Analisa Kualitatif Dan Kuantitatif Karbohidrat Fix

PAPER ANALISA MAKANAN DAN MINUMAN

UJI KARBOHIDRAT SECARA KUALITATIF DAN KUANTITATIF

Oleh:

I Nyoman Yoga Arimbawa

(P07134011038)

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

JURUSAN DIII ANALIS KESEHATAN

2013

ANALISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF

KARBOHIDRAT

Analisis Kualitatif

Karbohidrat dengan zat tertentu akan menghasilkan warna tertentu yg dapat dgunakan

untuk analisis kualitatif. Beberapa reaksi yg lebih spesifik dpt membedakan golongan

karbohidrat. Banyak cara untuk mengetahui atau mengidentifikasi karbohidrat dalam suatu

bahan alam, diantaranya adalah sebagai berikut:

1. Uji Molisch

Prinsip

Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat. Dehidrasi

heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan dehidrasi pentose

menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang merupakan

kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish.

Karbohidrat yang dianalisis

Uji molisch adalah uji kimia kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat. Uji ini untuk

semua jenis karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan memberikan hasil positif.

Sampel yang diuji dicampur dengan reagent Molisch, yaitu α-naphthol yang terlarut

dalam etanol 95%. Setelah pencampuran atau homogenisasi, H2SO4 pekat perlahan-lahan

dituangkan melalui dinding tabung reaksi agar tidak sampai bercampur dengan larutan atau

hanya membentuk lapisan. H2SO4 pekat (dapat digantikan asam kuat lainnya) berfungsi untuk

menghidrolisis ikatan pada sakarida untuk menghasilkan furfural. Furfural ini kemudian bereaksi

dengan reagent Molisch, α -naphthol membentuk cincin yang berwarna ungu.

Reaksi :

.

Prosedur kerja :

1. Masukkan 15 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering

danbersih

2. Tambahkan 3 tetes pereaksi Molisch. Campurkan dengan baik.

3. Miringkan tabung rekasi, lalu alirkan dengan hati-hati 1 mL H2SO4 pekat melalui dinding

tabung supaya tidak bercampur.

4. Perhatikan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan

yangmenandakan reaksi positif karbohidrat.

5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.

6. Lakukan tes terhadap larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa, maltosa,

arabinosa,larutan 1% amilum dan selulosa (kapas) yang disuspensikan dalam air.

2. Uji Benedict

Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi

(yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas) . Gula pereduksi meliputi semua jenis

monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan maltosa. Uji benedict

berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh gugus aldehid atau keton bebas dalam suasana

alkalis, biasanya ditambahkan zat pengompleks seperti sitrat atau tatrat untuk mencegah

terjadinya pengendapan CuCO3.

Prinsip

Gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan mereduksi ion Cu 2+

dalam suasana alkalis menjadi Cu+ yang mengendap sebagai Cu2O berwarna merah bata.

Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan merah bata, kadang disertai dengan

larutan yang berwarna hijau, merah, atau orange. Pada uji Benedict, pereaksi ini akan bereaksi

dengan gugus aldehid, kecuali aldehid dalam gugus aromatik, dan alpha hidroksi keton. Oleh

karena itu, meskipun fruktosa bukanlah gula pereduksi, namun karena memiliki gugus alpha

hidroksi keton, maka fruktosa akan berubah menjadi glukosa dan mannosa dalam suasana basa

dan memberikan hasil positif dengan pereaksi benedict.


Untuk mengetahui adanya monosakarida dan disakarida pereduksi dalam makanan, sample

makanan dilarutkan dalam air, dan ditambahkan sedikit pereaksi benedict. Dipanaskan dalam

waterbath selama 4 - 10 menit. Selama proses ini larutan akan berubah warna menjadi biru

(tanpa adanya glukosa), hijau, kuning, orange, merah dan merah bata atau coklat (kandungan

glukosa tinggi). Sukrosa (gula pasir) tidak terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Sukrosa

mengandung dua monosakrida (fruktosa dan glukosa) yang terikat melalui ikatan glikosidik

sedemikian rupa sehingga tidak mengandung gugus aldehid bebas dan alpha hidroksi keton.

Sukrosa juga tidak bersifat pereduksi.

Prosedur kerja :

1. Masukkan 3 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering dan

bersih

2. Tambahkan 2 mL pereaksi Benedict, kemudian dikocok.

3. Masukan kedalam penangas air selama 5 menit. Amati perubahan warna endapannya.

4. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi

positif karbohidrat.


6. Lakukan percobaan ini dengan menggunakan larutan glukosa, galaktosa,

maltosa,fruktosa, laktosa, sukrosa dan larutan amilum.

3. Uji Barfoed

Prinsip

Ion Cu2+ (dari pereaksi Barfoed) dalam suasana asam akan direduksi lebih cepat oleh gula

reduksi monosakarida daripada disakarida dan menghasilkan endapan Cu2O berwarna merah

bata.


Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan jalan mengontrol

kondisi-kondisi percobaan, seperti pH dan waktu pemanasan. Pada analisa ini, karbohidrat

direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif bila didihkan cukup

lama hingga terjadi hidrolisis.

Uji Barfoed menggunakan reagen Barfoed yang terdiri dari tembaga asetat dan asam

asetat glacial sebagai pereaksi. Diketahui bahwa disakarida merupakan agen pereduksi yang

lemah, mereka tidak membentuk ion kupri pada reagen Barfoed yang ada dalam keadaan asam,

sedangkan monosakarida merupakan agen pereduksi yang kuat dan mampu membentuk ion

kupri dalam reagen Barfoed dalam keadaan asam karena itu uji Barfoed ini digunakan untuk

membedakan disakarida pereduksi dengan monosakarida pereduksi dalam suatu sampel.

