1. Aliran Glukosa pada insulin-dependent

Langkah utama fisiologis insulin adalah untuk menginstruksikan jaringan dalam asimilasi makanan makronutrient dan mengaktifkan jalur anabolik yang mendukung pertumbuhan dan perbaikan jaringan saat makan. Tindakan insulin pada jaringan tertentu bervariasi tergantung peran jaringan asimilasi nutrisi saat makan, serta peran jaringan dalam distribusi nutrisi dalam keadaan berpuasa. Keadaan berpuasa didefinisikan sebagai periode waktu ketika saluran usus tidak lagi menjadi sumber signifikan dari nutrisi. Dalam keadaan makan, nutrisi sedang dicerna, diserap dan dikirim ke tubuh dari saluran usus. Dalam keadaan berpuasa, asam lemak dan gliserol dilepaskan dari jaringan adiposa, asam amino dari otot rangka dan glukosa dari hati. Oleh karena itu hati, jaringan adiposa dan otot rangka, masing-masing memainkan peran yang sangat penting dalam asimilasi nutrisi eksogen setelah makan, dan redistribusi nutrisi endogen selama puasa.

Sementara insulin mengatur asimilasi dan distribusi semua nutrisi, langkah insulin umumnya diukur melalui perubahan homeostasis glukosa. Insulin juga mengatur penyerapan asam amino, sintesis protein, penyerapan asam lemak, sintesis asam lemak dan sintesis kolesterol melalui tindakan langsung pada jalur yang mengatur proses ini. Penilaian sensitivitas insulin hanya diprediksi melalui perbandingan glukosa darah dan kadar insulin darah [1]; resistensi insulin disimpulkan dari observasi kadar glukosa plasma meningkat setelah puasa malam. Tingkat insulin pada keadaan berpuasa mencerminkan respon sel-Beta untuk produksi glukosa hepatik. Kadar insulin plasma pada saat berpuasa akan memberikan umpan balik untuk mengatur produksi glukosa hepatik [2]. Dengan demikian, pembuangan glukosa makanan setelah makan dan pengaturan produksi glukosa hepatik selama puasa sangat penting dalam pengobatan dan pencegahan resistensi insulin dan diabetes tipe 2.

Setelah mengkonsumsi makanan, glukosa makanan diambil ke organ-organ perifer yang difasilitasi melalui transportasi proses-proses yang dimediasi oleh transporter glukosa jaringan spesifik. Misalnya, hati tikus memakan sekitar 7% dari glukosa setelah makan, dan ini adalah sebagian besar ditransport dengan afinitas rendahtransporter glukosa GLUT2. GLUT2 mampu mengangkut glukosa dengan konsentrasi yang besar yang ditemukan dalam sirkulasi Portal setelah makan [3-5]. Jaringan adiposa mengambil 7%, sedangkan otot rangka mengambil 69% [3]. Jantung, yang menyumbang hanya 1,2% dari pembuangan glukosa makanan, juga memanfaatkan proses transportasi glukosa tergantung insulin [3].

Berbeda dengan transportasi glukosa GLUT2 di hati, adiposa dan otot rangka memiliki sistem transportasi glukosa tergantung insulin yang bertanggung jawab untuk pembuangan glukosa postprandial dalam jaringan tersebut. Diketahui bahwa pengobatan insulin dari adiposit tikus isolasi meningkatkan Vmax untuk transportasi glukosa oleh sekitar 10 kali lipat sedangkan Km tidak berubah [6], menunjukkan bahwa transportasi glukosa ditingkatkan itu karena pelepasan inhibitor dari transporter sendiri atau meningkat dalam jumlah transporter pada permukaan sel. Mekanisme kedua transportasi glukosa tergantung insulin pertama didukung oleh penelitian menggunakan adiposit terisolasi [7, 8]. Kedua laboratorium independen menetapkan bahwa insulin memberikan sinyal untuk pelepasan (atau

translokasi) transporter glukosa dari membran kompartemen intraseluler ke permukaan sel tanpa mengubah afinitas transporter untuk mengikat glukosa [7, 8]. Mekanisme untuk penyerapan glukosa tergantung insulin masih dapat berdiri.

Delapan tahun setelah hipotesis translokasi untuk penyerapan glukosa tergantung insulin diusulkan, protein transpor glukosa diduga dari adiposit tikus diidentifikasi dan terbukti mentranslokasi dari intraseluler ke permukaan sel sebagai respon terhadap insulin [9]. Dalam setahun, cDNA encoding protein ini secara independen dikloning oleh tiga laboratorium [10-12], dan kemudian disebut sebagai GLUT4, anggota keempat dari superfamili transporter glukosa fasilitatif. Identifikasi dan kloning GLUT4 merupakan langkah penting dalam mengkonfirmasikan hipotesis translokasi ditetapkan hampir satu dekade sebelumnya.

