanker, diperlukan parameter-parameter tertentu dalam menilai selektivitasnya
baik secara in vitro maupun secara in vivo. Secara in vitro selektivitas antikanker
diukur dari perbandingan antara nilai aktivitas sitotoksik senyawa uji (IC50)
terhadap sel Vero (sel normal) dengan nilai aktivitas sitotoksik (IC50) senyawa uji
yang sama terhadap sel kanker. Nilai ini disebut dengan nilai indeks selektivitas
atau indeks sitotoksisitas (IS). Tabel 2 memberi informasi tentang nilai indeks
selektivitas (IS) eurikumanon dan turunannya. Koech et al. (2005) menyatakan
bahwa senyawa dengan nilai IS ≤ 1 mengindikasikan bahwa senyawa tersebut
tidak selektif (sangat toksik), selektivitas dengan nilai IS ≤ 2 (toksik) dan
senyawa uji dikatakan selektif (aman) bila memiliki nilai IS ≥ 3. Nilai indeks
selektivitas ini tidak berlaku, bila masa inkubasi pada uji aktivitas sitotoksik lebih
dari 24 jam (Jenett-Siem et al., 1999, Ilias and Someylenko, 2007). Syarifah et al.
2011, membuat kategori indeks selektivitas antikanker dengan membagi dalam 3
(tiga) kategori skor yaitu skor 1 = tidak selektif (IS ≤ 1), skor 2 = selektivitas
sedang (IS > 1 < 5) dan skor 3 = selektif (IS ≥ 5).
Tabel 3. Nilai indeks selektivitas (IS) eurikumanon dan turunannya
pada sel kanker (T47D, MCF-7, Hela, WIDR)
Senyawa uji Nilai IS T47D MCF-7 Hela WIDR
Eurikumanon 521,27 154 206,54 420,20
E triasetat 1,61 0,56 1.44 0,07
E dibutirat 8,72 10,17 7,48 1,47
E monovalerat 3,61 3,41 3,07 1,00
E dimetoksi benzoat 128,70 340,61 198,44 256,27
E disuksinat 0,05 0,06 0,08 0,09
Doxorubicin 1,80 0,76 1,01 0,08
5-Fluouracil 69,61 88,78 140,97 52,86
Berdasarkan pernyataan Koech et al. (2005), maka turunan eurikumanon
yang toksik terhadap sel T47D adalah eurikumanon triasetat (IS = 1,61), dan
eurikumanon disuksinat sangat toksik (IS = 0,05), sedangkan eurikumanon yang
digunakan sebagai starting material pada penelitian, eurikumanon dibutirat,
eurikumanon monovalerat dan eurikumanon dimetoksi benzoat termasuk dalam
kategori aman dengan nilai IS berturut-turut 521,27; 8,72; 3,61 dan 128,7. Kontrol
positif yang digunakan pada penelitian ini adalah doxorubicin (IS = 1,80) dan 5-
fluorourasil (IS = 69,61).
Eurikumanon dan 3 (tiga) turunannya yaitu eurikumanon dibutirat,
eurikumanon monovalerat dan eurikumanon dimetoksi benzoat terhadap sel
kanker MCF-7 termasuk dalam kategori aman (IS = 154; 10,17; 3,41; 340,61),
sedangkan yang sangat toksik adalah eurikumanon triasetat dan eurikumanon
disuksinat (IS = 0,56 dan 0,06). Doxorubicin dan 5-fluorourasil memiliki nilai IS
076 dan 88,78. Pada sel Hela kategori aman dimiliki oleh eurikumanon (IS =
206,54), eurikumanon dibutirat (IS = 7,48), eurikumanon monovalerat (IS = 3,07),
eurikumanon dimetoksibenzoat (IS = 198,44) dan kontrol positif 5-fluorourasil (IS
= 140,97). Hasil uji terhadap sel WIDR senyawa yang termasuk dalam kategori
aman adalah eurikumanon (IS = 420,20), eurikumanon dimetoksibenzoat (IS =
256,27) dan kontrol positif 5-fluorourasil (IS = 52,86). Turunan eurikumanon
kategori toksik adalah eurikumanon dibutirat (IS = 1,47) dan eurikumanon
monovalerat (IS = 1), sedangkan kategori sangat toksik dimiliki oleh senyawa
eurikumanon triasetat (IS = 0,07 dan eurikumanon disuksinat (IS = 0,09). Kontrol
positif doxorubicin memiliki nilai IS = 0,08. Hasil pengkajian yang mendalam
dapat dijelaskan bahwa hanya eurikumanon dan eurikumanon dimetoksibenzoat
yang memiliki indeks selektivitas yang lebih besar dari 3, tetapi eurikumanon
dimetoksibenzoat tidak memiliki aktivitas antikanker terhadap sel T47D, MCF-7,
Hela dan WIDR berdasarkan kategori yang dikemukakan oleh Shier. (1991).
Hasil penelitian ini membuktikan bahwa eurikumanon memiliki aktivitas
antikanker terhadap sel T47D, MCF-7, Hela dan WIDR dan aman terhadap sel
normal (sel Vero). Turunan eurikumanon semisintesis yang memiliki aktivitas
antikanker terhadap sel tersebut diatas kecuali WIDR hanya eurikumanon
triasetat, tetapi senyawa ini tidak aman terhadap sel Vero atau sel normal.
Faktor-faktor yang menjadi pertimbangan dalam menilai selektivitas
antikanker adalah konsentrasi senyawa uji yang mampu memberikan aktivitas
antikanker maksimal dan aktivitas sitotoksik minimal terhadap sel normal. Bila
hal ini sudah terpenuhi, maka dapat senyawa tersebut dapat dilanjutkan
pengujiannya ke hewan coba. Adapun penggunaan sel Vero sebagai acuan dalam
menentukan sitotoksisitas secara in vitro hanyalah sebagai acuan dalam
memperkirakan keamanannya dan masih ada parameter-parameter lain yang
menjadi standar agar antikanker dapat digunakan secara klinis.
