Tugas Praktikum Laboratorium Patologi Anatomi

Kelompok 1

1. Berapa hari proses pembuatan preparat histopatologi ?

Jawaban:

- Teknik pembuatan preparat histopatologi meliputi beberapa proses,

yaitu :

1) Mendapatkan jaringan

Jaringan yang akan diperiksa merupakan jaringan yang diduga

adalah jaringan tumor atau karena terjadinya kelainan. Jaringan –

jaringan untuk pemeriksaan histologi antara lain :

Jaringan diambil dari pasien yang operasi atau baru meninggal.

Belum terjadi post mortum degeneration ( autolysis dan

putrefaction). Biasanya jaringan sudah harus difiksasi sebelum

(enam) jam setelah kematian, kalau didiamkan dalam jangka

waktu lama bisa terjadi maserasi.

Pemotongan harus menggunakan pisau yang tajam

Potongan jaringan disesuaikan dengan jenis jaringan, biasanya

tidak terlalu besar (1,5 x 1 x 0,5) cm3

Jaringan harus segera dimasukan kedalam larutan fiksasi.

Tidak boleh dicuci dengan air, karena akan terjadi perubahan

tekanan osmotik. Dan jika didiamkan terlalu lama akan terjadi

maserasi

Tidak boleh direndam di dalam NaCL 0,9 % karena akan

terjadi proses maserasi

Tidak boleh dibekukan, karena dengan didinginkan akan terjadi

proses pembentukan kristal es dalam sitoplasma, sehingga bisa

terjadi sobekan sel.

Identifikasi dan dokumentasi jaringan, Jaringan diukur

besarnya, ditimbang beratnya, dan dilakukan deskripsi jaringan

disertai lamelasi pada tumornya.

Memotong jaringan, jaringan dipotong dengan bentuk segi

empat sesuai ukuran 1,5 x 1 x 0,3-0,5 terutama masa tumornya

Dimasukkan ke kaset disertai label nomor pasien sebanyak

maksimal 3 cup, 3 cup 1 blok, 2 cup 1 blok = 2 blok masukan

ke larutan fiksasi.

2) Fiksasi

Fiksasi adalah proses mengawetkan jaringan dengan tujuan agar

jaringan awet dan kondisinya sama dengan keadaan seperti hidup,

larutan yang dipakai untuk mengawetkan jaringan biasanya adalah

formalin buffer 10%. Fiksasi dilakukan dengan cara merendam

kedalam larutan fiksasi, dengan jumlah minimal 20 kali besar

jaringan. Lamanya fiksasi rata-rata 24 jam, tetapi terkadang

lamanya bermacam-macm tergantung pada : zat fiksasi yang

dipakai, besar kecilnya jaringan, jenis jaringan.

3) Dehidrasi

Dehidrasi adalah proses penarikan air secara aktif dalam jaringan

dengan menggunakan zat yang bisa menggeser air dari jaringan.

Air dihilangkan dari jaringan karena pada proses infiltrasi oleh

parafin tidak bisa masuk, karena didalmanya mengandung air.

Dehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol yang dilakukan

dari konsentrasi yang rendah sampai konsentrasi yang tinggi,

sehingga air secara bertahap akan keluar dan juga tidak merusak

jaringan.

4) Clearing

Yang dimaksud dengan clearing adalah suatu proses pergantian

alkohol yang terdapat di dalam jaringan dengan menggunakan zat

yang dapat menghantarkan parafin kedalam jaringan. Jadi sifat zat

yang diapakai sebagai zat clearing agent adalah harus melarutkan

alkohol dan melarutkan parafin. Clearing agent yang biasa diapakai

antara lain Xylene, Benzene, Toluen, Cloroform. Pada proses

clearing, jaringan yang sudah didehidrasi sampai alkohol absolut,

dimasukan ke dalam larutan Xylene.

No Tahapan Zat Waktu

1 Dehidrasi

Alkohol 70% 60 menit

Alkohol 80% 60 menit

Alkohol 96% 60 menit

Etanol 60 menit

2 ClearingXylene I 90 menit

Xylene II 90 menit

3 ImpregnationParafin cair 60 menit

Parafin Cair 150 menit

5) Embedding

Yaitu suatu proses memasukan jaringan ke dalam parafin cair

untuk dibuat suatu blok yang padat. Dalam proses embbeding ini

mencakup tiga proses, yaitu : Impregnation, Blocking dan

Trimming.