Baru-baru ini, transporter glukosa insulin lain, GLUT12, telah diidentifikasi dan ditunjukkan untuk meningkatkan sensitivitas insulin dalam model berlebih [13, 14]. Seperti GLUT4, GLUT12 juga translocates ke permukaan sel miosit dalam menanggapi insulin [15]. Tidak jelas apakah GLUT4 dan GLUT12 memiliki fungsi yang tumpang tindih; Namun, tidak mungkin, mengingat fakta bahwa GLUT4 membuat tikus tak berdaya yang memiliki fenotipe metabolik yang tidak dikompensasi karena kehadiran GLUT12 endogen [16]. Ini masih harus ditentukan apa kontribusi GLUT12 membuat clearance insulin-mediated glukosa.

2. Pengangkutan vesicle GLUT4

Sejak identifikasi dan kloning GLUT4, upaya substansial telah dilakukan untuk memahami translokasi GLUT4 dan mendefinisikan sifat vesikel GLUT4 intraseluler. Vesikel GLUT4 yang merespon insulin biokimia berbeda dari populasi GLUT4 vesikel yang mendistribusikan ke membran plasma di bawah rangsangan lain seperti GTP S [17] atau latihan [18, 19]. Vesikel GLUT4 pertamaγ kali diidentifikasi sebagai bagian dari kompartemen endsomal oleh immunolocalization dan colocalization dengan marker endosomal seperti reseptor transferin [20-23].

Dalam adiposit, penyimpanan GLUT4 (atau retensi) kompartemen dibentuk awal dalam diferensiasi, bahkan sebelum GLUT4 disintesis ke tingkat yang signifikan [24]. Baru-baru ini GLUT4 dapat ditargetkan langsung ke membran plasma, dimana ia memperoleh masuk ke endosome [25]. Selain itu, sintesis baru GLUT4 dapat mengisi kompartemen penyimpanan GLUT4 dari jaringan transgolgi (TGN) tanpa terlebih dahulu mencapai membran plasma [26]. Insulin responsif dari bentuk GLUT4 vesikel sebagai kompartemen postendocytic khusus yang terpisah dari daur ulang endosome [23, 27-29]. Setelah rangsangan insulin, diinternalisasi GLUT4 diurutkan dari endo beberapa untuk sub-kompartemen khusus dari TGN ke vesikel penyimpanan GLUT4 (GSVs) untuk retensi [30]. GLUT4 Storage Vesikel (GSVs) kecil, sekitar 50nm diameter, dan mengandung beberapa protein selain GLUT4 [31]. Insulin-responsif aminopeptidase (IRAP), GLUT4, dan v-snare, Vamp2, adalah komponen utama dari insulin responsif khusus GSVs [32]. Kurangnya reseptor transferin (TFR) dan komponen endocytic daur ulang lainnya telah membentuk sifat spesifik GSVs sebagai kompartemen postendocytic khusus yang memiliki respon

insulin tinggi dari endosomes daur ulang reguler dan juga dapat berisi GLUT4 [32].

Studi kinetik menunjukkan bahwa tingkat GLUT4 eksositosis dipercepat dengan pengobatan insulin [29, 33-36]. Peningkatan eksositosis dapat terjadi akibat peningkatan pembelahan dari vesikel GLUT4 dari prekursor endosomal, stimulasi laju pergerakan vesikel pada membran plasma, peningkatan aktivasi pengaitan dan / atau mesin fusi pada membran plasma, atau kombinasi dari dua atau lebih dari proses ini. Sementara banyak langkah dalam jadwal GLUT4 telah dihipotesiskan untuk menjadi insulin dependent, tidak ada proses atau mekanisme molekuler mereka telah tegas diidentifikasi sebagai sasaran sinyal insulin. Pemikiran terkini di lapangan telah menunjukkan bahwa insulin dapat mengatur baik pengaitan vesikel GLUT4 dengan membran plasma, mesin fusi seperti jerat, atau pengangkutan GLUT4 ke membran sel permukaan / plasma [26, 31, 37, 38]

