PCR
3
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20 – 30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: 1.Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94 – 96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1 – 2 menit. 2.Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45 – 60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1 – 2 menit. 3.Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang paling umum digunakan oleh para peneliti bidang Biologi molekuler dan Genetika. Prinsip umum kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim. Sejak ditemukan pertama kali mesin P CR (nama lainnya Thermal Cycler) oleh Karry Mullis pada tahun 1984, kini hampir semua kegiatan di bidang biologi molekuler, genetika, kedokteran hingg a forensik tidak lepas dari PCR. Wajar jika The Royal Swedish Academ y of Sciences mengganjar Mullis dengan Hadiah nobel pada tahun 1993. Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Untuk mendapat potongan DNA, diperlukan Primer yang berfungsi untuk menandai dimana ujung DNA yang akan digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu Primer forward untuk menandai ujung depan untai DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari ujung belakang. Karena DNA
Transcript of PCR
5/13/2018 PCR - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/pcr5571ff6f49795991699d3ae8 1/3
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa
Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA
secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.
Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994
berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekularkarena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20 – 30 kali siklus. Setiap siklus
terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:
1.Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94 – 96 °C)
ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap
awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA
terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer.
Durasi tahap ini 1 – 2 menit.
2.Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer
urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45 – 60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang
tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat.
Durasi tahap ini 1 – 2 menit.
3.Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P
pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C.
Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa
berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang
panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena
penambahan terjadi secara eksponensial.
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang paling umum digunakan oleh para peneliti
bidang Biologi molekuler dan Genetika. Prinsip umum kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA
tertentu dengan bantuan enzim. Sejak ditemukan pertama kali mesin PCR (nama lainnya Thermal Cycler)
oleh Karry Mullis pada tahun 1984, kini hampir semua kegiatan di bidang biologi molekuler, genetika,
kedokteran hingga forensik tidak lepas dari PCR. Wajar jika The Royal Swedish Academy of Sciencesmengganjar Mullis dengan Hadiah nobel pada tahun 1993.
Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA, baik
yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria (mtDNA) atau
Ribosom (rDNA). Untuk mendapat potongan DNA, diperlukan Primer yang berfungsi untuk menandai
dimana ujung DNA yang akan digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu Primer forward untuk
menandai ujung depan untai DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari ujung belakang. Karena DNA
5/13/2018 PCR - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/pcr5571ff6f49795991699d3ae8 2/3
terdiri dari 2 untai pilinan ganda (double strand), maka DNA Primer forward bekerja pada strand yang
satu sementara Primer Reverse bekerja pada untai pilinan yang satunya.
Untuk melakukan penggandaan, dibutuhkan bahan baku DNA buatan, namanya dNTP. Masih
ingat 4 jenis ribosa DNA kan? yups .... Adenine, Guanine, Cytosin dan Thymine. Nah... untuk PCR
diperlukan dNTPa untuk Adenine, dNTPg, dNTPc dan dNTPt untuk masing-masing gula ribosa.Biasanya campuran dNTP-dNTP ini dalam istilah bahasa Inggris cukup disingkat dNTP's.
Untuk merakit untai DNA buatan dari dNTPs ini, dibutuhkan bantuan enzyme Taq polymerase.
Enzyme ini bekerja optimal pada suhu tinggi hingga 100 derajat celcius. Taq polymerase dipanen dari
sebuah bakteri bernama Thermus aquaticus yang ditemukan di sumber air panas, makanya hasil enzyme
nya tahan panas dan tidak rusak pada suhu air mendidih.
Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu Denaturing, Annealing dan Extension.
Denaturing adalah proses memisahkan 2 untai pilinan DNA. Pada tahap ini, ikatan hidrogen yang
menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing-masing akan menjadi untai tunggal. Biasanya
suhu Denaturing berkisar antara 92-94 derajat celcius.
Annealing adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari pasangannya di untai-untai DNA.
Jika pas..... maka dia akan melekat. Suhu Annealing biasanya berkisar antara 40-55 derajat Celcius. Suhu
yang biasanya umum dipakai adalah 50-52 derajat C.
Setelah itu, mesin PCR akan kembali memanaskan 'sup DNA' lagi ke suhu 72 derajat celcius agar Taq
polymerase bekerja menggandakan potongan DNA. Pertama ia, maksudnya si Taq, membaca primer
seperti layaknya pesawat terbang lari di landasan pacu sebelum take off.
Komponen PCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yangdibutuhkan adalah:
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus
membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR
mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya
mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan
teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan
DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam
sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum
dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
Ion Logam
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion
ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
5/13/2018 PCR - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/pcr5571ff6f49795991699d3ae8 3/3
Ion logam monovalen, kalsium (K+).
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda
akan memisah menjadi utas tunggal.Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk
memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen
dengan sekuen primer.
Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-
72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika
basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T,
dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung.
Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya
adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Aplikasi teknik PCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada
tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
Isolasi Gen
DNA Sequencing
Forensik
Diagnosa Penyakit