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
1. Maserasi akar pasak bumi (E. longifolia, Jack.) menghasilkan ekstrak
kental akar pasak bumi ± 6,0% dan fraksinasi ekstrak ini secara KCV
dengan fase diam silika gel 60 dan campuran fase gerak yang terdiri dari
kloroform : metanol : air (5 : 5 : 1) menghasilkan fraksi eurikumanon ±
2,5%. Isolasi eurikumanon dari fraksi ini secara KLT-p dengan fase diam
silika gel 60 PF254 dan campuran fase gerak yang terdiri dari etilasetat :
etanol : air dengan perbandingan 100 : 30 : 1 menghasilkan eurikumanon ±
0,04 %.
2. Sintesis eurikumanon dengan asetilklorida, butirilklorida, valerilklorida,
metoksibenzoilklorida dan suksinat anhidrida menghasilkan senyawa
turunan eurikumanon sebagai berikut: eurikumanon triasetat 65,25%
(formula C26H30O12 dengan BM 534,58); eurikumanon dibutirat 60,35% (
formula C28H36O11 dan BM 548,94); eurikumanon monovalerat 55,10%
(formula C25H32O10 dan BM 492,82; eurikumanon dimetoksibenzoat
50,10% (formula C36H36O13 dan BM 676); dan eurikumanon disuksinat
65,25% (formula C28H30O15 dan BM 606,86).
3. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa eurikumanon memiliki aktivitas
antikanker terhadap sel T47D (IC50 1,17 ± 0,09 µg/mL), MCF-7(IC50 3,96
± 0,02 µg/mL), Hela (IC50 2,95 ± 0,08 µg/mL) dan WIDR (IC50 1,45 ±
0,01 µg/mL) dan aman terhadap sel normal (IC50 609,89 ± 29,77 µg/mL).
Turunan eurikumanon semisintesis yaitu eurikumanon triasetat memiliki
aktivitas antikanker terhadap T47D (IC50 1,08 ± 0,07µg/mL), MCF-7 (IC50
3,09 ± 0,03 µg/mL) dan Hela (IC50 1,21 ± 0,05 µg/mL).Tetapi
eurikumanon triasetat tidak aktif terhadap sel WIDR (IC50 25,06 ± 0,59
µg/mL) dan tidak aman terhadap sel Vero atau sel normal (IC50 1,74 ±
0,99 µg/mL).
4. Eurikumanon dan turunannya yaitu eurikumanon dibutirat, eurikumanon
monovalerat dan eurikumanon dimetoksibenzoat memiliki indeks
selektivitas >3 dan termasuk dalam kategori selektivitas tinggi (aman),
tetapi senyawa turunan eurikumanon ini tidak memiliki aktivitas terhadap
sel kanker T47D, MCF-7, Hela dan WIDR.
6.2. Saran
1. Proses isolasi eurikumanon pada penelitian ini memerlukan banyak waktu,
reagen, biaya, pengalaman dan ketrampilan khusus. Oleh karena itu
disarankan pada masa yang akan datang isolasi dilakukan dengan
menggunakan membran yang khusus dirancang untuk mengisolasi
senyawa tersebut (eurikumanon).
2. Mengingat eurikumanon sangat potensial terhadap sel kanker T47D, MCF-
7, Hela dan WIDR, maka perlu dipertimbangkan pengembangan senyawa
ini menjadi senyawa baru melalui modifikasi struktur selain secara
esterifikasi, sehingga dapat diperoleh senyawa turunannya yang lebih baik,
aman dan dapat mencegah atau memperlambat terjadinya resistensi sel
kanker terhadap antikanker.
3. Syarat suatu antikanker adalah memiliki aktivitas yang potensial dan aman,
hal ini secara in vitro sudah dipenuhi oleh eurikumanon. Oleh karena itu
diperlukan penelitian lanjutan secara in vivo dengan menggunakan hewan
model.
4. Pada masa yang akan datang kemungkinan besar eurikumanon berpotensi
terhadap berbagai jenis kanker, sehingga untuk penggunaan klinis secara
global perlu dipertimbangkan cara total sintesis eurikumanon. Dengan
demikian upaya penebangan besar-besaran terhadap tumbuhan Eurycoma
longifolia, Jack dapat dicegah.
DAFTAR PUSTAKA
Badisa, R.B., Darlingreed, S.F., Joseph, P., Cooperwood, J.S., Latinwo, L.M., and
Goodman, C.B. 2009. Selective Cytotoxic Activities of Two Novel
Synthetic Drugs on Human Breast Carcinoma MCF-7 Cells. Anticancer
Research. 29: 2993 – 2996.
Boik J. 2001. Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press,
Minnesota.
Chan, K.L., Choo C.Y., Abdullah N.R., Ismail Z., 2004, Penelitian
Antiplasmodium Eurycoma longifolia Jack menggunakan uji kadar laktat
dehydrogenase pada Plasmodium falciparum, Laporan Penelitian, School of
Pharmaceutical Sciences, Universiti Sains Malaysia, Penang 11800,
Malaysia
Chan, K.L., Choo, C.Y., Abdullah, N.R. 2005. Semisynthetic 15-O-acyl and 1,15-
di-O-acyleurycumanone from Eurycoma longifolia Jack as Potential
Antimalarials. Planta Med 71. 967 – 969.
Chan, K.L., O’Neill, M.J., Phillipson, J.D., and Warhurst, D.C. 1986. Plants as
Source of Antimalarial Drugs. Part 3. Eurycoma longifolia. Planta Medica
52(2): 105 – 107.
Guo, Z., Vangapandu, S., Sindelar, R.W., Walker, L.A., and Sindelar, R.D. 2005.
Biologically Active Quassinoid and Their Chemistry: Potensial Leads
forDrug Design. Curr Med Chem 12: 190-193.
Jenett-Siems, K., Mockenhaupt, F.P., Bienzle, U., Gupta, M.P., and Eich, E. 1999.
In Vitro Antiplasmodial Activity of Central American Medicinal Plants.
Tropical Medicine International Health . 4 (9): 611 – 615.
