Aplikasi PCR Konvensional Dengan RT-PCR Untuk Deteksi White Spot Syndrom Virus Pada...

Jurnal Perikanan dan Kelautan Vol. 3, No. 4, Desember 2012: 61-74ISSN : 2088-3137

APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIMEPCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS PADA KEPITING

Rina Novita Pranawaty*, Ibnu Dwi Buwono** dan Evi Liviawaty**

*) Alumni Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unpad**) Staf Dosen Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unpad

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi White Spot Syndrome Virusyang terbaik pada kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi udang windu denganmenggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR. Penelitian ini menggunakan metodesurvei dengan analisis deskriptif kualitatif. Sampel kepiting diperoleh dari tambak udangwindu di Kecamatan Pasekan dan Karangsong, Kabupaten Indramayu. Isolasi DNAmenggunakan Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega), yang dilanjutkan denganamplifikasi dan elektroforesis (PCR konvensional) serta kuantifikasi amplifikasi tanpaelektroforesis (real time PCR). Hasil penelitian menunjukkan 12 sampel positif WSSVterdeteksi dengan real time PCR, dibandingkan dengan PCR konvensional yang hanyamendeteksi 7 sampel positif WSSV dari total 14 sampel uji. Hal ini membuktikan Real TimePCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinisdibandingkan dengan PCR konvensional.

Kata kunci : Kepiting, PCR Konvensional, Real Time PCR, WSSV

ABSTRACT

APPLICATION OF CONVENTIONAL POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)AND REAL TIME PCR FOR DETECTION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN CRAB

This study aimed to find the best White Spot Syndrome Virus detection methods incrabs as a carrier of WSSV that infect shrimps using conventional PCR and Real Time PCR.This study used survey methods with qualitative descriptive analysis. Crab samples wereobtained from shrimp ponds at subdistrict of Pasekan and Karangsong, Indramayu regency.DNA isolation using Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega), followed byamplification and electrophoresis (conventional PCR) and method of amplification andquantification without electrophoresis (real time PCR). The results were 12 positive sampleswith WSSV detected with real time PCR method compared to conventional PCR whichdetected only 7 positive samples of WSSV from 14 test samples. This proves real time PCRwas better to detect the presence of WSSV in crabs without clinical symptoms compared toconventional PCR.

Key words : Conventional PCR, Crab, Real Time PCR, WSSV

62 Rina Novita Pranawaty, Ibnu Dwi Buwono dan Evi Liviawaty

PENDAHULUANSelama satu dasawarsa terakhir,

produksi budidaya udang windu secaranasional mengalami penurunan menjadi70 ribu ton per tahun. Penurunan produksiudang windu dalam kurun sepuluh tahunterakhir disebabkan oleh seranganpenyakit pada udang terutama oleh WhiteSpot Syndrome Virus (WSSV) (Burhaidin2010 dalam Sahana 2010).

Serangan virus white spot dapatmenyebabkan udang menjadi lemah dangejala klinis yang nampak antara lain ususkosong, tubuh pucat, dan kemerah-merahan serta muncul bercak putihdengan diameter 0,5-2 mm pada bagiancephalotorax sampai menyebar keseluruhtubuh. Virus ini biasanya menyerangudang windu pada tahap pembesaranyaitu pada umur 1-2 bulan dan virus dapatmenyebar ke seluruh udang yang terdapatdalam tambak hanya dalam waktu 2hingga 7 hari dan dapat menyebabkankematian 70% hingga 100% (Tompo dkk2002 dalam Octaviana 2005).

Penularan atau penyebaranpenyakit WSSV dapat disebabkan olehadanya organisme carrier, yaitu organismepembawa penyakit yang dapatmenularkan penyakit pada organismelainnya, tetapi organisme carrier tersebuttidak menunjukkan gejala klinispenyakitnya. Penularan penyakit secarahorizontal pada udang windu melaluiorganisme carrier seperti rebon, udangputih, kepiting dan udang windu itu sendiri(Sumawidjadja 2001 dalam Apriliza 2010).

Diagnosa suatu penyakit dapatdilakukan dengan beberapa cara, antaralain dengan isolasi agent penyebabpenyakit tersebut dan analisamorfologinya, deteksi antibodi yangdihasilkan dari infeksi dengan teknikenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), dan deteksi gen dari agentpembawa penyakit tersebut denganPolymerase Chain Reaction (PCR)(Aprijani dan Elfaizi 2004).

Salah satu teknik yang banyakdiaplikasikan dan telah berkembang saatini adalah PCR (Polymerase ChainReaction) menggunakan alat ThermalCycler PCR yang mampu mengamplifikasifragmen DNA secara in vitro. Dalamperkembangannya, telah dikembangkanteknik Realtime PCR yang mampumengevaluasi dan melakukan kuantifikasi

secara langsung. Teknik ini dilakukandengan mengintegrasikan teknik PCRdengan komputer dan perangkat lunak.

