I. METODE ANALISIS KARBOHIDRAT

Metode Analisis Karbohidrat ada 2 jenis, yaitu:

-          Analisis Kualitatif

-          Analisis Kuantitatif

1.        Metode Analisis Kualitatif Karbohidrat

    Test Molish

Prinsip:

Karbohidrat akan didehidrasi oleh asam sulfat pekat membentuk senyawa furfural atau

turunannya. Furfural dan turunannya akan berkondensasi dengan alfanaftol (molish)

menghasilkan senyawa kompleks berwarna merah ungu pada bidang batas antara larutan

karbohidrat dan H2SO4 pekat.

    Test Moore

Prinsip:

Uji Moore menggunakan NaOH (alkali) yang berfungsi sebagai ion OH - yang akan berikatan

dengan rantai aldehid yang membentuk aldol aldehid (aldehida dengan cabang gugus alkanol)

yang berwarna kekuningan. Pemanasan bertujuan untuk membuka ikatan karbon dengan

hydrogen dan menggantikannya dengan gugus –OH.

      Test Benedict

Prinsip:

Larutan CuSO4 dalam suasana alkali akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehid

sehingga CuO atau kupri tereduksi menjadi Cu2O yang berwarna merah bata (endapan).

     Test Selliwanof

Prinsip:

Perubahan fruktosa oleh HCl panas menjadi levulinat dan hidroksimetil furfural, selanjutnya

kondensasi hidroksimetil dengan resorsinol akaan menghasilkan senyawa sukrosa yang mudah

dihidrolisa menjadi glukosa akan member reaksi positif berwarna oranye.

     Test Barfoed

Prinsip:

Monosakarida akan mereduksi Cu2+ dalam suasana asam lemah (CH3COOH), menghasilkan

endapan yang berwarna merah bata dari Cu2O.

Metode Fehling

Prinsip dari metode fehling yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk mereduksi

senyawa Cu2SO4 menjadi Cu2O (enpadan berwarna merah bata) setelah dipanaskan pada

suasana basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan ditambahkan agen pengikat

(chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat.

Metode Osazon

Prinsip:

Reaksi ini dapat digunakan baik untuk larutan aldosa maupun ketosa, yaitu dengan

menambahkan larutan fenilhidrazin, lalu dipanaskan hingga terbentuk kristal berwarna kuning

yang dinamakan hidrazon (osazon).

     Metode Tollens

Prinsip:

Tollen terdiri dari Ag2SO4 yang bila ada gula pereduksi Ag akan direduksi menjadi Ag+ yang

akan membentuk cinci perak. Kelemahan dari reaksi Tollen adalah diabukan cuma bereaksi

dengan gula pereduksi tetapi juga bereaksi dengan senyawa keton yang mempunyai gugus metil.

     Metode iodine

Prinsip:

Uji iodium digunakan untuk melihat pembentukan polisakarida. Penambahan iodium pada suatu

polisakarida akan menyebabkan terbentuknya kompleks absorbsi berwarna spesifik. Amilum

atau pati akan menghasilkan warna biru. Hasil yang postif hanya pada penambahan air dan HCl

dengan iodine.

2.    Metode Analisis Kuantitatif Karbohidrat

Ada beberapa macam metode yang dapat kita gunakan untuk analisa kadar gula reduksi secara    

kuantitatif yaitu :

1.      Metode Fisika

Ada dua (2) macam, yaitu :

a.       Berdasarkan indeks bias

Cara ini menggunakan alat yang dinamakan refraktometer, Refraktometer adalah alat yang

digunakan untuk mengukur kadar/ konsentrasi bahan terlarut. Misalnya gula, garam, protein, dsb.

Prinsip kerja dari refraktometer sesuai dengan namanya adalah memanfaatkan refraksi cahaya.

Refraktometer ditemukan oleh Dr. Ernest Abbe seorang ilmuan dari German pada permulaan

abad 20 (Anonim, 2010). Pengukurannya didasarkan atas prinsip bahwa cahaya yang masuk

melalui prisma-cahaya hanya bisa melewati bidang batas antara cairan dan prisma kerja dengan

suatu sudut yang terletak dalam batas-batas tertentu yang ditentukan oleh sudut batas antara

cairan dan alas.

yaitu dengan rumus :

X = [(A+B)C - BD)]

dimana :

X = % sukrosa atau gula yang diperoleh

A = berat larutan sampel (g)

B = berat larutan pengencer (g)