Jiwajinda, S., Santisopasri V., Murakami A., Sugiyama H., Gasquet M., Riad E.,
Balansard G., Ohigashi H., 2001, In vitro anti-tumor promoting and anti-
parasitic activities of the quassinoids from Eurycoma longifolia, A
Medicinal Plant in Southeast Asia, J. Ethnopharmacol, Sep 1; 82 (10): 55
Jiwajinda, S., Santisopasri, V., Murakami, A., Kawanaka, M., Kawanaka, H.,
Gasqult, M., Eilas, R., Balansard, G., and Ohigashi, H. 2002. In Vitro
Antitumor Promoting and Antiparasitic Activities of The Quassinoids from
Eurycoma longifolia A Medicinal Plant in Southeast Asia. Journal of
Ethnopharmacology. 82: 55 – 58.
Kar, A. 2004. Advanced Practical Medicinal Chemistry. New Age International
Publisher, New Delhi .
Kardono, L.B.S., Angerhofer, C.K., Tsauri, S., Padmawinata, K., Pezzuto, J.M.,
Kinghorn, A.D., 1991. Cytotoxic and Antimalarial Constituents of The
Roots of Eurycoma longifolia. J Nat Prod, 54, 1360-1367.
Koech, A., Tamez, P., Pezzuto, J and Soejarto, D. 2005. Evaluation of Plants
Used For Antimalarial Treatment by The Massal of Kenya. J.
Ethnopharmacol. 101: 95-99.
Kuo, P.C., Damu A.G., Lee K.H., Wu T.S., 2003, Cytotoxic and Antimalarial
beta-carboline alkaloids from the roots of Eurycoma longifolia, J. Nat
Product, Oct; 66 (10): 1324-1327
Kuo, P.C., Damu, A.G., Lee, K.K., Wu, T.S. 2004. Cytotoxic and Antimalarial
Constituent from The Roots of Eurycoma longifolia, J. Bioorg Med Chem,
12: 537 -544.
Kupchan, S.M., Fessler, D.C., Eakin, M.A., and Giacobbe, T.J. 1970. Reaction of
Alpha Methylen Lactone Tumor Promoter Inhibitors with Model Biological
Nucleophiles. Science 168, 376 – 377.
Lee, V.T., Nguyen, N.S.,1993. Constituents of Eurycoma longifolia Jack. J Org
Chem 35, 1104-1109.
Likhitwitayawuid , K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M., Cordell, G.A.,
and Ruangrungsi, N. 1993. Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the
bulbs of Crinum amabile. J. Nat. Prod ., 56: 1331-1338.
Mawaddah, R.D. 2011. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Akar Pasak Bumi (Eurycoma
longifolia. Jack) Pada Tiksus Putih (Rattus norvegicus). Skripsi. Fakultas
Kedokteran Universitas Syiah Kuala Banda Aceh.
Meiyanto, E. 1999, Kurkumin sebagai obat kanker: Menelusuri mekanisme
aksinya, Majalah Famasi Indonesia, 10, (4): 224-236
Mustofa & Qamariah,N. 2004. Aktivitas antiplasmodial In Vitro dan sitotoksik
Ekstrak Air, Metanol dan Kloroform Akar Pasak Bumi (Eurycoma
longifolia Jack Yang Secara Tradisional Digunakan Untuk pengobatan
Malaria di Kalimantan Selatan. Medika, 3(XXX): 147 – 152.
Nurani, L.H., Mubarika, S., Pramono, S., Mustofa, 2008, The Cytotoxicity of
Extract of Eurycoma longifolia Jack Root on T47D Cell Line, Proceeding,
International Symposium, Cancer, Ahmad Dahlan University
Nurhanan, M.Y., Azimathol H.L.P., Mohd I.A., Moch S.M.A., 2005, Cytotoxic
Effect of the Root Extracts of Eurycoma longifolia Jack, Phytother.Res, 19,
994-996
Shier, W.T. 1991. Mammalian Cell Culture On 5 A day: A laboratory manual of
low cost methods. Nat. Inst of Biotech and Appl. Micro : 64 – 71.
Sholikhah, E.N. & Wijayanti, M.A., 2009, Uji Toksisitas Akut dan Penentuan
Dosis Efektif Ekstrak Tersandar Akar Pasak Bumi (Eurycoma longifolia
Jack.) sebagai Antimalaria pada Hewan Coba. Laporan Penelitian, Fakultas
Kedokteran UGM
Syarifah, S.M.M., Nurhanan, M.Y., Hafiz, M.J., Ilham, M,A., Getha, K., Asiah,
O., Norhayati, I. Sahara, L.H., Suryanti, A.S. 2011. Potential anticancer
compound from Cerbera odollam . Journal of Tropical Forest Science
23(1): 89–96.
Tada, H., Yasuda, F., Otani, K., Dotenchi, M., Ishihara, Y., and Shiro, W. 1991.
New Antiulcer Quassinoids from Eurycoma longifolia. European Journal of
Medicinal Chemistry. 26: 345 – 349.
World Cancer Research Fund Internasional. 2008.
World Health Organization. 2010. Cancer Report. Geneva
Yusuf, H., Mustofa.,Wijayanti, M.A., Susidarti, R.A. Asih, P.B.S., Suryawati dan
Sofia. 2013. A New Quassinoid of Four Isolated Compounds from Extract
Eurycoma longifolia, Jack Roots and Their In itro Antimalarial Activity.
International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical
Sciences. 4: 728 – 734.
LAMPIRAN
1. Instrumen
Instrumen utama yang dibutuhkan pada isolasi eurikumanon adalah:
timbangan, panci ekstraktor, alat pengaduk, penyaring buchner, kertas saring,
vakum evaporator, kromatografi cair vakum, alat kromatografi lapisan tipis, alat
kromatografi lapisan tipis preparatif dan alat-alat gelas lainnya. Instrumen yang
dibutuhkan pada semisintesis turunan eurikumanon adalah labu leher tiga,
termometer, corong tetes, penangas es, pendingin bola, pengaduk panas magnetik,
lemari asam dan alat-alat gelas. Instrumen utama yang dibutuhkan pada uji
aktivitas antikanker adalah laminar air flow, inkubator CO2, autoclave, tabung gas
dan alat-alat gelas.