Impregnation

Impregnation yaitu proses pergantian larutan Xylene dengan

parafin cair dengan cara memasukan jaringan kedalam parafin

cair I dan parafin cair II selama masing – masing 30 menit

dalam oven 56-60oC.

Blocking

Memasukkan jaringan ke dalam parafin cair yang kemudian

dipadatkan dengan cara menurunkan suhu parafin, lalu dibuat

dalam bentuk cetakan yang besarnya disesuaikan dengan

ukuran pada mikrotom.

Trimming

Jaringan yang sudah dimasukkan ke dalam parafin dan

dipadatkan, siap untuk dipotong, sebelumnya diratakan dengan

menggunakan pisau atau langsung dengan mikrotom, sehingga

pada saat pemotongan didapatkan potongan bentuk jaringan

yang baik.

6) Sectioning/Cutting

Yaitu pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom

dengan ukuran yang sangat tipis (3-5 mikron) sehingga apabila

dilihat dengan menggunakan mikroskop akan tembus cahaya.

7) Pembuatan Preparat

Menempelkan potongan jaringan yang dianggap baik pada objek

glass (preparat). Dalam melakukan penempelan potongan jaringan

pada objek glass, lembaran pita dimasukan ke dalam water bath

suhu 40-50oC sehingga lembaran pita tidak melipat dan diatur

letaknya ¾ dari ujung objekglass dan bila sudah menempel

dikeringkan/diiriskan.

8) Staining

No TAHAPAN ZAT WAKTU KETERANGAN

1Deparafinisasi

Xylol I 2-3 celup Untuk menghilangkan /melarutkan paraffin yang

terdapat pada jaringan2 Xylol II 2-3 celup

3

Rehidrasi

Alkohol 100% 10 celup

Untuk memasukkan air kedalam jaringan. Air akan mengisi

rongga-rongga jaringan yang kosong.

4 Alkohol 90% 10 celup

5 Alkohol 80% 10 celup

6 AIR 1 menit

7Pewarnaan

Hematoxylin 1-5 menitUntuk member warna pada inti dan sitoplasma pada jaringan8 AIR 1 menit

9Differensiasi

HCl0,6% 1-2 celup Untuk mengurangi warna biru pada inti dan menghilangkan warna bitu pada sitoplasma

10 AIR 1 menit

11

Blueing

Lithium Karbonat 0,5% 3 menitUntuk memperjelas warna biru

pada inti sel12 AIR 1 menit

13 Alkohol95% 1-2 celup

14 Pewarnaan Eosin 3 menit Untuk member warna merah pada sitoplasma sel

15 Dehidrasi Alkohol80% 10 celup Untuk menghilangkan air dari jaringan

16 Alkohol90% 10 celup

17 Alkohol100% 10 celup

18 XylolI 2-3 celup

19 XylolII 2-3 celup

20 Mounting Entelan 1-2 tetes Untuk mengawetkan jaringan yang telah diwarnai

Jadi proses pembuatan preparat histopatologi membutuhkan waktu ± 1

hari.

2. Apabila jaringan dikirim pada hari Jumat dibaca pada hari apa?

Jawaban : Jaringan yang diterima pada hari Jumat setelah difiksasi dengan

formalin buffer 10% akan disimpan hingga hari Senin. Baru pada hari

Senin akan diproses menjadi suatu preparat, yang selanjutnya akan dibaca

paling cepat hari Selasa, tergantung dari antrian preparat yang masuk ke

Laboratorium Patologi Anatomi RSHS.

3. Apa guna entelan?

Jawaban : Entellan adalah media mounting water-free untuk melekatkan

preparat secara permanent agar bisa dilihat secara mikroskopis. Entellan

mengandung toluene, digunakan pada preparat water-free yang telah

diproses sebelumnya dengan xylol. Index refraksi entellan sekitar 1492-

1500 pada suhu 20 º C. dapat digunakan pada proses manual maupun

automatis.

Kegunaanya adalah merekatkan cover glass ke objek glass, mengawetkan

preparat dan memberikan warna cerah saat pembacaan dengan mikroskop.