Reaksi :

O O

║ Cu2+ asetat ║

R—C—H + ─────→ R—C—OH + Cu2O+ CH3COOH

n-glukosa E.merah

monosakarida bata

Prosedur kerja :

1. Masukkan 1 mL larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering dan

bersih.

2. Tambahkan 1 mL pereaksi Barfoed, kemudian dikocok.

3. Masukan kedalam penangas air selama 3 menit.

4. Kemudian didinginkan dalam air mengalir.

5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15 menit sampai

terlihat adanya reduksi.

6. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya

7. Lakukan percobaan ini dengan larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa dan maltosa.

4. Uji Seliwanoff

Prinsip

Dehidrasi fruktosa oleh HCl pekat menghasilkan hodroksimetilfurfural dan dengan

penambahan resorsinol akan mengalami kondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna

merah oranye.

Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa (karbohidrat yang mengandung

gugus keton). Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl panas menjadi asam

levulinat dan 4-hidroksilmetilfurfural. Jika dipanaskan karbohidrat yang mengandung gugus

keton akan menghasikan warna merah pada larutannya. Disakarida sukrosa yang mudah

dihidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa memberi reaksi positif dengan uji Seliwanoff. Glukosa

dan karbohidrat lain dalam jumlah banyak dapat juga memberi warna yang sama.

Pada pengujian dilakukan pemanasan pada larutan, pemanasan akan membantu proses

hidrolisis disakarida yang akan menghasilkan monosakarida ketosa, dan kemudian member

warna. Keberadaan HCl dalam reagen pada saat fruktosa yang berada dalam golongan ketosa

bereaksi dengannya akan menghasilkan warna merah cherry dengan struktur kimia yang

kompleks. Sebaliknya golongan disakarida seperti maltosa dan laktosa tidak bereaksi (negatif)

pada saat mereka dihidrolisis menjadi monosakarida aldosa, dengan kata lain aldosa tidak

bereaksi dalam uji Seliwanoff ini.

Reaksi :

Prosedur kerja :

1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi 2

mL pereaksi Seliwanoff.

2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yangterjadi.


4. Lakukan percobaan ini dengan larutan fruktosa, glukosa, dan sukrosa.

5. Terjadinya perubahan warna merah dan endapan menunjukan reaksi positif untuk ketosa,

bila endapan dilarutkan dalam alcohol terjadi larutan berwarna merah.

5. Uji Fehling

Prinsip reaksi ini yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk mereduksi senyawa

Cu2SO4 menjadi Cu2O (enpadan berwarna merah bata) setelah dipanaskan pada suasana

basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan ditambahkan agen pengikat

(chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat.

Reaksi :

6. Uji Tollens

Prinsip

Aldehid dioksidasi menjadi anion karboksilat, ion Ag+ dalam reagensia Tollens direduksi

menjadi logam Ag. Uji positf ditandai dengan terbentuknya cermin perak pada dinding dalam

tabung reaksi.

Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan heksosa.

Aldehidadapat mereduksi pereaksi Tollens sehingga membebaskan unsur perak (Ag). Pereaksi

tollens, pengoksidasi ringan yang digunakan dalam uji ini, adalah larutan basa dari perak nitrat.

Larutannya jernih dan tidak berwarna. Untuk mencegah pengendapan ion perak sebagai oksida

pada suhu tinggi, maka ditambahkan beberapa tetes larutan amonia. Amonia membentuk

kompleks larut air dengan ion perak. Pereaksi Tollens mengandung ion diammin perak(I),

[Ag(NH3)2]+. Ion ini dibuat dari larutan perak (I) nitrat. Caranya dengan memasukkan setetes

larutan natrium hidroksida ke dalam larutan perak (I) nitrat yang menghasilkan sebuah endapan

perak (I) oksida, dan selanjutnya tambahkan larutan amonia encer secukupnya untuk melarutkan

ulang endapan tersebut.

Pereaksi Tollens sering disebut sebagai perak amoniakal. Endapan perak pada uji ini akan

menempel pada tabung reaksi yang akn menjadi cermin perak. Oleh karena itu Pereaksi Tollens

sering juga disebut pereaksi cermin perak.

Prosedur kerja :

1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi2

mL pereaksi Tollens.

2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yangterjadi.


7. Uji Osazon

Prinsip

Pada uji Osazon, yang mendasarinya adalah pemanasan karbohidrat yang memiliki gugus

aldehida atao keton bersama fenilhidrazin berlebihan akan membentuk hidrazon atau osazon.

Osazon yang terbentuk mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang spesifik. Osazon dari

disakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila didinginkan, namun sukrosa tidak

membentuk osazon karena gugus aldehida dan keton yang terikat pada monomernya sudah tidak

bebas, sebaliknya osazon monosakarida tidak larut dalam air mendidih.

Pada uji Osazon, yang mendasarinya adalah pemanasan karbohidrat yang memiliki gugus

aldehida atau keton bersama fenilhidrazin berlebihan akan membentuk hidrazon atau osazon.

Osazon yang terbentuk mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang spesifik. Osazon dari

disakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila didinginkan, namun sukrosa tidak

membentuk osazon karena gugus aldehida dan keton yang terikat pada monomernya sudah tidak

bebas, sebaliknya osazon monosakarida tidak larut dalam air mendidih. Beberapa larutan uji

menunjukkan reaksi positif dengan membentuk kristal berwarna kuning yang disebut dengan

osazon yaitu larutan fruktosa dan galaktosa dan larutan lainnya tidak membentuk kristal osazon.

Setelah diamati di bawah mikroskop, bentuk kristal dari fruktosa adalah pentagonal sedangkan

pada galaktosa segi empat runcing.