2. Personalia tenaga peneliti beserta kualifikasinya
Hibah penelitian fundamental dengan judul “Sintesis Turunan
Eurikumanon, Kajian Aktivitas dan Keamanannya Sebagai Antikanker ini
diteliti oleh Dr. Hanifah Yusuf, M.Kes, Apt yang saat ini merupakan salah satu
staf pengajar pada Bagian Farmakologi dan Terapi Fakultas Kedokteran
Universitas Syiah Kuala Banda Aceh. Peneliti memperoleh gelar Sarjana Farmasi
(S-1) dan lulus sebagai profesi Apoteker pada Tahun 1985 di jurusan Farmasi
FMIPA Universitas Sumatera Utara Medan. Gelar Magister Kesehatan diperoleh
pada pendidikan Strata S-2 dalam bidang kajian Farmakologi Jurusan Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan pada tahin 2001. Pada
bulan Januari 2014 telah menyelesaikan Program Doktor di bidang Farmakologi
dan Terapi pada Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta .
3. Biodata Ketua dan Anggota Tim Peneliti
A. Identitas Ketua Tim Peneliti
1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. Hanifah Yusuf, M.Kes., Apt
2 Jenis Kelamin Perempuan
3 Jabatan Fungsional Lektor Kepala pada Bagian Farmakologi FK Unsyiah
4 NIP/NIK/Identitas lainnya 195709111987032001
5 NIDN 00110957
6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh, 11 September 1957
7 E-mail [email protected]
8 Alamat Rumah Jln Hamzah Fansuri No 15 Sektor Utara
Kopelma Darussalam B.Aceh 23111
9 Nomor Telepon/Faks/ HP +628126938484
10 Alamat Kantor Bagian Farmakologi FK Unsyiah, Darussalam
Jl.Tgk.Tanoh Abee, Darussalam Banda Aceh, 23111
11 Nomor Telepon/Faks Telp 0651-7551843
12 Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = 8 orang; S-2 = orang; S-3 = orang
13 Mata Kuliah yg Diampu 1. Farmakologi Kedokteran
2. Farmakologi Keperawatan
3. Farmakologi Kefarmasian
4. Farmakoekonomi
5. Farmakoepidemiologi
6. Farmakologi klinik
7. Farmakoterapi
8. Farmakologi Eksperimental
B. Riwayat Pendidikan
S-1 S-2 S-3
Nama Perguruan
Tinggi
FMIPA USU PPS-USU PDIKK-UGM
Bidang Ilmu Farmasi Farmakologi Farmakologi
Tahun Masuk-
Lulus
1976-1984 1998-2001 2008-
JudulSkripsi/Thesis
/Disertasi
Pengaruh Bahan
Pengikat Pada
Pembuatan Tablet
Dari Bahan
Simplisia
Efek Analgesia
Ekstrak Daun
Klausena (Clausena
anisata) dengan
Metode “Rat Tail
Flick Test”
Modifikasi Struktur
Eurikumanon Hasil Isolasi
dari Akar Pasak Bumi
(Eurycoma longifolia, Jack),
Uji Aktivitas
Antiplasmodium dan
Hubungan Kuantitatif antara
Struktur Aktivitas
Nama Pembimbing/
Promotor
Dra. Meyzoni Mian Prof.Dr.dr.
Pandapotan
Pandjaitan, SpFK
Prof.Dr.Mustofa, M.Kes.,Apt
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No Tahun Judul Penelitian Pendanaan
Sumber* Jumlah
(Juta Rp)
1 2009 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif
Antimalaria dari Fraksi N-Heksan Daun
Nimba (Azadirachta indica A.Juss)
IM-HERE
30
2 2012 Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antimalaria
dari Ekstrak Akar Pasak Bumi (Eurycoma
longifolia, Jack.) Sebagai “Tropical
Medicine” dalam Upaya Pemberantasan
Malaria Akibat Dampak Kebencanaan
DIKTI 50
3 2013 Semisintesis Senyawa Turunan Eurikumanon
Hasil Isolasi dari Akar Pasak Bumi (Eurycoma
DIKTI 50
longifolia, Jack.) dan Uji Aktivitas
Antiplasmodium Secara In Vitro
4 2014 Sintesis Turunan Eurikumanon, Kajian
Aktivitas dan Keamanannya Sebagai
Antikanker
DIKTI 45
5 2014 Pengembangan Antimalaria Baru Turunan
Eurikumanon Hasil Semisintesis Berdasarkan
Analisis HKSA dan Kajian Mekanisme
Kerjanya
RISTEK 150
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir
No Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan
Sumber* Jumlah
(Juta Rp)
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
No Judul Artikel Ilmiah Volume/
Nomor/Tahun
Nama Jurnal
1 Antimalarial activity of Azadirachta indica
A.Juss To Plasmodium berghei in Mus
musculus
ISBN 978-602-
8892-17-9
Proceedings of
International Seminar’
Think Globally Act
Locally: Entering The
Global Market of
Animal Health and
Livestock Through
Utilizing Local
resources Based On
green Vision” 2009
2 The antimalarial activity of the extract of the
neem leaves (Azadirachta indica A.Juss) on
Plasmodium falciparum in vitro
IS089-208X Proceedings of Annual
International
Conference (AIC)
2011
3 Antimalarial Activity of Hexane Extract of
Neem Leaves on Mice (Mus musculus)
IRJPAS, Vol-II,
Issue-I, Feb-2012
has released.
ISSN 2277-4149
Int. Res J Pharm.
App Sci.
www.irjpas.com
4 The Acute Toxicity of Methanolic Extract of
Eurycoma longifolia, Jack Roots and
Histopatholoic Changes of Rat Vital Organs
IRJPAS,
Int. Res J Pharm.