Hasil amplifikasi DNA dengan PCRkonvensional, pengamatan keberadaanDNA dilakukan pada akhir reaksi denganmenggunakan gel agarose setelahdilakukan proses elektroforesis.Sedangkan analisa menggunakan RealTime PCR memungkinkan untukdilakukan pengamatan pada saat reaksiberlangsung, keberadaan DNA hasilamplifikasi dapat diamati pada grafik yangmuncul sebagai hasil akumulasifluoresensi dari probe (penanda). PadaReal Time PCR pengamatan hasil tidaklagi membutuhkan tahap elektroforesis,sehingga tidak lagi dibutuhkan gelagarose dan penggunaan EthidiumBromide (EtBr) yang merupakansenyawa karsinogenik (Fatimi 2010).

Tujuan dari penelitian ini adalahuntuk mencari metode deteksi White SpotSyndrome Virus yang terbaik padakepiting sebagai carrier WSSV yangmenginfeksi udang windu denganmenggunakan PCR Konvensional danReal Time PCR.

BAHAN DAN METODE PENELITIANPengambilan Sampel

Sampel yang digunakan yaitukepiting yang diperoleh dari tambak udangwindu yang berasal dari Pasekan danKarangsong, Kabupaten Indramayu.Jumlah sampel yang diambil sebanyak 14ekor kepiting.

Isolasi DNA KepitingSampel kepiting yang akan

diisolasi adalah bagian insang. DNAsampel diisolasi dengan menggunakan KitWizard Genomic DNA Purification(Promega) (2010).

Insang kepiting dipotong dandiambil sebanyak 20 mg, kemudiandimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 ml.Sampel digerus sampai lembut dengansumpit plastik steril yang dilakukan diataspermukaan es curai. Ditambahkan 120 LEDTA 0,5 M (pH 8,0) dan 500 L NucleiLysis Solution, kemudian digerus kembalidi atas es dan ditambah 17,5 LProteinase K. Diinkubasi didalamwaterbath pada suhu 650C selama 1 jam.

63Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Konvensional dan Real Time PCR

Ditambah 3 l RNase Solution, kemudiandicampur dengan diflick. Diinkubasikembali didalam waterbath pada suhu370C selama 30 menit. Dinginkan selama5 menit pada suhu ruang. Ditambahkan200 l Protein Precipitation Solution,divortex selama 20 detik dan didinginkandiatas es selama 5 menit. Disentrifugasipada 13000 rpm selama 4 menit. Hasildari sentrifugasi diperoleh dua lapisan,lapisan paling atas adalah supernatantyang mengandung DNA dan lapisankedua berupa endapan protein.Supernatant yang mengandung DNAdipindahkan ke dalam mikrotube baruyang sebelumnya telah dimasukkan 600 lIsopropanol. Larutan dicampur dengancara membolak-balikan tube.Disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10menit. Hasil dari sentrifugasi akanterbentuk supernatant dan endapanberwarna putih (pellet). Supernatantdibuang dengan hati-hati agar endapanpeletnya tidak terbuang, kemudian pelletdikeringkan dengan tissue. Ditambahkan600 l Ethanol 70% dan bolak-balikkantube beberapa kali untuk mencuci DNA.Disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5menit dan ethanol dikeluarkan denganmikropipet. Kemudian pellet dikeringkandengan membalikkan tube diatas tissueselama 15 menit. Pellet dilarutkan denganditambahkan 100 l DNA RehydrationSolution. Disimpan pada suhu 40C selamasatu malam. Setelah disimpan selamasatu malam, sampel siap digunakan untuktahap berikutnya.

Pemeriksaan dengan Metode PCRKonvensional Tahap Amplifikasi DNA

Amplifikasi atau perbanyakan DNAtarget dimaksudkan untuk meningkatkanjumlah DNA target yang ada, sehingga

dapat dideteksi dengan elektroforesis.Amplifikasi DNA dilakukan denganbantuan thermocycler atau yang lebihdikenal dengan alat PCR. Prosesamplifikasi metode konvensional selalumenyertakan sampel positif yang diketahuimengandung virus WSSV dan kontrolnegatif. Formulasi PCR mix disajikan padaTabel 1.