Prosedur kerja :

1. Masukkan 5 mL larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi.

2. Masukkan campuran fenil hidrazon Na-asetat kering.

3. Kocok dan panaskan dalam penangas air selama 30 menit.

4. Dinginkan, kemudian diperiksa endapan yang terbentuk di bawah mikroskop.


6. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, sukrosa, glukosa, fruktosa, maltosa,dan

galaktosa

8. Uji Iodium

Prinsip

Polisakarida dengan penambahan iodium akan membentuk kompleks adsorpsi berwarna

yang spesifik. Amilum atau pati dengan iodium menghasilkan warna biru , dekstrin

menghasilkan warna merah anggur, sedangkan glikogen dan sebagian pati yang terhidrolisis

bereaksi dengan iodium membentuk warna cokelat.

Karbohidrat dengan golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan larutan

iodium dan memberikan warna yang spesifik bergantung pada jenis karbohidratnya. Analisa

dengan iodin akn berwarna biru, amilopektin dengan iodin akan berwarna merah violet, glikogen

dengan iodin akan berwarna merah cokelat, begitu juga dengan dekstrin.

Uji Iodium Dilakukan untuk menentukan polisakarida. Larutan uji dicampurkan dengan

larutan iodium. Hasil positif ditandai dengan amilum dengan iodium berwarna biru, dan dekstrin

dengan iodium berwarna merah anggur.

Prosedur kerja :

1. 2 ml larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau porselin tetes.

2. Kemudian ditambahkan dua tetes larutan iodium.

3. Kemudian warna spesifik yang tebentuk diamati.

9. Uji Bial

Uji bial untuk menguji adanya gula pentose. Pemanasan pentose dengan HCl pekat akan

menghasilkan furfural yang berkondensasi dengan orcinol dan ion feri. Hasil pemanasan akan

menghasilkan warna biru hijau yang menunjukkan adanya gula pentosa.

Prinsip

Pada uji bial, dasar dari percobaannya adalah dehidrasi pentosa oleh HCl pekat

menghasilkan furfural dengan penambahan orsinol (3.5-dihidroksi toluena) akan berkondesasi

membentuk senyawa kompleks berwarna biru.

Prosedur Kerja :

1. 5 tetes sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi

2. Ditambahkan 10 tetes pereaksi bial dan 2 tetes HCl pekat

3. Dihomogenkan dan dipanaskan hingga mendidih

4. Diamati perubahan warna yang terjadi

10. Uji Asam Musat

Prinsip

Dilakukan untuk membedakan antara glukosa dan galaktosa. Larutan uji dicampurkan

dengan HNO3 pekat kemudian dipanaskan. Karbohidrat dengan asam nitrat pekat akan

menghasilkan asam yang dapat larut. Namun, laktosa dan galaktosa menghasilkan asam musat

yang dapat larut.

Prosedur Kerja :

1. 10 tetes larutan uji dan 2 tetes HNO3 pekat dimasukkan di dalam tabung reaksi.

2. Selanjutnya dipanaskan dalam penangas air mendidih sampai volumenya kira-kira

tinggal 2-3 tetes.

3. Lalu didinginkan perlahan-lahan, dan perhatikan terbentuknya kristal-kristal keras seperti

pasir.

4. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop.

11. Hidrolisa Sukrosa

Sukrosa adalah karbohidrat golongan disakarida yang terdiri dari dua unit monosakarida,

yaitu glukosa dan fruktosa. Dengan asam kuat encer sukrosa dapat dihidrolisa menjadi unit-unit

monosakaridanya. Hidrolisis sukrosa ini untuk membuktikan apakah hasil hidrolisis dari sukrosa

adalah glukosa dan fruktosa yaitu dengan cara setelah sukrosa dihidrolisis, larutan yang telah

dihidrolisis itu dites dengan test benedict untuk membuktikan glukosa dan test seliwanoff untuk

membuktikan ada fruktosa.

Hal ini menyebabkan uji Benedict dan uji Seliwanoff yang sebelum hidrolisis

memberikan hasil negatif menjadi positif. Uji Barfoed menjadi positif pula dan menunjukkan

bahwa hidrolisis sukrosa menghasilakn monosakarida.

Prinsip

Untuk mengidentifikasi hasil hidrolisis sukrosa digunakan larutan sukrosa 1%, pereaksi

Benedict, pereaksi Seliwanoff, pereaksi Barfoed, larutan HCl pekat, larutan NaOH 2% sebagai

bahannya. larutan sukrosa ditambahkan dengan HCl pekat lalu dipanaskan selama 45 menit.

Setelah didinginkan dinetralkan dengan NaOH 2%. Lalu diuji dengan pereaksi Benedict,

Seliwanoff, dan Barfoed.

Prosedur Kerja

1. Isi tabung reaksi dengan 5 mL larutan uji sukrosa.

2. Tambahkan 1 mL HCl 10%.

3. Masukan kedalam penangas air selama 15 menit.

4. Dinginkan perlahan-lahan, kemudian netralkan.

5. Tes hidrolisa dengan pereaksi Benedict, Seliwanoff dan Barfoed.


12. Hidrolisa Pati

Pati (starch) atau amilum merupakan polisakarida yang terdapat pada sebagian besar

tanaman, terbagi menjadi dua fraksi yaitu amilosa dan amilopektin. Amilosa (± 20%) memilki

strusktur linier dan dengan iodium memberikan warna biru serta larut dalam air. Fraksi yang

tidak larut disebut amilopektin (± 80%) dengan struktur bercabang. Dengan penambahan iodium

fraksi memberikan warna ungu sampai merah. Pati dalam suasana asam bila dipanaskan akan

terhidrolisis menjadi senyawa-senyawa yang lebih sedrhana. Hasil hidrolisis dapat dengan

iodium dan menghaislkan warna biru sampai tidak berwarna.