App Sci., 2013;
3(3):13-17
ISSN 2277-4149
Int. Res J Pharm. App
Sci..
www.irjpas.com
5 A New Quassinoid of Four Isolated
Compounds from Extract of Eurycoma
longifolia, Jack Roots and Their In Vitro
Antimalarial Activity
International Journal
of Research In
Pharmaceutical and
Biomedical Sciences
Vol 4 (3): 728 - 734
ISSN 2229 – 3701
IJRPBS
www.ijrpbsonline.co
m
6. Semisynthesis and Biological Evaluation of
Eurycomanone Derivatives As New
Antimalarial
IRJPAS,
Int. Res J Pharm.
App Sci., 2013;
3(6): 4-7. ISSN
2277-4149
Int. Res J Pharm. App
Sci..
www.irjpas.com
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah
Dalam 5 Tahun Terakhir
No Nama Pertemuan
Ilmiah / Seminar
Judul Artikel Ilmiah Waktu dan
Tempat
1 International Seminar’ Think Globally Act
Locally: Entering The Global Market of
Animal Health and Livestock Through
Utilizing Local resources Based On green
Vision”
Antimalarial activity of
Azadirachta indica
A.Juss To Plasmodium
berghei in Mus
musculus
4-5 Oktober
2010, Banda
Aceh
2 Annual International Conference (AIC)
2011
The antimalarial
activity of the extract of
the neem leaves
(Azadirachta indica
A.Juss) on Plasmodium
falciparum in vitro
29-30 November
2011, Banda
aceh
3 Seminar Hasil Penelitian Hibah Unggulan
Perguruan Tinggi (DIKTI)
Isolasi dan Identifikasi
Senyawa Antimalaria
dari Ekstrak Akar Pasak
Bumi (Eurycoma
longifolia, Jack.)
Sebagai “Tropical
Medicine” dalam
Upaya Pemberantasan
Malaria Akibat
Dampak Kebencanaan
Lembaga
Penelitian
Universitas
Syiah Kuala,
Banda Aceh
(Tahun 2012)
4 Seminar Hasil Penelitian Hibah Disertasi
Doktor (DIKTI)
Semisintesis Turunan
Eurikumanon Hasil
Isolasi dari Akar Pasak
Bumi (Eurycoma
longifolia, Jack) dan
Uji Aktivitas
Antiplasmodium Secara
In Vitro
Lembaga
Penelitian
Universitas
Syiah Kuala,
Banda Aceh
(Tahun 2013)
5 Seminar Hasil Penelitian Insentif Sistem
Inovasi Nasional 2014 (RISTEK)
Pengembangan
Antimalaria Baru
Turunan Eurikumanon
Hasil Semisintesis
Berdasarkan Analisis
HKSA dan Kajian
Mekanisme Kerjanya
Kementerian
RISTEK RI
Bandung 1 – 3
Oktober 2014
6 Seminar Hasil Penelitian Fundamental 2014
(DIKTI) Sintesis Turunan
Eurikumanon, Kajian
Aktivitas dan
Keamanannya
Sebagai Antikanker
Lemlit Unsyiah
Banda Aceh
(Tanggal 21
November 2014)
4. FORMULIR EVALUASI ATAS CAPAIAN LUARAN KEGIATAN
Ketua : Dra. Hanifah Yusuf, M.Kes, Apt
Perguruan Tinggi : Universitas Syiah Kuala
Judul : Semisintesis Senyawa Turunan Eurikumanon Hasil Isolasi dari
Akar Pasak Bumi (Eurycoma longifolia, Jack.) dan Uji
Aktivitas Antiplasmodium Secara In Vitro
Waktu Kegiatan : Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun
Luaran yang direncanakan dan capaian tertulisdalam proposal awal
No Luaran yang direncanakan Capaian
1. Publikasi di jurnal internasional Belum dikirim untuk
dipublikasi di Jurnal
Internasional
1. Publikasi Ilmiah
Keterangan
Artikel Jurnal ke-1
Nama jurnal yang dituju Aceh International Journal of Science
and Technology
Klasifikasi jurnal Internasional
Impact factor jurnal
Judul artikel
Status naskah (beri tanda)
- Draft artikel
- Sudah dikirim ke jurnal
- Sedang ditelaah
- Sedang direvisi
- Revisi sudah dikirim ulang
- Sudah diterima
- Sudah terbit
2. Buku Ajar
Buku Ajar ke-1
Judul :
Penulis :
Penerbit :
3. Pembicara Pada Pertemuan Ilmiah (Seminar/ Simposium)
Judul makalah
Nama pertemuan ilmiah
Tempat pelaksanaan
Waktu pelaksanaan
- Draft makalah
- Sudah dikirim
- Sedang direview
- Sudah dilaksanakan
Biodata Anggota Tim Peneliti I
A. Identitas Diri
1 Nama Lengkap (dengan gelar) dr. Darma Satria,M.Si L
2 Jenis Kelamin Laki-laki
3 Jabatan Fungsional Asissten Ahli di Bagian Patologi Anatomi FK
Unsyiah
4 NIP/NIK/Identitas lainnya 19830811 200604 1 002
5 NIDN 0011088301
6 Tempat dan Tanggal Lahir Banda Aceh/ 11 Agustus 1983
7 E-mail [email protected]/darm212@ gmail.com
8 Alamat Rumah Jl. Hasan Saleh No.12, Neusu Jaya, Banda
Aceh 9 Nomor Telepon/Faks/ HP 085260084649
10 Alamat Kantor Bagian Patologi Anatomi FK Unsyiah,
Kopelma Darussalam
Jl.Tgk.Tanoh Abee, Darussalam Banda Aceh,
23111
11 Nomor Telepon/Faks Telp 0651-7551843
12 Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = orang; S-2 = orang; S-3 = orang
13 Mata Kuliah yg Diampu Patologi Anatomi
B. Riwayat Pendidikan
S-1 S-2 S-3
Nama Perguruan
Tinggi
Universitas Syiah
Kuala
Universitas Airlangga
Bidang Ilmu Kedokteran Patobiologi
Tahun Masuk-Lulus
JudulSkripsi/Thesis/Di
sertasi
Pengaruh pemberian asam
askorbat dosis tinggi secara
intravena terhadap gambaran
histopatologis glomerulus,
tubulus dan peroksidasi lipid
pada ginjal tikus putih (Rattus
norvegicus strain Wistar
Nama
Pembimbing/Promotor
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No Tahun Judul Penelitian Pendanaan
Sumber* Jumlah
(Juta
Rp)
1 2007 Faktor-faktor yang Mempengaruhi