C = % sukrosa dalam camp A dan B dalam tabel

D = % sukrosa dalam pengencer B –

b.    Berdasarkan rotasi optis

Cara ini digunakan berdasarkan sifat optis dari gula yang memiliki struktur asimetrs (dapat

memutar bidang polarisasi) sehingga dapat diukur menggunakan alat yang dinamakan

polarimeter atau polarimeter digital (dapat diketahui hasilnya langsung) yang dinamakan

sakarimeter 

Menurut hokum Biot; “besarnya rotasi optis tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi

larutan dan tebal cairan” sehingga dapat dihitung menggunakan rumus :

[a] D20 = 100 A

L x C

dimana :

[a] D20 = rotasi jenis pada suhu 20 oC menggunakan

D = sinar kuning pada panjang gelombang 589 nm dari lampu Na

A = sudut putar yang diamati

C = kadar (dalam g/100 ml)

L = panjang tabung (dm)

sehingga C = 100 A

L x [a] D20  -

2.    Metode Kimia

Metode ini didasarkan pada sifat mereduksi gula, seperti glukosa, galaktosa, dan fruktosa

(kecuali sukrosa karena tidak memiliki gugus aldehid). Fruktosa meskipun tidak memiliki gugus

aldehid, namun memiliki gugus alfa hidroksi keton, sehingga tetap dapat bereaksi. Dalam

metode kimia ini ada dua (2) macam cara yaitu :

a.   Titrasi

Untuk cara yang pertama ini dapat melihat metode yang telah distandarisasi oleh BSN yaitu pada

SNI cara uji makanan dan minuman nomor SNI 01-2892-1992.

b.   Spektrofotometri

Adapun untuk cara yang kedua ini menggunakan prinsip reaksi reduksi CuSO4 oleh gugus

karbonil pada gula reduksi yang setelah dipanaskan terbentuk endapan kupru oksida (Cu2O)

kemudian ditambahkan Na-sitrat dan Na-tatrat serta asam fosfomolibdat sehingga terbentuk

suatu komplek senyawa berwarna biru yang dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 630 nm. 

c.    Cara Luff Schoorl

Prinsip: Monosakarida dioksidasi oleh CuO dari reagen Luff Schoorl menjadi Cu2O.kemudian

kelebihan CuO dari reagen luff Schoorl akan bereaksi dengan KI suasana asam membentuk I2

yang akan bereaksi dengan cara dititrasi dengan Na-tiosulfat dengan indikator amilum .

dilakukan pengujian telah tersedia sehingga dalam praktikum ini kami tidak melakukan proses

persiapan sampel. 

d.      Metode Nelson-Somogyi

Metode ini dapat digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi dengan menggunakan pereaksi

tembaga arseno molibdat. Kupri mula-mula direduksi menjadi bentuk kupro dengan pemanasan

larutan gula. Kupro yang terbentuk selanjutnya dilarutkan dengan arseno molibdat menjadi

molibdenum berwarna biru yang menunjukkan ukuran konsentrasi gula dan membandingkannya

dengan larutan standar sehingga konsentrasi gula dalam sampel dapat ditentukan. Reaksi warna

yang terbentuk dapat menentukan konsentrasi gula dalam sampel dengan mengukur

absorbansinya. (Sudarmadji.S.1984)

3.      Metode enzimatis

Untuk metode enzimatis ini, sangat tepat digunakan untuk penentuan kagar suatu gula secara

individual, disebabkan kerja enzim yang sangat spesifik. Contoh enzim yang dapat digunakan

ialah glukosa oksidase dan heksokinase Keduanya digunakan untuk mengukur kadar glukosa.

a.       Glukosa oksidase

D- Glukosa + O2 oleh glukosa oksidase à Asam glukonat dan H2O2

H2O2 + O-disianidin oleh enzim peroksidase à 2H2O + O-disianidin teroksdasi yang berwarna

cokelat (dapat diukur pada l 540 nm).

b.      Heksokinase

D-Glukosa + ATP oleh heksokinase à Glukosa-6-Phospat +ADP Glukosa-6-Phospat + NADP+

oleh glukosa-6-phospat dehidrogenase à Glukonat-6-Phospat + NADPH + H+ Adanya NADPH

yang dapat berpendar (memiliki gugus kromofor) dapat diukur pada l 334 nm dimana jumlah

NADPH yang terbentuk setara dengan jumlah glukosa.

Menggunakan enzim spesifik untuk karbohidrat yan g akan diuji. Contoh enzimnya yaitu   

glukosa oksidase dan heksokinase.