Pada percobaan ini akan terlihat bahwa pada hidrolisis pati ini glukosa akan terbentuk

sebagai zat akhir. Penambahan HCl pekat lalu pemanasan dimaksudkan agar hidrolisis terjadi

karena hidrolisis pati hanya terjadi dalam pemanasan dengan asam.

Prinsip

Untuk mengidentifikasi hasil hidrolisis amilum digunakan larutan amilum 1%, larutan

iodium, pereaksi Benedict, larutan HCl 2 N, Larutan NaOH 2%. Amilum ditambahkan dengan

HCl lalu dipanaskan. Dilakukan uji iodium setiap 3 menit hingga warnanya berubah jadi kuning

pucat. Kemudian larutan dihidrolisis lagi selama 5 menit lalu didinginkan dan dinetralkan

dengan NaOH 2%,. Lalu diuji dengan pereaksi Benedict.

Prosedur Kerja

1. Masukkan 25 mL larutan pati 1% ke dalam sebuah gelas kimia.

2. Tambahkan 10 tetes HCl pekat, dan panaskan dalam penangas air.

3. Setiap 3 menit ambil satu tetes larutan dan tes dengan iodium.

4. Pada waktu yang sama diambil lagi 3 tetes larutan dan ditambahkan pereaksi Benedict

kemudian dipanaskan dalam penangas air, amati derajat reduksi yang terjadi dan

bandingkan dengan tes iodium.

13. Reaksi Pati dengan Iodium

Prinsip

Pati dengan iodium membentuk kompleks yang berwarna biru. Akan tetapi struktur atau ikatan

antara iodium dengan pati belum diketahui dengan pasti. Dextrin dengan iodium akan

menghasilkan warna merah anggur.

Prosedur Kerja

1. Kedalam 1 mL larutan pati 1% ditambahkan 2 tetes larutan iodium.

2. Panaskan, kemudian dinginkan kembali.

3. Perhatikan baik-baik perubahan warna yang terjadi.

4. Kemudian tambahkan tetes demi tetes larutan thiosulfat sampai warna hilang.

II. Analisis Kuantitatif

Kadar karbohidrat dalam berbagai bahan makanan dapat ditentukan dengan berbagai cara,

diantaranya cara kimiawi, cara fisik, cara enzimatik atau biokimia dan cara kromatografi.

Penentuan karbohidrat yang termasuk polisakarida maupun oligosakarida memerlukan

pendahuluan yaitu hidrolisis lebih dahulu sehingga diperoleh monosakarida. Untuk keperluan ini,

maka bahan dihidrolisa dengan asam atau enzim pada suatu keadaan tertentu. Salah satu metode

yang dapat digunakan adalah Luff Schoorl.

Penentuan kadar karbohidrat pada percobaan dengan metode Luff Schoorl dibagi atas tiga

tahapan, yaitu:

1. Tahap sebelum inversi

2. Tahap setelah inversi lemah

3. Tahap setelah inversi kuat

Pada penentuan karbohidrat dengan metode Luff Schoorl, yang ditentukan bukan Cu2O

yang mengendap tapi dengan menggunakan CuO dalam larutan yang belum direaksikan dengan

gula reduksi (titrasi blanko) dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi (titrasi sampel).

Penentuannya dengan menggunakan titrasi volumetri. Setelah diketahui selisih banyaknya titrasi

blanko dan titrasi sampel kemudian dikonsultasikan dengan tabel yang telah tersedia yang

menggambarkan hubungan antara banyaknya Na2S2O3 dengan banyaknya gula pereduksi. Pada

metode Luff Schoorl terdapat dua cara pengukuran yaitu :

1. Penentuan Cu tereduksi dengan I2

2. Menggunakan prosedur Lae-Eynon

Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan oleh komposisi

yang konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan bahwa hasil

pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang berbeda.

Monosakarida akan mereduksikan CuO dalam larutan Luff menjadi Cu2O. Kelebihan CuO

akan direduksikan dengan KI berlebih, sehingga dilepaskan I2. I2 yang dibebaskan tersebut

dititrasi dengan larutan Na2S2O3. Pada dasarnya prinsip metode analisa yang digunakan adalah

Iodometri karena kita akan menganalisa I2 yang bebas untuk dijadikan dasar penetapan kadar.

Dimana proses iodometri adalah proses titrasi terhadap iodium (I2) bebas dalam larutan. Apabila

terdapat zat oksidator kuat (misal H2SO4) dalam larutannya yang bersifat netral atau sedikit asam

penambahan ion iodida berlebih akan membuat zat oksidator tersebut tereduksi dan

membebaskan I2 yang setara jumlahnya dengan dengan banyaknya oksidator. I2 bebas ini

selanjutnya akan dititrasi dengan larutan standar Na2S2O3 sehinga I2 akan membentuk kompleks

iod-amilum yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, jika dalam suatu titrasi membutuhkan

indikator amilum, maka penambahan amilum sebelum titik ekivalen.

Metode Luff Schoorl ini baik digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat yang

berukuran sedang. Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa metode Luff Schoorl

merupakan metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat kesalahan sebesar

10%.

Persamaan reaksinya:

R-COH + 2 CuO → Cu2O (s) + R-COOH (aq)

H2SO4 (aq) + CuO → CuSO4 (aq) + H2O (l)

CuSO4 (aq) + 2 KI (aq) → CuI2 (aq) + K2SO4 (aq)

2 CuI2 ↔ Cu2I2 + I2

I2 + Na2S2O3 → Na2S4O6 + NaI

I2 + amilum → Biru

Penetapan sebelum inversi dilakukan untuk mengetahui jumlah gula pereduksi yang

terdapat dalam sampel. Penetapan inversi lemah dilakukan untuk mengetahui jumlah disakarida

yang tidak bersifat reduksi seperti sukrosa. Penetapan sesudah inversi kuat biasanya dilakukan

untuk menentukan kadar karbohidrat pada poliskarida.