Tugas Praktikum Laboratorium Patologi Anatomi

Kelompok 2

1. Bahan Untuk Sitologi adalah?

Jawaban:

a. Pap Smear

b. FNAB

c. Bilasan/Lavage Bronkhus

d. Cairan Pleura

e. Cairan Ascites

f. Cairan otak/LCS

g. Cairan Sendi

h. Urine sitology

i. Sputum sitology

j. Cairan Fistula

k. Pus/abses

l. Cairan Kista

m. Cairan Pericardial

n. Bucal smear

o. Cairan Abdomen

2. Apa pewarnaan untuk cairan tubuh?

Jawaban: Pada pemeriksaan sitologi yang diperiksa morfologi sel-sel

cairan tubuh. Sediaan atau disebut juga preparat dibuat berupa apusan pada

objek glass yang diwarani dengan pewarnaan tertentu.

1. Sediaan atau preparat dengan pewarnaan metode Giemza

Tujuan : Terutama yang diperiksa adalah detail dari morfologi untuk

memeriksa intisel, untuk melihat apakah sel tersebut sel normal, sel

noeplasma jinak atau ganas.

Sampel : Aspirasi Jarum Halus (AJH), Endapan cairan yang telah

disentrifuge

Bahan :

-Larutan pewarna giemza

-Larutan Phosfat buffer (ph 6,8)

-Methanol

Prosedur kerja :

1)Sediaan apus telah benar-benar kering di udara

2)Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit

3)Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara

4)Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan perbandingan (GZ : Bufer

phosfat = 1:4)

5)Cuci dengan aquadest, kering diudara

6)Tutup EZ Mount

2.Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Papaniculo

Metode ini umumya digunakan untuk pewarnaan Papsmear (tapi terkadang

ada juga pemeriksaan sitologi selain papsmear diwarnai dengan metode

ini).

Papsmear digunakan untuk mendignosis Kanker serviks. Melihat ada

tidaknya sel ganas

Sampel : apusan daerah peralihan endoserviks.

Bahan:

-Haematoksilin mayer

-EA (Eosin alkohol) 65/EA 36

- Alkohol 95% dan Alkohol absolut

Untuk EA 65 isinya: Eosine Y, Phospotung stic acid, light green, alkohol

absolute.

Prosedur Kerja :

1)Sedian apusan difiksasi dengan alcohol 95% 15 menit

2)Air mengalir sampai bebas alkohol 5 menit

(rak preparat diletakan di wadah yang di beri air mengalir)

3)Mayer haematoksilin 3-5 menit

4)Air Mengalir 15 menit

5)–Alkohol 95% 10 kali celup

-Alkohol 95% 10 kali celup

6) EA 3-5 menit

7)–Alkohol 95% 5 kali celup

-Alkoho 95% 5 kali celup

- Alkohol absolute 5 kali celup

8)Keringkan diudara

9)Xylol/clearing

10)Tutup dengan EZ mount

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan sitologi dan

fiksasinya:

1.Objek glass harus benar-benar bersih, terus beri nomor sesuai data biar

tidak tertukar,

2.¾ luas kaca objek memanjang, kita apus merata,tidak terlalu tebal dan

terlalu tipis

3.Segera fiksasi sesuai dengan pewarnaan yang akan digunakan

4.Untuk cairan, disentrifuge dahulu dan kemudian diambil untuk diproses

5.Untuk bahan sputum diambil bagian berwarna dan kental untuk dibuat

pulasan. Bagian yang lain bisa gunakan sebagai sel blog.

2. Apa pewarnaan untuk papsmear?

Jawaban : Papanicolau

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada pembuatan sediaan/preparat

papsmear:

A. Pengambilan sampel harus mendapat sel-sel endoserviks sel-

sel metaplasia dan sel-sel skuamosa (karena daerah peralihan),

harus sedikit mungkin mengandung darah.

B. Sediaan harus segera difiksasi dengan alkohol 95%. Pada

reparat yang kering dan belum difiksasi akan menyebabkan

sel-sel rusak. Apabila tempat pengecatan jauh,setelah difiksasi

keringkan dan masukkan kewadah yang dapat menjaga

keamanan sediaan.

C. Jika menggunakan airspray tidak boleh terlalu dekat, karena

akan menghapus atau tidak terfiksasi dengan baik.

a. Kesalahan pada kriteria yang diatas bisa menyebabkan

negatif palsu.

b. Kesalahan pada pewarnaan dan screening dapat

menyebabkan positif palsu.