Kejadian Preeklampsia Berat (PEB) dan
Eklampsia di RSUDZA Tahun 2007
(Tanpa publikasi)
Mandiri
Biodata Anggota Tim Peneliti II
A. Identitas Diri
1 Nama Lengkap (dengan
gelar)
dr.Zulkarnain, M.Sc
2. Jenis Kelamin Laki-Laki
3 Jabatan Fungsional Asisten Ahli di Bagian Fisiologi FK Unsyiah
4 NIP/NIK/Identitas lainnya 19830925 2008121004
5 NIDN 0025098302
6 Tempat dan Tanggal Lahir Kiran Krueng/ 25 September 1983
7 E-mail [email protected]
8 Alamat Rumah Jl. Singgah Mata Lr. Glee Pulot No 40,
Blower Banda Aceh
9 Nomor Telepon/Faks/ HP 085277728024
10 Alamat Kantor Bagian Fisiologi FK Unsyiah, Darussalam
Jl.Tgk.Tanoh Abee, Darussalam Banda
Aceh, 23111
11 Nomor Telepon/Faks 0651-7551843
12 Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = orang; S-2 = orang; S-3 = orang
13 Mata Kuliah yg Diampu Fisiologi Kedokteran
A. Riwayat Pendidikan
S-1 S-2 S-3
Nama Perguruan Tinggi Universitas
Syiah Kuala
Universitas Gadjah
Mada
-
Bidang Ilmu Kedokteran Fisiologi -
Tahun Masuk-Lulus -
JudulSkripsi/Thesis/Disertasi Ekspresi
Caspase-3 Sel
Leydig Tikus
Sprague
Dawley yang
Diinduksi
Streptozotocin
Dosis Rendah
-
Nama Pembimbing/Promotor -
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No Tahun Judul Penelitian Pendanaan
Sumber* Jumlah
(Juta
Rp)
1 2010
Pengaruh Dukungan Keluarga, Pengetahuan
dan Pendidikan Penderita Tuberkulosiss (TB
Paru) Terhadap Kepatuhan Minum Obat
DIKTI
THE ACTIVITY OF EURYCOMANONE DERIVATIVES AS
ANTICANCER
1Hanifah Yusuf,
2Darma Satria,
3Zulkarnain
1Departement of Pharmacology and Therapeutic Faculty of Medicine University of Syiah Kuala Banda Aceh,
Indonesia 2Departement of Pathology Anatomi Faculty of Medicine University of Syiah Kuala Banda Aceh, Indonesia
3Departement of Physiology Faculty of Medicine University of Syiah Kuala Banda Aceh, Indonesia
Email: [email protected]
ABSTRACT
Eurycomanone from the roots of Eurycoma longifolia Jack, has been reported to
exhibit anticancer activity. Five of ester eurycomanone derivatives: eurycomanone
triacetate, eurycomanone dibutyrate, eurycomanone monovalerate, eurycomanone
dimethoxybenzoate and eurycomanone disuccinate were synthesized for knowing
their potencies on cancer cells T47D, MCF-7, Hela, WIDR and normal cells. The
activity of eurycomanone derivatives as anticancer were evaluated by a MTT
colorimetric assay method. The results showed that eurycomanone has anticancer
activity on T47D, MCF-7, Hela, WIDR cancer cells with values IC50 (1,17 ± 0,09;
3,96 ± 0,02; 2,95 ± 0,08; 1,45 ± 0,01 µg/mL, respectively and no toxic to Vero
cells (IC50 609,89 ± 29,77 µg/mL). Eurycomanone triacetate has IC50 values 1,08
± 0,07; 3,09 ± 0,03; 1,21 ± 0,05 µg/mL and no activity on WIDR cancer cells
(IC50 = 25,06 ± 0,59 µg/mL) but toxic to Vero cells (IC50 = 1,74 ± 0,99 µg/mL).
Eurycomanone dibutyrate, eurycomanone monovalerate and eurycomanone
dimethoxybenzoate are safe to Vero cells with selectivity index more than 3, but
no activity on cancer cells. Eurycomanone disuccinate no activity on cancer cells
and also toxic to Vero cells.
Keywords : Anticancer, Eurycomanone, Eurycoma longifolia Jack, Synthesis
Introduction
Natural compounds from plants have been proven as a source of lead
compounds for developing of new drugs (1,2
). Eurycomanone is a natural
pentacyclic quassinoid obtained from the roots of Eurycoma longifolia Jack (3) in
the family Simaroubaceae. Eurycoma longifolia Jack (ElJ) or commercially
known as Tongkat Ali in Malaysia, Pasak Bumi in Indonesia, Tung Saw in
Thailand and Cay Ba Binh in Vietnam (4) is very popular plant as aphrodisiac and
usually taken after 4 years of cultivation for preparing pharmaceutical products(5).
Various natural compounds have been isolated and characterized from ElJ, mostly
from the roots. Natural compounds from ElJ have been reported to have a wide
pharmacological activities such as antimalarial (6,7,8
), anticancer (6,7,8,9,10
),
antipyretic (10
) and anti ulcer (11
). Eurycomanone is one of the major natural
quassinoids isolated from the roots of ElJ and has exhibited cytotoxic activities
against selected cancer cell lines (12,13
). Its pharmacological potency has been
proven in numerous in vitro and in vivo experimental laboratory. But until now
very limited efforts to develope this compound for obtaining its derivatives.
Therefore this investigation was conducted to examine the anticancer activity of
synthesized eurycomanone derivatives on selected cancer cells line.
In this study, design and synthesis of eurycomanone derivatives were done
by using eurycomanone natural compound and esterified without using protecting
agent by using pharmacophore agents such as acetyl chloride, butiryl chloride,
valeroyl chloride, para methoxy benzoyl chloride and succinate anhydride.