Contoh Uji Kuantitatif Karbohidrat

1. Analisis total gula (Metode Anthrone)

Gula dapat bereaksi dengan sejumlah pereaksi menghasilkan warna spesifik. Intensitas

warna dipengaruhi oleh konsentrasi gula. Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan

spektofotometer. Pereaksi Anthrone (9,10-dihidro-9-oksoantrasena) 0,1% dalam asam sulfat

pekat. Pereaksi Anthrone bereaksii dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat menghasilkan

warna biru kehijauan. Intensitas absorbansnya diukur pada λ=630nm. Metode ini digunakan

untuk analisis total gula bahan padat atau cair.

Prinsip :

Prinsip dasar dari metode anthrone adalah senyawa anthrone akan bereaksi secara

spesifik dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna biru kehijauan yang

khas. Senyawa anthrone (9,10-dihydro-9- oxanthracene) merupakan hasil reduksi anthraquinone.

Prosedur kerja

Pembuatan kurva standar :

1. Kedalam tabung reaksi bertutup, pipet larutan glukosa standar sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8; dan

1,0 ml (glukosa standar 0,2 mg/ml), lalu encerkan sehingga total volume masing-masing

tabung 1,0 ml.

2. Buat larutan blanko dengan cara memipet 1 ml air destilata ke dalam tabung reaksi lain.

3. Tambahkan pereaksi 5 ml Anthrone dengan cepat ke dalam larutan glukosa standard an

blanko kemudian tutup. Voertex dan kocok hingga merata.

4. Panaskan tabung reaksi di atas penangas air 100oC selama 12 menit. Dinginkan

5. Pindahkan larutan ke dalam kuvet dan baca absorbans dengan UV-Vis spektrofotometer pada

630 nm.

6. Buat plot kurva yaitu konsentrasi (g) glukosa standar pada sumbu x dan nilai absorbans pada

sumbu y.

Analisis contoh :

1. Lakukan pengenceran contoh

2. Masukkan sebanyak 1ml contoh kedalam tabung reaksi tertutup

3. Lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar

Perhitungan metode ini adalah dengan menentukan konsentrasi gula dalam contoh

mengguanakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan

memperhitunkan pengenceran yang dilakukan. Rumusnya dapat ditulis sebagai berikut.

Total gula (%) = ((GxFP)/W)x100

Dimana:

G = konsentrasi gula dari kurva standar (gram)

FP = faktor pengenceran

W = berat contoh (gram)

2. Analisis total gula (Metode Fenol)

Metode ini digunakan untuk menetapkan total gula semua bahan pangan. Sebelumnya

contoh harus disiapkan seperti pada persiapan contoh untuk analisis gula.

Prinsip :

Gula sederhana, oligosakarida, polisakarida, dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol

dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna oranye kekuningan yang stabil.

Prosedur:

Pembuatan kurva standar :

1. Ambil sebanyak 2ml larutan pada beberapa konsentrasi

2. Tambahkan 1ml larutan fenol (5%), lakukan vortex

3. Tambahakan 5 ml larutan asam sulfat pekat dengan cepat secara tegak lurus kepermukaan

cairan

4. Diamkan selama 10 menit, vorteks, dan tempatkan dalam penangas air selama 15 menitUkur

absorbansnya pada 490nm untuk hekstosa sedangkan untuk pentosa dan asam uronat 480 nm.

5. Buat plot kurva standar. Lalu tentukan persamaan regresi linier.

Analisis contoh

1. Lakukan pengenceran contoh

2. Masukkan 2ml contoh ke dalam tabung reaksi dan lakukan tahap seperti pada pembuatan

kurva standar.

Perhitungan menggunakan metode fenol adalah konsentrasi gula dalam contoh ditentukan

dengan menggunakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan

absorbans) dan memperhitungkan pengenceran yang dilakukan. Rumus perhitungannya dapat

ditulis sebagai berikut.

Total gula (%) = ((GxFP)/W)x100

Dimana:

G = konsentrasi gula dari kurva standar (gram)


W = berat contoh (gram)

3. Analisis gula reduksi (Metode Lane-Eynon)

Gula pereduksi dalam bahan pangan dapat ditentukan konsentrasinya berdasarkan pada

kemampuannya untuk mereduksi pereaksi lain. Analisis gula pereduksi dengan metode Lane-

Eynon dilakukan secara volumetri dengan titrasi/titrimetri. Metode ini digunakan untuk

penentuan gula pereduksi dalam bahan padat atau cair seperti laktosa, glukosa, fruktosa, maltosa.

Prinsip :

Metode Lane-Eynon didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi Fehling oleh gula-gula

pereduksi. Penetapan gula pereduksi dengan melakukan pengukuran volume larutan gula

pereduksi standar yang dibuthkan untuk mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga

(II) oksida (Cu2O). Udara yang mempengaruhi reaksi dikeluarkan dari campuran reaktan dengan

cara mendidihkan laruta selama titrasi.

Titik akhir titrasi ditunjukkan dengan metilen blue yang warnanya akan hilang karena

kelebihan gula pereduksi di atas jumlah yang dibutuhkan untuk mereduksi semua tembaga.

Pereaksi yang digunakan adalah Fehling A berisi tembaga (II) yaitu CuSO4.5H2O dan

H2SO4 serta Fehling B berisi garam Rochelle atau potasium sodium tartat teirahidrat

(KnaC4H6O6.4H2O) dan NaOH.