Hipotesis translokasi menunjukkan bahwa stimulasi insulin akan meningkatkan pengangkutan GSVs ke permukaan sel. Studi mencoba untuk menghubungkan cascade sinyal insulin untuk langkah-langkah pengangkutan tertentu yang telah difokuskan pada peran sitoskeleton atau pelepasan dari menambatkan molekul [39, 40]. Namun, pengamatan yang GSVs yang sangat mobile dalam ketiadaan insulin dan pengaitan yang / fusi mungkin langkah-langkah diatur penting, membuatnya tidak mungkin bahwa perubahan insulin dependent dalam gerakan vesikel membatasi untuk redistribusi insulin-dependent GLUT4 ke permukaan sel [41-44]. Perubahan penting yang mesti dipahami, bahwa langkah pengaitan dan penggabungan mungkin merupakan kunci dari sinyal insulin untuk memahami interaksi yang terbatas antara jalur sinyal insulin dan GLUT4 translokasi.

3. Sinyal insulin kepada GLUT4

Sinyal insulin yang diinisiasi oleh peptida hormon insulin berikatan dengan reseptor insulin 2- 2 heterotetrameric yang terletak pada permukaanα β sel (untuk review lihat [45]). Reseptor insulin diaktifkan tyrosines terfosforilasi dengan lengkap dapat bertindak sebagai situs pengaitan untuk protein substrat reseptor insulin (IRS 1/2) [46]. Protein adaptor ini mengakui residu tirosin terfosforilasi pada reseptor mengarah ke hubungan yang stabil antara reseptor dan protein IRS. Asosiasi stabil menyebabkan protein IRS tirosin terfosforilasi oleh reseptor insulin - subunit [47]. Pentingnya isoform redistribusi IRS2β insulin dimediasi GLUT4 telah ditunjukkan oleh ketidakberdayaan spesifik pada tikus, yang mengembangkan resistensi insulin yang parah [48]

HAL 6

Regulasi ekspresi gen GLUT4 dalam kisaran yang sangat sempit (2 sampai 3 kali lipat) memiliki pengaruh yang signifikan terhadap homeostasis glukosa tubuh secara keseluruhan, menunjukkan bahwa semacam kontrol statis tenaga listrik dari tingkat GLUT4 merupakan adaptasi penting untuk keadaan fisiologis ekstrim atau adaptasi kronis keadaan patologis, seperti obesitas. Karena gen ini berada di bawah kontrol metabolik yang kompleks, dasar molekuler untuk

regulasi ekspresi gen GLUT4 di keadaan fisiologis ekstrim telah sangat sulit untuk ditentukan. Sebagai contoh, keadaan kekurangan insulin diperumit oleh peningkatan hormon kontra-regulasi. Konsisten dengan peningkatan kadar hormon kontra-regulasi, peningkatan cAMP seluler intra telah terbukti menurunkan ekspresi gen GLUT4 [118, 124] Selain itu, kekurangan insulin erat digabungkan untuk kadar glukosa plasma, pemanfaatan glukosa intraseluler, dan lipid intraseluler akumulasi. Masing-masing faktor dapat memainkan peran dalam sinyal inti untuk memodifikasi tingkat ekspresi gen GLUT4. Sampai kita telah menguraikan mekanisme molekuler yang mengatur aktivitas promotor GLUT4, kita tidak bisa memahami bagaimana sinyal metabolik dengan nukleus ditransmisikan.

6. Identifikasi promotor regulatory element

Untuk memahami bagaimana lingkungan mempengaruhi metabolisme transkripsi gen GLUT4, pertama-tama perlu untuk mengidentifikasi unsur-unsur molekul (urutan cis-DNA dan faktor trans-acting) yang mengatur gen. Secara tradisional, studi promotor dilakukan dalam sistem kultur sel Model, karena kemudahan transfeksi dan manipulasi eksperimental. Strategi umum dari studi ini adalah untuk mengkloning segmen tertentu dari promotor diberikan gen reporter mudah diukur, diikuti oleh transfeksi menjadi garis sel yang sesuai. Tingkat wartawan mRNA atau protein yang kemudian digunakan sebagai pengukuran tidak langsung dari aktivitas transkripsi dari promotor fragmen yang diteliti. Pendekatan ini tidak bekerja untuk menganalisis promotor GLUT4. Tak lama setelah kloning dan identifikasi gen GLUT4 manusia dan tikus, beberapa laboratorium mulai menganalisis promotor gen GLUT4. Model kultur jaringan yang terbatas karena fakta bahwa ekspresi gen GLUT4 adalah penghitungan developmen- diatur, dan hanya dapat dipelajari di dibedakan Myotubes berbudaya dan adiposit [125-127]. Awal bekerja menggunakan myoblasts C2C12 dibedakan mengidentifikasi miosit Enhancer Factor 2 (MEF2) domain yang mengikat otentik yang akan diperlukan untuk bergantung diferensiasi-ekspresi gen [128, 129]. Dalam kultur adiposit, ekspresi gen differentiation-dependent pada pengikatan domain MEF2, dan situs DNA-binding kedua ditemukan beberapa ratus pasang basa MEF2 domain [130]. Penempatan pengikatan kedua, yang dikenal sebagai Domain 1, mengikat berbagai faktor transkripsi [130, 131]. Ekspresi gen GLUT4 tergantung diferensiasi tidak diatur sendiri oleh pengikatan trans- faktor mengaktifkan penempatan DNA-binding yag sama. Sebaliknya, ekspresi gen GLUT4 diferensiasi-dependent adalah yang diatur oleh pelepasan kelas II deactyleases histon (HDAC) mengikat bahwa untuk faktor transactivating [132, 133]. KelasII HDAC yang melimpah di dalam inti preadipocytes dibedakan [133]. Sebagai sel mengalami diferensiasi, kelas II HDAC mendistribusikan ke sitoplasma, sehingga GLUT4 mRNA untuk melanjutkan sintesis.