4.      Metode Dinitrosalisilat (DNS)

Prinsip:

Metode ini digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri. Teknik ini

hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi, misalnya glukosa. Glukosa memiliki gugus

aldehida, sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil. Gugus aldehida yang dimiliki oleh

glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil dan menghasilkan

asam 3-amino-5-salisilat pada kondisi basa dengan suhu 90-100oC. Senyawa ini dapat dideteksi

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.

Cara membuat pereaksi DNS  :

1.  Sebanyak 5 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 5 g NaOH 2 N dilarutkan dalam 100 mL aquades

(larutan A).

2.  Sebanyak 150 g natrium kalium tartarat dilarutkan dalam 200 mL aquades (larutan B). Larutan A

dan B dicampur, lalu ditera dalam labu takar dengan aquades hingga volume akhirnya menjadi

500 mL, kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik selama satu malam.

5.      Metode Asam Fenol Sulfat

Prinsip:

Metode ini disebut juga dengan metode TS (total sugar) yang digunakan untuk mengukur

total gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula sederhana,

oligosakarida, dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat yang akan

menghasilkan warna jingga kekuningan yang stabil.

II. METODE ANALISIS LIPID

A.     Uji kualitatif Lipid

1. Uji Kelarutan Lipid

Uji ini terdiri atas analisis kelarutan lipid maupun derivat lipid terdahap berbagai macam pelarut.

Dalam uji ini, kelarutan lipid ditentukan oleh sifat kepolaran pelarut. Apabila lipid dilarutkan ke

dalam pelarut polar maka hasilnya lipid tersbut tidak akan larut. Hal tersebut karena lipid

memiliki sifat nonpolar sehingga hanya akan larut pada pelarut yang sama-sama nonpolar (Scy

Tech Encyclopedia 2008)

2. Uji Akrolein

Uji kualitatif lipid lainnya adalah uji akrolein. Dalam uji ini terjadi dehidrasi gliserol dalam

bentuk bebas atau dalam lemak/minyak menghasilkan aldehid akrilat atau akrolein. Menurut Scy

Tech Encyclopedia (2008), uji akrolein digunakan untuk menguji keberadaan gliserin atau

lemak. Ketika lemak dipanaskan setelah ditambahkan agen pendehidrasi (KHSO4) yang akan

menarik air, maka bagian gliserol akan terdehidrasi ke dalam bentuk aldehid tidak jenuh atau

dikenal sebagai akrolein (CH2=CHCHO) yang memiliki bau seperti lemak terbakar dan ditandai

dengan asap putih (Scy Tech Encyclopedia 2008)

3. Uji Ketidakjenuhan Lipid

Uji ketidakjenuhan digunakan untuk mengetahui asam lemak yang diuji apakah termasuk asam

lemak jenuh atau tidak jenuh dengan menggunakan pereaksi Iod Hubl. Iod Hubl ini digunakan

sebagai indikator perubahan. Asam lemak yang diuji ditambah kloroform sama banyaknya.

Tabung dikocok sampai bahan larut. Setelah itu, tetes demi tetes pereaksi Iod Hubl dimasukkan

ke dalam tabung sambil dikocok dan perubahan warna yang terjadi terhadap campuran diamati.

Asam lemak jenuh dapat dibedakan dari asam lemak tidak jenuh dengan cara melihat

strukturnya. Asam lemak tidak jenuh memiliki ikatan ganda pada gugus hidrokarbonnya. Reaksi

positif ketidakjenuhan asam lemak ditandai dengan timbulnya warna merah ketika iod Hubl

diteteskan ke asam lemak, lalu warna kembali lagi ke warna awal kuning bening. Warna merah

yang kembali pudar menandakan bahwa terdapat banyak ikatan rangkap pada rantai hidrokarbon

asam lemak (Scy Tech Encyclopedia 2008).

4. Uji Ketengikan

Uji kualitatif lipid lainnya adalah uji ketengikan. Dalam uji ini, diidentifikasi lipid mana yang

sudah tengik dengan yang belum tengik yang disebabkan oleh oksidasi lipid. Minyak yang akan

diuji dicampurkan dengan HCl. Selanjutnya, sebuah kertas saring dicelupkan ke larutan

floroglusinol. Floroglusinol ini berfungsi sebagai penampak bercak. Setelah itu, kertas

digantungkan di dalam erlenmeyer yang berisi minyak yang diuji. Serbuk CaCO3 dimasukkan ke

dalam erlenmeyer dan segera ditutup. HCl yang ditambahkan akan menyumbangkan ion-ion

hidrogennya yang dapat memecah unsur lemak sehingga terbentuk lemak radikal bebas dan

hidrogen radikal bebas. Kedua bentuk radikal ini bersifat sangat reaktif dan pada tahap akhir

oksidasi akan dihasilkan peroksida (Syamsu, 2007)

5. Uji Salkowski untuk kolesterol

Uji Salkowski merupakan uji kualitatif yang dilakukan untuk mengidentifikasi keberadaan

kolesterol. Kolesterol dilarutkan dengan kloroform anhidrat lalu dengan volume yang sama

ditambahkan asam sulfat. Asam sulfat berfungsi sebagai pemutus ikatan ester lipid. Apabila

dalam sampel tersebut terdapat kolesterol, maka lapisan kolesterol di bagian atas menjadi

berwarna merah dan asam sulfat terlihat berubah menjadi kuning dengan warna fluoresens hijau

(Pramarsh,2008). 