Prosedur :

Standarisasi larutan fehling :

1. Masukkan 10 ml laruta campuran Fehling A dan B kedalam erlenmeyer dan tambah 2-4 tetes

metilen blue 0,2%.

2. Kemudian lakukan tahapan seperti pada analisis contoh.

Analisis contoh :

1. Campurkan larutan fehling A dan B dengan volume yang sama

2. Pipet 10 ml larutan dari hasil persiapan contoh kedalam erlemeyer

3. Tambahkan kedalam erlenmeyer 10 ml larutan campuran fehling A dan B serta 2-4 tetes

metilen blu 0,2 %.

4. Panaskan campura larutan di atas hot plate magnetic stirrer

5. Setelah mendidih, lakukan titrasi sengan larutan gula standart sampai warna biru hilang

6. Titrasi dilakukan dengan cepat, maka perlu ditambahkan larutan glukosa standar dengan

volume tertentu.

Perhitungan dalam metode ini adalah sebagai berikut.

Gula pereduksi (%) = [(V0-Vs)xGxTsxFx100]/(TxW)

Dimana:

Vo = volume larutan glukosa standar untuk titrasi larutan Fehling (ml)

Vs = volume larutan glukosa standar untuk titrasi contoh (ml)

G = konsentrasi larutan glukosa standar (g/ml)

Ts = volume contoh total dari persiapan contoh (ml)

T = volume contoh yang diperlukan untuk titrasi (ml)

W = berat contoh (g)

F = faktor pengenceran

4. Analisis Gula Reduksi (Nelson-Somogyi)

Dalam menentukan gula pereduksi dalam bahan padat atau cair perlu persiapan contoh

gula terlebih dahulu. Dalam metode ini digunakan pereaksi tembaga sulfat yanng mengandung

Na2HPO4, sodium potasium tartrat, NaOH, CuSO4, Na2SO4- dan pereaksi arsenomolibdat yang

mengandung amonium molibdat, H2SO4, Na2H2SO4.7H2O.

Prinsip :

Metode Nelson-Somogyi didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi tembaga sulfat oleh

gula-gula pereduksi. Gula pereduksi mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga (I)

oksida (Cu2O). Cu2O ini bersama dengan arsenomolibdat membentuk senyawa komplek

berwarna. Intensitas warna menunjukkan banyaknya gula pereduksi dengan pengujian

menggunakan λ=520 nm.

Prosedur Kerja

Pembuatan kurva standar

1. Siapkan 6 tabung reaksi masing masing diisi dengan 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 ml larutan

glukosa standar.

2. Tambahkan aquadest dalam tiap tiap tabung tersebut sehingga volume untuk tiap-tiap tabung

mencapai 1 ml

3. Tambahkan 1 ml reagensia Nelson pada tiap-tiap tabung dan panaskan dalam air mendidih

selama 20 menit

4. Dinginkan semua tabung dengan cara direndam dalam air dingin hingga suhu mencapai 250C

5. Tambahkan 1 ml reagen Arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung, kocok homogen sampai

semua endapan kuprooksida larut semua.

6. Tambahkan 7 ml aquadest,kocok homogen

7. Tera absorbansinya pada λ 540 nm dengan spektrofotometer

8. Buat kurva standar hubungan antara absorbansi dan konsentrasi

9. Tentukan persamaan kurva standarnya

Penentuan kadar gula reduksi sampel:

1. Ambil 1 ml larutan sampel jernih, lakukan prosedur yang sama dengan pembuatan kurva

standar mulai dari no. 3 – 7.

2. Tentukan kadar gula reduksi sampel dengan menggunakan persamaan kurva standar.

Perhitungan dalam metode ini adalah kandungan gula pereduksi dalam contoh ditentukan

dengan menggunakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan

absorbans) dan memperhitungkan pengenceran yang dilakukan. Apabila kandungan gula

pereduksi diketahui, maka kandungan gula non-pereduksi dapat ditentukan sebagai selisih antara

kadar total gula dengan kadar gula pereduksi.

Total gula = gula pereduksi + gula non-reduksi

5. Analisis Total Pati, Amilosa, Amilopektin

Kandungan pati dalam bahan pangan dapat ditentukan secara volumetrik/titrimetri atau

kolorimetri. Penentuan total pati adalah dengan cara menghidrolisis pati secara sempurna

menjadi glukosa. Hidrolisis pati menjadi gula dapat terjadi saat ada perlakuan asam yaitu

memecah ikatan glikosidik yang menghubungkan antar glukosa. Dapat juga terjadi secara

enzimatis (enzim α-amilase dan glukoamilase) yang memecah molekul-molekul amilosa dan

amilopektinn menjadi gula sederhana.

Kandungan glukosa dapat ditentukan menggunakan metode penetapan gula seperti

metode Anthrone, metode fenol, metode Lane-Eynon, metode Nelson-Somogyi. Kandungan pati

ditentukan menggunakan fakor pengali (0,9). Sehingga kandungan pati adalah kandungan

glukosa x 0,9. Dapat ditentukan untuk analisis kadar pati pada contoh padat atau cair.

Prosedur Kerja Analisis Total Pati

Persiapan Contoh :

1. Masukkan sebanyak 2 – 5 g contoh padat atau cair ke dalam gelas (untuk contoh padat

perlu dihaluskan dahulu)

2. Tambahkan ke dalam gelas piala sebanyak 50 ml alkohol 80%. Aduk selama 1 jam

3. Saring suspensi yang terbentuk dengan kertas saring dan cuci dengan air sampai volume

filtrat 250 ml (filtrat ini mengandung karbohidrat yang larut dan dibuang)

4. Untuk menghilangakn lemak, cuci pati yang terdapat sebagai residu dengan 10 ml eter

(sebanyak 5 kali). Saring setiap pencucian dengan kertas saring. Biarkan menguap eter yang

tersisa dalam residu.