Materials and Methods:
Plant materials: The plant and roots of E. longifolia Jack were taken after 4
years of cultivation and identified by a specialist. The certificate of identification
with number BF/123/Ident/Det/III/2010.
Extraction:
The roots (10kg) of E. longifolia were cleaned with tap water and then dried in the
oven at 600C. The dried roots materials were ground into crude powder and stored
in the desiccators.
The crude powder was soaked in 30L methanol at room temperature and stirred
regularly. The liquid extract was filtered and concentrated in rotary evaporator at
400C to produce methanolic extract.
Isolation of eurycomanone
Before isolation the methanolic extract of ElJ was subjected to vacum liquid
chromatography by using stationer phase silica gel and the mixture chloroform:
methanol: water in ratio (5:5:1; 3:7:1: 1:9:1) as mobile phase. Fractions with
similar Rf values on thin layer chromatography (TLC) which were monitored at
UV lamp at 254 nm, then pooled and used for isolation of eurycomanone as
starting material for synthesizing. This fraction were used for isolation of
eurycomanone by PTLC using silica gel PF254 as stationer phase and the mixture
of ethylacetate: methanol : water in ratio 80: 20: 1 as mobile phase. Repeated
isolation and crystallization were done to get the pure compound. The structures
and its purity were confirmed by comparison with detailed spectroscopic data in
published reports (UV, IR, NMR, LCMS-ESI positive ion, DEPT, COSY, HMQC
and HMBC).
Synthesis of eurycomanone derivatives
Synthesis of eurycomanone derivatives can be performed by simple
esterification without using protecting agent. Eurycomanone which is isolated
from the E. longifolia roots (50 mg, 0,1225 mmol) was dissolved in cold pyridine
(1 mL) and pharmacophore agent (acetyl chloride, butiryl chloride, valeroyl
chloride, para methoxy benzoyl chloride and succinate anhydride 0,49 mmol,
respectively) dissolved in cold chloroform. The solution of pharmacophore agent
was added slowly to the eurycomanone solution at 00C and the reaction mixture
was stirred for 1 hour in ice bath. After that, the reaction mixture was refluxed and
stirred using magnetic heat stirrer at 500C – 55
0C for 6-8 hour and every 2 hours
checked the product by TLC. After esterification process ended, the mixture was
extracted three times with 10 ml of cold ethyl acetate. The ethyl acetate layer is
washed three times with 10 mL cold water and then dried with sodium sulfate
anhydrate. After filtration and drying, the cooled precipitate is poured in methanol
and preparing for detailed spectroscopic analysis.
Testing of Anticancer activity
The anticancer activity test of eurycomanone and its derivatives on Vero cells and
cancer cell lines (T47D, MCF-7, Hela, WIDR) were carried out by MTT
Colorimetric Assay methods (Mosman, 1983). The tested compounds were used
at concentration 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,57625, 0,78125 µg/mL and prepared
from the substock solutions by serial dilution of media to give a volume of 100 µL
in each microtitre plate well. The concentration of tested compounds were
prepared in triplicate. As standard drug used doxorubicine and 5 fluorouracil in
same concentration. Then each well was added with 100 µL with 104/
mL of cells
in complete growth media, respectively. As controls were used the cells and
media that were placed into 96 well microplate then incubated for 24 hours at
370C, 5% CO2 and 90% humidity. After incubation, the media was removed and
100 µL of new medium and 10 µL MTT was added. Then, it was incubated again
for 4 hours and next the media was aspirated and 100 µL SDS 10% in 0,001N
HCl added. The microplate was re-incubated for 24 hours in room temperature
and its absorbance was read at λ 405 nm (Vero cells) and 595 nm (cancer cell
lines) by ELISA reader. The IC50 value on Vero cells and cancer cell lines were
determined by probit or linear regression analysis.
Results:
The result of eurycomanone isolation
Investigating of new antimalarial compound was originated from pasak
bumi roots (E. longifolia, Jack.), we macerated the powdered of pasak bumi roots
with methanol and after evaporation the liquid extract in vacum condition gave ±
6% solid extract. Fractionation were done to the extract by vacum liqiud
chromatography (VLC) for obtaining the concentrated eurycomanone and yielded
± 2,5%. Isolation of eurycomanone from this fraction was performed by
preparative thin layer chromatography (TLC) and yielded ± 0,04%.
The result of synthesis eurycomanone derivatives
Eurycomanone is the potential quasinoid anticancer was structurally
esterified by using acyl chloride and carboxyclic anhydride to influence their
activity and cytotoxicity to cancer cell lines. Synthesis of its derivatives by
esterification is attempted with the aim of increasing activity, decreasing toxicity,
or improving other pharmacological profiles. In finding new anticancer with
better activity than previous compound, it was esterificated OH group in
eurycomanone structure by acetyl chloride, butiryl chloride, valeryl chloride,
para-methoxybenzoyl chloride and succinic anhydride. The result of esterification
gave eurycomanone triacetate (65,25%), eurycomanone dibutyrate (60,35%),
eurycomanone monovalerate (55,10%), eurycomanone dimethoxybenzoate
(60,10%) and eurycomanone disuccinate (65,25%).
The result of identifying eurycomanone and its derivatives by spectroscopic
analysis
Chemical structure of all tested compounds had been analyzed by
spectroscopic analysis. Eurycomanone as starting material has formula C20H24O9
(MW 408.02; m.p 2540-257
0C) and its derivatives eurycomanone triacetate
C26H30O12 (MW 537.58; m.p 225-2270C), eurycomanone dibutyrate C28H36O11
(MW 548,94; m.p 241-2430C), eurycomanone monovalerate C25H32O10
(MW492,8; m.p 235-2370C), eurycomanone dimethoxybenzoate C36H36O13 (MW
676,13; m.p 225-2280C) eurycomanone disuccinate C28H30O15 (MW 606,86, m.p
251-2540C).