Tugas Praktikum Laboratorium Patologi Anatomi

Kelompok 3

1. Apakah prinsip Imunohistokimia ?

Jawaban : Prinsip Imunohistokimia adalah reaksi antigen-antibodi atau dikenal

sebagai reaksi serologi. Imunnohistokimia merupakan salah satu metode

pemeriksaan kanker yang diakui sebagai golden standar karena reaksi antigen-

antibodi merupakan reaksi yang sangat spesifik dan berungsi sebagai

diagnostik berbagai penyakit.

2. Zat apa yang dapat di deteksi untuk pemeriksaan Imunihistokimia ?

Zat yang dapat dideteksi pada pemeriksaan imunohistokimia adalah antigen.

Hal ini dapat dilakukan dengan memasukkan antibodi yang spesifik terhadap

antigen tersebut pada preparat jaringan, apabila ada reaksi (menimbulkan

warna) berarti terdapat antigen, bila tidak bereaksi (tidak ada perubahan warna)

berarti tidak terdapat antigen. Antibodi sekunder yang terikat pada enzim atau

zat flluoresense akan mengakibatkan perubahan warna yang dapat terlihat

dibawah mikroskop.

3. Berapa lama proses pewarnaan Imunohistokimia baik secara manual

maupun automatis ?

Jawaban : Pewarnaan Imunohistokimia berlangsung sebagai berikut :

1. Blok parafin dipotong setebal sekitar 4-6 mikron

2. Sediaan dipanaskan diatas slide warmer selama 60 menit dengan suhu 60

derajat.

3. Sediaan dideparafinisasi dengan

a. Xylol 1 selama 5 menit

b. Xylol 2 selama 5 menit

c. Alkohol absolut selama 5 menit

d. Alkohol 95% selama 5 menit

e. Alkohol 80% selama 5 menit

f. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 3 menit

4. Dilanjutkan Blocking peroxidase endogen (0,5% H202 dalam methanol)

selama 30 menit.

5. Dilanjutkan dengan pencucian air mengalir selama 3 menit.

6. Kemudian sediaan dimasukan dalam antigen retrieval solution dan

dipanaskan dengan microwave menggunakan target retrieval solution

(TRS) :

a. Pemanasan pertama, power level tinggi 6 -9 selama 5 menit

(hampir mendidih)

b. Pemanasan kedua, power level rendah 1 selama 5 menit (hampir

mendidih)

c. Kemudian didinginkan selama sekitar 45 menit dalam TRS.

7. Dilakukan pencucian sediaan dengan Phosphat buffer salin (PBS) dengan

pH 7,4 sebanyak 2 kali, masing-masing selama 3 menit.

8. Lingkari dengan PAP PEN

9. Dilakukan blocking aktivitas non spesifik dengan serum normal selama 20

menit.

10. Dilakukan inkubasi antibodi primer vimentin (mouse) dalam serum normal

semalam dalam suhu ruangan, kemudian di cuci dengan PBS pH 7,4

sebanyak dua kali, masing-masing selama 3 menit.

11. Selanjutnya antibodi biotinilated rabbit anti mouse (BRAM) sekunder di

inkubasi dalam serum normal selama 30 menit dan dilakukan pencucian

dengan PBS pH 7,4 sebanyak dua kali, masing-masing 3 menit.

12. Setelah itu dilakukan inkubasi streptavidin dalam serum normal dengan

pengenceran 1 : 1000 selama 60 menit.

13. Pada langkah selanjutnya dilakukan pencucian dengan PBS pH 7,4

sebanyak dua kali, selama 3 menit Dengan Chromogen diamino benzidine

(DAB) selama sekitar 10 menit (50 mL trisHCl 330 uL DAB + 50 uL

H2O2 30%)

14. Setelah itu dilakukan pencucian dengan PBS pH 7,4 kemudian dengan air

mengalir

15. Counter stain dilakukan dengan hematoxylin liliemayer pada air jernih,

kemudian dicelupkan kelarutan karbonat dua kali celupan.

16. Sediaan dicuci dengan air mengalir, dilakukan dehidrasi dengan alkohol

bertingkat (alkohol 95% selama 5 menit, alkohol absolut selama 5 menit).

17. Xylol II selama 5 menit dan terakhir dengan ditutup dengan entelan

18. Terhadap hasil pemeriksaan ini imunohistokimia vimentine dilakukan uji

diagnostik untuk mendapatkan sensitivitas dan spesifitasnya.

Jadi seluruh proses imunohistokimia berlangsung dengan manual dibutuhkan

waktu 7 jam sedangkan dengan automati selama 2 jam