5. Cuci lagi residu dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat

yang terlarut.

6. Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam gelas piala dengan cara

pencucian dengan 200 ml air. Tambahkan 20 ml HCl 25%.

7. Tutup suspensi residu di dalam gelas piala dengan pendinginan balik (kondensor).

8. Setelah didinginkan, netralkan larutan yang terbentuk dengan larutan NaOH 45% dan

masukkan ke dalam labu takar 500 ml secara kuantitatif.

9. Tepatkan larutan sampai tanda tera dengan menggunakan air destilat.

10. Saring kembali larutan dengan menggunakan kertas saring.

Analisis contoh :

Filtrate diperoleh dari persiapan contoh dianalisis kadar glukosa dengan menggunakan

analisis gula pereduksi (metode Lane – Eynon atau Nelson - Somogyi).

Perhitungan

Berat pati dalam contoh diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan 0,9. Angka 0,9

adalah factor konversi untuk pembentukan glukosa dari hidrolisis pati.

Prosedur Kerja Analisis Amilosa

Pembuatan kurva standar

1. Timbang sebanyak 40 mg amilosa murni dan masukkan ke dalam tabung reaksi.

2. Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N.

3. Panaskan tabung reaksi di dalam air mendidih sekitar 10 menit sampai semua amilosa

membentuk gel.

4. Setelah didinginkan, pindahkan campuran secara kuantitatif ke dalam labu takar 100ml dan

tepatkan dengan air sampai tanda tera

5. Pipet gel amilosa (beberapa seri konsentrasi) ke dalam labu takar 100ml

6. Tambahkan ke dalam masing – masing labu takar asam asetat 1N, kemudian tambahkan

masing – masing 2 ml larutan iod.

7. Tepatkan larutan iod dengan air hingga tanda tera.

8. Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbans dari intensitas warna biru dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm.

9. Buat kurva standar sebagai hubungan antara kadar amilosa (sumbu x) dengan absorbans

(sumbu y)

Analisis contoh :

1. Gunakan contoh tepung yang mengandung pati (apabila contoh mengandung komponen lain

maka pati perlu diekstrak dahulu)

2. Timbang sebanyak 100mg contoh dan masukkan ke dalam tabung reaksi

3. Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1ml etanol 95% dan 9ml NaOH 1 N.

4. Panaskan tabung reaksi selama 10 menit untuk menggelatinisasi pati

5. Setelah didinginkan, masukkan pasta pati ke dalam labu takar 100ml dan tepatkan hingga

tanda tera dengan menggunakan air

6. Pipet larutan pati tersebut dan dimasukkan ke dalam labu takar 100ml, lalu ditambahkan

asam asetat 1N, 2 ml larutan iod, dan air hingga tanda tera

7. Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 625

nm.

Kandungan amilosa ditentukan berdasarkan kemampuan amilosa untuk bereaksi dengan

senyawa iod yang menghasilkan kompleks berwarna biru. Intensitas warna biru tergantung pada

kadar amilosa dan dapat ditentukan secara spektofotometri. Kandungan amilopektin ditentukan

sebagai selisih antara kandungan pati dengan amilosa.

Pati = amilosa + amilopektin

Perhitungan dalam menentukan berat pati dalam contoh diperoleh dengan mengalikan berat

glukosa dengan 0,9. Angka 0,9 adalah faktor konversi untuk pembentukan glukosa dari hidrolisa

pati. Perhitungan kadar amilosa ditentukan dengan menggunakan kurva standar, dengan

menggunakan rumus:

Kadar amilosa (%) = (CxVxFPx100)/W

Dimana,

C= konsentrasi amilosa contoh dari kurva standar (mg/ml)

V = volume akhir contog (ml)


W = berat contoh (mg)

Kadar amilopektin (%) = Kadar pati (%) – Kadar amilosa (%)

6. Analisis Karbohidrat Yang Tidak Dapat Dicerna

Analisis Karbohidrat Yang Tidak Dapat Dicerna yaitu meliputi Analisis serat kasar

(crude fiber) dan analisis serat makanan (dietary fiber).Serat kasar ditentukan dari residu setelah

contoh diperlakukan dengan asam dan basa kuat. Serat makanan ditentukan berdasarkan kadar

acid detergent fiber (ADF) dan neutral detergen fiber (NDF). ADF itu sendiri terdiri dari

sebagian besar selulosa dan lignin, dan sebagian kecil hemiselulosa dan substansi pektat

sehingga umumnya dianggap sebagai selulosa dan lignin. NDF terdiri dari selulosa,

hemiselulosa, dan lignin. Penetapan lignin yaitu dengan metode klason. Sedangkan penetapan

substansi pekat dengan metode spektrifotometer. Kadar hemiselulosa diperoleh dengan

menghitung selisih kadar NDF dengan kadar ADF. Kadar selulosa diperoleh dengan menghitung

selisih kadar ADF dan kadar Lignin. Total serat makanan dihitung dengan menjumlahkan kadar

NDF dengan kadar substansi pektat. Serat kasar yaitu residu dari bahan makanan yang telah

diperlakukan dengan asam dan alkali mendidih. Terdiri dari selulosa, sedikit lignin dan pentosa.

Prosedur Kerja

1. Giling contoh sampai halus sehingga dapat melewati saringan berdiameter 1 mm. Bila

contoh tidak dapat dihaluskan, maka digiling hingga homogen.

2. Timbang sebanyak 2 gram contoh dan ekstrak lemaknya dengan menggunakan soxhlet

dengan pelarut petrolium eter.