The result of anticancer activity test
The evaluation of tested compounds on Vero cell is aimed for knowing the
safety of these compounds on normal cells. In addition, these compounds are also
used for examining their potencies in growth inhibition of cancer cell lines. The
test was performed by MTT colorimetric assay method which was modified (14,15
).
The IC50 and selectivity index values of these compounds on cancer cell lines and
Vero cells are showed in Table 1 and 2.
Discussion
Resistance to chemotherapy limits the effectiveness of chemotherapy drugs in
treating cancer. Several derivatives of eurycomanone: eurycomanone triacetate,
eurycomanone dibutyrate, eurycomanone monovalerate, eurycomanone
dimethoxybenzoate, eurycomanone disuccinate were synthesized. The
triacetylated eurycomanones (eurycomanone triacetate) exhibitted higher
anticancer activity on cancer cell lines (T47D, MCF-7, Hela), and no activity on
WIDR cell. Eurycomanone triacetate displayed comparable anticancer potency to
eurycomanone, except on WIDR cells and also toxic on Vero cells. The data in
Table 1 showed eurycomanone and triacetylated eurycomanone more potent than
monoacetylated and diacetylated eurycomanone to selected cancer cell lines
above.
Conclusion:
The data suggest that eurycomanone has anticancer activity on selected cancer cell
lines (T47D, MCF-7, Hela and WIDR) and safe to normal Vero cells. Its
derivatives eurycomanone triacetate have anticancer activity on those cells except
WIDR, but toxic on Vero cells.
References
1. Newman, D.J., Cragg, G.M., Snader, K.M. 2003. Natural products as sources
of new drugs over the period 1981–2002. J. Nat Prod. 66(7):1022-1037.
2. Kinghorn, A.D., Farnsworth, N.R., Soejarto, D.D., Cordell, G.A., Pezzuto,
J.M., Udeani, G.O., Wani, M.C., Wall. M.E., Navarro, H.A., Kramer, H.A.,
Menendez, A.T., Fairchild, C.R., Lane, K.E., Forenza, S., Vyas, D.M., Lam,
K.S., Shu, Y.Z. 1999. Novel strategies for the discovery of plant-derived
anticancer agents. Pure Appl Chem, 71:1611-1618.)
3. Darise, M., Kohda, H., Mizutani, K., Tanaka, O. 1982. Eurycomanone and
eurycomanol, quassinoids from the roots of Eurycoma longifolia.
Phytochemistry. 21:2091-2093
4. Kuo, P.C., Shi, L.S., Damu, A.G., Su, C.R., Huang, C.H., Ke, C.H. 2003.
Cytotoxic and antimalarial beta-carboline alkaloids from the roots of
Eurycoma longifolia. J Nat Prod. 66:1324-1327.
5. Chan, K.L., Lee, S.P.,Yuen, K.H. 1995. Antipyretic activity of quassinoids
from Eurycoma longifolia Jack. Planta Medica : 219 .
6. Chan, K.L., O’Neill, M.J., Phillipson, J.D., and Warhurst, D.C. 1986. Plants
as Source of Antimalarial Drugs. Part 3. Eurycoma longifolia. Planta Medica
52(2): 105 – 107.
7. Kardono, L.B.S., Angerhofer, C.K., Tsauri, S., Padmawinata, K., Pezzuto,
J.M., and Kinghorn, A.D., 1991. Cytotoxic and Antimalarial Constituents of
The Roots of Eurycoma longifolia. Journal of Natural Product. 54: 1360-
1367
8. Jiwajinda, S., Santisopasri, V., Murakami, A., Kawanaka, M., Kawanaka, H.,
Gasquet, M. 2002. In Vitro Anti-tumor promoting and Anti-parasitic
Activities of the Quassinoids from Eurycoma longifolia, a Medicinal Plant in
Southeast Asia. J. Ethnopharmacol. 82: 55–58.
9. Kuo, P.C., Damu, A.G., Lee, K.K., and Wu, T.S. 2004. Cytotoxic and
Antimalarial Constituent from The Roots of Eurycoma longifolia. Journal of
Bioorganic Medicinal Chemistry. 12: 537 -544.
10. Tee, T.T., Cheah, Y.H., Hawariah, L.P. 2007. F16, a fraction from Eurycoma
longifolia jack extract, induces apoptosis via a caspase-9-independent manner
in MCF-7 cells. Anticancer Res. 27:3425-3430.
11. Tada, H., Yasuda, F., Otani, K., Dotenchi, M., Ishihara, Y., and Shiro, W.
1991. New Antiulcer Quassinoids from Eurycoma longifolia. European
Journal of Medicinal Chemistry. 26: 345 – 349.
12. Wong, P., Cheong, W., Shu, M., Teh, C., Chan, K. and Bakar, S. A. 2012.
Eurycomanone Suppresses Expression of Lung Cancer Cell Tumor Markers,
Prohibitin, Annexin 1 and Endoplasmic Reticulum Protein 28.
Phytomedicine. 19: 138–144
13. Zakaria Y, Rahmat A, Pihie AH, Abdullah NR, Houghton PJ (2009)
Eurycomanone induce apoptosis in HepG2 cells via upregulation of p53.
Cancer Cell Int 9:16
14. Mosman, T. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Celluler Growth and
Survival Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of
Immunology Method. 65: 55 – 63.
15. Tada, H., Shiho, O., Kuroshima, K., Koyama, M., and Tsukamoto. 1986. An
Improved Colorometric Assay for Interleukin-2. Journal of Immunology
Method. 93 (2): 157-165.
ACKNOWLEDGEMENT
This study was supported by Ministry of Education and Culture of Indonesia. The
authors would like to thank University of Syiah Kuala for this grant. The authors
are grateful to Indonesian Institute of Sciences (LIPI) for analyzing our synthesis
compounds (Mrs.Sofa Fajriah for NMR analysis and Mrs. Puspa Dewi for helping
in LC-MS analysis).
Table 1. The IC50 of eurycomanone and its derivatives on selected cancer cell lines and Vero cells
Table 2. The selectivity index of eurycomanone and its derivetives on selected cancer cell lines
and Vero cells
Top Related