6. Uji Lieberman Buchard

Uji Lieberman Buchard merupakan uji kuantitatif untuk kolesterol. Prinsip uji ini adalah

mengidentifikasi adanya kolesterol dengan penambahan asam sulfat ke dalam campuran.

Sebanyak 10 tetes asam asetat dilarutkan ke dalam larutan kolesterol dan kloroform (dari

percobaan Salkowski). Setelah itu, asam sulfat pekat ditambahkan. Tabung dikocok perlahan dan

dibiarkan beberapa menit. Mekanisme yang terjadi dalam uji ini adalah ketika asam sulfat

ditambahkan ke dalam campuran yang berisi kolesterol, maka molekul air berpindah dari gugus

C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi membentuk 3,5-kolestadiena. Produk ini

dikonversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang menghasilkan warna hijau. Warna

hijau ini menandakan hasil yang positif. Reaksi positif uji ini ditandai dengan adanya perubahan

warna dari terbentuknya warna pink kemudian menjadi biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau tua

(WikiAnswers, 2008).

B.     Uji Kuantitatif Lipid

Firestone dalam Schmidl dan Labuza (2000) dalam Fachri (2008) menyebutkan bahwa untuk

menganalisa kandungan lemak dalam makanan dapat dilakukan dengan cara volumetris,

gravimetris, dan kromatografi. Kromatografi yang dapat dipakai seperti kromatografi gas (CG),

kromatografi lapisan tipis (TLC), kromatografi ekslusi (SEC), kromatografi cairan (LC) dan

kromatografi yang memiliki unjuk kerja baik seperti HP-SEC dan HPLC.

Kromatografi gas digunakan untuk melarutkan dan menghitung lipida seperti triasilgliserol dan

turunan-turunan FAME. TLC sangat sesuai untuk memisahkan ester kolestrol, mono, di,

triacylglycerols, asam lemak bebas, kolestrol, dan fospolipid. SEC dan HP-SEC digunakan untuk

memisahkan produk hidrolitik, oksidasi dan pemanasan lemak. Sedangkan HPLC digunakan

untuk memisahkan lipida non-volatil yang memiliki berat molekul tinggi.

Untuk menentukan kadar lemak total dalam makanan, the Nutrition and Labeling Education

membutuhkan tahapan sebagai berikut, yaitu (1) hidrolisis dengan asam atau basa; (2) ekstraksi

dengan eter ; dan (3) konversi asam lemak ke metil ester asam lemak (FAME) kemudian

menghitung kadar FAME dengan kromatografi gas. Artiss dkk (1988) menentukan kandungan

lipida dengan menggunakan TLC dan metode enzimatis. Enzim yang digunakan adalah enzim

hidrolase, oxidase dan peroxidase dalam precursor chromogen. Metode ini sesuai untuk

menentukan fospolipida hewan, jaringan tissue manusia dan fluida (Fachri 2008).

III. METODE ANALISIS PROTEIN

Analisis Kualitatif1. Reaksi Xantoprotein

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.

2. Reaksi Hopkins-Cole

Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.

3. Reaksi Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.

4. Reaksi Natriumnitroprusida

Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.

5. Reaksi Sakaguchi

Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.

6. Metode Biuret

Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.

Analisa Kuantitatif

Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut. Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV. Digunakan untuk protein terlarut.

1. Metode Kjeldahl

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

2. Metode Titrasi Formol

Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

3. Metode Lowry

Prosedur :

Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1) Pembuatan reagen Lowry B :Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%. Penetapan Kadar.

a. Pembuatan kurva baku.Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut : Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)

b. Penyiapan Sampel.Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya.

4. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)Prosedur :Pembuatan reagen Biuret :

Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda. Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA): Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li). Penetapan kadar (Metode Biuret) : Pembuatan kurva baku : Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades misal dengan komposisi sebagai berikut: Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada ë 550 nm terhadap blanko yang terdiri dari 800 µL reagen Biuret dan 200 µL aquades. Cara mempersiapkan sampel : Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif. Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5.

Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva baku.

5. Metode Spektrofotometri UV.

Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel.

IV. METODE ANALISIS ASAM AMINO

1. Uji ninhidrin

Dalam rentang pH 4-8, semua asam amino α- bereaksi dengan ninhidrin (triketohydrindene

hidrat), agen pengoksidasi kuat untuk memberikan produk berwarna ungu (diketohydrin) disebut

Rhuemann yang ungu. Semua amina primer dan amonia bereaksi sama tetapi tanpa pembebasan

karbon dioksida. Asam imino prolin dan hidroksiprolin juga bereaksi dengan ninhidrin, tetapi

mereka memberikan kompleks berwarna kuning bukan yang ungu. Selain asam amino, struktur

kompleks lainnya seperti peptida, pepton dan protein juga bereaksi positif ketika mengalami

reaksi ninhidrin.

2. Tes asam Xanthoproteic

Asam amino aromatik, seperti Phenyl alanin, tirosin dan triptofan, menanggapi tes ini. Dengan

keberadaan asam nitrat pekat, cincin fenil aromatik nitrasi untuk memberikan berwarna kuning

nitro-derivatif. Pada pH basa, perubahan warna oranye karena ionisasi kelompok fenolik.

3. Pauly yang diazo Uji

Tes ini khusus untuk mendeteksi Tryptophan atau Histidin. Reagen yang digunakan untuk tes ini

mengandung asam Sulphanilic dilarutkan dalam asam klorida. Sulphanilic asam pada diazotisasi

dengan adanya natrium nitrit dan hasil asam klorida dalam pembentukan garam diazonium. The

diazonium garam yang terbentuk pasangan dengan baik tirosin atau histidin dalam medium alkali

untuk memberikan chromogen berwarna merah (zat warna azo). 

4. Uji Millon yang 

Asam amino fenol seperti Tyrosine dan turunannya menanggapi tes ini. Senyawa dengan

hidroksibenzena radikal bereaksi dengan reagen Millon untuk membentuk kompleks berwarna

merah. Reagen Millon adalah larutan merkuri sulfat dalam asam sulfat.

5. Uji histidin

Tes ini ditemukan oleh Knoop. Reaksi ini melibatkan brominasi dari histidin dalam larutan asam,

diikuti dengan netralisasi asam dengan kelebihan amonia. Pemanasan larutan alkali

mengembangkan warna biru atau ungu.

6. Tes Hopkins cole 

Tes ini tes khusus untuk mendeteksi triptofan. Gugus indol dari triptofan bereaksi dengan asam

glyoxilic dengan adanya asam sulfat pekat untuk memberikan produk berwarna ungu. Asam

Glyoxilic dibuat dari asam asetat glasial dengan terkena sinar matahari.

7. Tes Sakaguchi

Dalam kondisi basa, naftol α- (naftalen 1-hidroksi) bereaksi dengan mono-disubstitusi guanidin

senyawa seperti arginine, yang setelah pengobatan dengan hipobromit atau hipoklorit,

menghasilkan karakteristik warna merah.

8. Uji sulfida timbal

Sulphur mengandung asam amino, seperti sistein dan sistin. setelah mendidih dengan natrium

hidroksida (alkali panas), menghasilkan natrium sulfida. Reaksi ini disebabkan pengkonversian

sebagian dari sulfur organik sulfida anorganik, yang dapat dideteksi dengan mengendapkan

untuk memimpin sulfida, menggunakan solusi asetat memimpin. 

9. Folin di McCarthy Sullivan Uji 

Asam imino seperti prolin dan hidroksiprolin mengembun dengan isatin reagen dalam kondisi

basa untuk menghasilkan adduct berwarna biru.Selain natrium nitroprusside [Na2Fe (CN) 5NO]

untuk larutan alkali metionin diikuti oleh pengasaman reaksi menghasilkan warna merah.Reaksi

ini juga membentuk dasar untuk penentuan kuantitatif metionin.

10.Tes Isatin

Asam imino seperti prolin dan hidroksiprolin mengembun dengan isatin reagen dalam kondisi

basa untuk menghasilkan adduct berwarna biru.

MAKALAH KIMIA KLINIS

METODE PENGUJIAN SECARA KUALITATIF DAN KUANTITATIF KARBOHIDRAT, LEMAK, PROTEIN DAN ASAM AMINO

DISUSUN OLEH :

NAMA : AMANDA AULIA TRISNANINGSIH

NIM : 201251190

INSTITUT SAINS TEKNOLOGI AL-KAMAL (ISTA)

JAKARTA

2015