3. Pindahkan contoh yang sudah bebas lemak secara kuantitatif ke dalam erlenmeyer.

Tambahkan 0,5 g asbes yang telah dipijarkan dan 2 tetes zat anti buih.

4. Tambahkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 200 mL larutan H2SO4mendidih.

5. Letakkan erlenmeyer di dalam pendingin balik.

6. Didihkan contoh di dalam erlenmeyer selama 30 menit dengan sesekali digoyang-

goyangkan.

7. Setelah selese saring suspensi dengan kertas saring.

8. Cuci residu yang tertinggal dengan air mendidih. Pencucian dilakukan hingga air cucian

tidak bersifat asam lagi (diuji dengan kertas lakmus).

9. Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam erlenmeyer kembali.

10. Cuci kembali sisa residu di kertas saring dengan 200 mL larutan NaOH mendidih sampai

semua residu masuk ke dalam erlenmeyer.

11. Didihkan kembali contoh selama 30 menit dengan pendingin balik sambil sesekali digoyang-

goyangkan.

12. Saring kembali contoh melalui kertas saring yang diketahui beratnya sambil dicuci dengan

K2SO4 10%.

13. Cuci residu di kertas saring dengan air mendidih kemudian dengan alkohol 95%.

14. Keringkan kertas saring dalam oven 1100C sampai 1-2 jam.

15. Setelah didinginkan dalam desikator, timbang conto

16. Hitung berat residu serat kasar dengan menghitung selisih antara berat contoh dan kertas

saring dengan berat kertas saring.

Perhitungan

Kadar serat kasar (g/100 g contoh) = [(W2-W1)/W]/x100

Dimana:

W2= berat residu kertas saring yang telah dikeringkan (g)

W1 = berat kertas aring

W = berat contoh yang dianalisis.

Analisis ADF (Acid Detergent Fiber)

Dengan mengekstrak contoh dengan lrutan ADF (setiltrimetil amonium bromida dalam

H2SO4 1 N) sehingga seluruh komponen selain komponen ADF larut. Komponen yang tidak larut

disaring, dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan kandungan mineral yang ada dalam

komponen (dengan cara menyabunkannya sehingga yang tinggal hanya mineralnya). Kadar ADF

dinyatakan sebagai selisih antara berat residu kering setelah perlakuan dengan larutan ADF

dengan berat abu dibagi dengan berat awal contoh (dinyatakan dengan persen).

Analisis NDF (Neutral Detergent Fiber)

Dengan mengekstrak contoh dengan larutan NDF (terdiri dari campuran EDTA, Na2B2O710H2O,

laurit sulfat, Na2HPO, dan 2-etoksi-etanol) sehingga seluruh komponen selain komponen NDF

larut. Komponen yang tidak larut disaring, dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan

kandungan mineral yang ada dalam komponen. Sampel yang mengandung pati maka pati akan

dihidrolisis dahulu dengan enzim -amilase (karena pati menyulitkan pada proses penyaringan).

Kadar NDF dinyatakan sebagai selisih antara berat reidu kering setelah perlakuan dengan larutan

NDF dengan berat abu dibagi dengan berat awal contoh (dinyatakan dalam persen).

Analisis Serat Makanan (Dietary Fiber)

Analisis Lignin

Dengan mengekstrak contoh dengan larutan ADF sehingga seluruh komponen selain

selulosa dan lignin larut. Selulosa yang ada dalam residu kemudian dihidrolisis dengan

menggunakan H2SO4 72% sehingga yang tertinggal dalam residu hanya Lignin. Residu disaring,

dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan kandungan mineral yang ada dalam komponen.

Kadar lignin dinyatakan sebagai elisih antara berat residu kering yang mengandung lignin

dengan berat abu dibagi dengan berat awal contoh (dinyatakan dalam persen).

Analisis Substansi PEKTAT

Metode spektrofotometri didasarkan atas reaksi antara O-hidroksidifenil dengan

anhidrogalakturonat menghasilkan warna yang dapat diukur pada panjang gelombang 520 nm.

Substansi pektat dihidrolisis dengan enzim pektinase sehingga asam galakturonat. Metode

gravimetri yaitu dengan pektin yang telah diekstrak dari contoh disoponifikasi dengan alkali dan

diendapkan sebagai kalsium pektat dengan menambahkan kalsium klorida dalam suasana asam.

Endapan kalsium pektat dicuci sampai bebas klorida, kemudian dikeringkan dan ditimbang

beratnya.

REFRENSI :

Yazid, Estien dan Lisda, Nursanti. 2006. Penuntun Praktikum BIOKIMIA untuk Mahasiswa

Analis. Andi Offset : Yogyakarta.

Sudarmaji, B. dkk. 1982. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty : Yogyakarta

Winarno, F.G. 1986. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia : Jakarta

Anonim. 2011. Struktur Bentuk dan Fungsi Karbohidrat. Kumpulan Makalah. http: localhost/D:/download/uji % 20 kuantitatif % 20 karbohidrat. mht, diakses tanggal 23 Oktober 2011.

Septorini, Ragil. 2008. Perbedaan Kadar Glukosa pada Onggok yang Dihidrolisis dengan Asam Klorida, Asam Sulfat, dan Asam Oksalat. Karya Tulis Ilmiah. Semarang: Universitas Muhammadiyah.

Yuanita,Leny., Surodjo Suzana., Agustini Rudiana. 2010. Perangkat Pembelajaran Biokimia Petunjuk Praktikum Karbohidrat, Protein, Lipida (Buku I). Surabaya : UNESA University Press.

Analisa Kualitatif Dan Kuantitatif Karbohidrat Fix

Documents

Transcript of Analisa Kualitatif Dan Kuantitatif Karbohidrat Fix