7. Analisis GLUT4 promotor In Vivo pada manusia

Sistem kultur jaringan dalam analisis promotor transkripsi yang tak terbantahkan. Namun, informasi tambahan dapat diperoleh dengan menganalisis

aktivitas promotor pada hewan transgenik. Dalam kasus GLUT4, kami telah mengamati pola kompleks ekspresi gen di berbagai keadaan fisiologis, yang tidak mungkin untuk mewakili dalam model kultur jaringan. Juga, analisis transkripsi pada tikus transgenik memungkinkan kita untuk mengukur efek dari elemen promotor spesifik di berbagai jaringan di bawah pengaruh berbagai faktor hormonal, nutrisi, dan metabolisme.

Untuk saat ini, kami telah menganalisis 12 konstruksi transgenik untuk jaringan tertentu dan gen GLUT4 tergantung hormonal peraturan bersama (Gambar 1). Garis transgenik pertama direkayasa untuk mengekspresikan GLUT4 minigene manusia terdiri dari seluruh coding wilayah gen ditambah 5,3 kb dari 5 sisi DNA [107]. Ekspresi ini menunjukkan bahwa gen manusia bisa berfungsi pada tikus. Hal ini memungkinkan kita untuk menghasilkan garis tikus transgenik yang membawa DNA di mana kloramfenikol acetyltrans- ferase (CAT) gen reporter diungkapkan di bawah kontrol 2,4 kb DNA GLUT4 manusia terletak di 5 'sisi pada awal transkripsi [134].

Penghapusan di ujung 5 'dari promotor GLUT4 manusia memungkinkan kita untuk memetakan elemen promotor penting untuk pertama 895 bp dari tempat transkripsi inisiasi tion utama (Gambar 1 dan [135]). Perbandingan urutan manusia, mouse, dan gen GLUT4 tikus promotor mengungkapkan bagian yang sangat dilestarikan mengandung lebih dari 90% identitas urutan [136]. Daerah dilestarikan paling distal tidak memiliki tempat mengikat untuk setiap faktor transkripsi dikenal. Kami sebut daerah ini sebagai Domain I. Proximal daerah ini mempunyai tempat pengikatan sangat cocok untuk faktor transkripsi MEF2A / D yang kita sebut tempat ini sebagai domain MEF2. Daerah proksimal juga berisi LXRE 12 bp domain MEF2. Konservasi pada area ini menyatakan bahwa tempat fungsional ini penting untuk regulasi transkripsi gen GLUT4. Penghapusan urutan buruk (kurang dari 85%) antara domain ini tidak berpengaruh pada aktivitas transkripsi (Gambar 1, membangun 1 dan 2). penghapusan 5’ pada kedua domain (Gambar 1, membangun 7) meninggalkan promotor basal yang diekspresikan pada tingkat yang sangat rendah di semua jaringan, termasuk mereka yang tidak biasanya mengungkapkan GLUT4 [137]. Juga, penghapusan 5’ melalui Domain 1 (Gambar 1, membangun 5) mengakibatkan ekspresi di mana-mana, namun dengan tingkat yang sedikit lebih tinggi dari ekspresi di otot rangka. Penting lagi, membangun 5 tidak mendukung ekspresi diatur mRNA transgenik dalam kondisi kekurangan STZ, di otot rangka atau jaringan lain. Dengan demikian, dengan kriteria kami, domain MEF2 bukan merupakan promotor yang berfungsi penuh.