Campuran reaksi dibuat dengankomposisi untuk satu reaksi seperti padaTabel 1 yang terdiri dari 6,25 l PromegaGo Taq Green Master Mix, 0,5 l primerWSSV270, 0,5 l primer WSSV345, 4,25l NFW. Campuran reaksi dihomogenkandengan disentrifugasi. Kemudiansebanyak 11,5 l dari campuran reaksididistribusikan ke masing-masingmikrotube ukuran 0,2 ml yang terdiri daritube sampel, tube kontrol positif, dankontrol negatif. Mikrotube yang berisisampel negatif ditambahkan 1 l NFW,sedangkan mikrotube sampelditambahkan 1 l template DNA sampelsesuai dengan kodenya masing-masing,begitu juga dengan mikrotube kontrolpositif ditambahkan 1 l DNA positifWSSV. Seluruh tube divortex dandihomogenkan dengan disentrifugasi,kemudian dimasukkan ke dalam mesinPCR dan mesin dijalankan denganpengaturan suhu yaitu pre amplifikasidenaturasi 94OC (4 menit), annealing55OC (1 menit), ekstensi 72OC (2 menit)sebanyak 1 siklus. Kemudian denaturasilagi 94OC (1 menit), annealing 55OC (1menit), ekstensi 72OC (2 menit) sebanyak30 siklus. Selanjutnya ekstensi akhir 72OC(5 menit) sebanyak 1 siklus dan end holdpada suhu 4OC.

Tabel 1. Formulasi PCR Mix

No. Komponen KonsentrasiAkhirVolume 1x PCR

(12,5l)1 Promega Go Taq Green Master Mix 1X 6,25

2 Primer WSSV270(5-ACCATGGAGAAGATATGTACAAGCA-3) 0,8 M 0,5

3 Primer WSSV345(5-GGCATGGACAGTCAGGTCTTT-3) 0,8 M 0,5

4 NFW (Nuclease Free Water) 4,25

5 Template DNA sampel/ Plasmid (+) sebagaikontrol positif white spot 500 ng/ l 1

Total Volume 12,5


Setelah program PCR selesai,hasil amplifikasi disimpan pada suhu -20oC untuk kemudian dianalisa denganelektroforesis.

Tahap ElektroforesisDNA hasil amplifikasi belum bisa

dilihat dengan mata telanjang.Untuk melihatnya, DNA hasil amplifikasi iniperlu dianalisa lebih lanjut denganelektroforesis. Hasil amplifikasi diperiksamenggunakan gel agarosa 1,5%. Geldibuat dengan melarutkan 0,75 grambubuk agarosa dalam 50 ml TAE buffer0,5X untuk kemudian dihomogenkan dandipanaskan dengan microwave hinggamendidih. Setelah agarose larut, ke dalambotol Scott ditambahkan 4 l Sybr Safe,kemudian kocok sebentar. Selanjutnyadituangkan pada cetakan gel yangsebelumnya telah ditempatkan comb(sisir) untuk membuat lubang/sumur dandidiamkan hingga gel mengeras.

Gel agarose yang sudah bekudirendam secara sub marine ataudirendam dalam running buffer yaitu TAE.Setiap sumur diisi 5 l DNA hasil PCR danpenanda berat molekul di satu sumurlainnya diisi dengan 5 l DNA Ladder100bp. Setelah lubang-lubang pada gelselesai diisi, tangki elektroforesis diberialiran listrik. Sisi yang berisi hasilamplifikasi diberi arus negatif. Proseselektroforesis dijalankan selama 30 menitpada voltase antara 100-150 volt. Setelahproses running selesai, gel diamati di atasUV trans - illuminator dan didokumentasikan dengan kamera digital.

Pemeriksaan dengan Real Time PCRTahap Pengenceran Standar Kurva

Plasmid WSSV yang telahdiketahui konsentrasinya dibuat tigatingkat pengenceran berturut-turut yaitu105, 104, dan 103 untuk kemudiandiamplifikasi. Amplifikasi beberapa

tingkat pengenceran secara otomatisoleh software Rotor Gene Q Series akandigambarkan dalam bentuk kurva standar.Kurva standar merupakan hubunganantara log konsentrasi plasmid danthreshold cycle (Ct). Kurva standar inidigunakan untuk menghitung konsentrasisampel (Angelia 2009).

Pengenceran standar kurva dimulaidengan mengambil sebanyak 1 l P(+)Standar 105 (stok) dipindahkan ke dalamtube dengan kode 104, kemudianditambahkan 9 l Nuclease Free Water.Sebanyak 1 l P(+) Standar 104dipindahkan ke dalam tube dengan kode103, kemudian ditambahkan 9 l NucleaseFree Water. Setelah pengenceran kurvastandar selesai, tube-tube yang berisi P(+)Standar disimpan didalam freezer.

Tahap Preparasi Reagen PCRCampuran reaksi dibuat dibuat

dengan komposisi untuk satu reaksiseperti pada Tabel 2. PCR mixdicampurkan sesuai dengan jumlah reaksiyang dibutuhkan. PCR mix dimixingdengan filtertips yang sama, diusahakantidak terbentuk buih, kemudian sebanyak23 l PCR mix didistribusikan ke semuatube 0,2 ml baru. Mikrotube NTC (kontrolnegatif) ditambahkan 2 l NFW,sedangkan mikrotube sampelditambahkan 2 l template DNA sampelsesuai dengan kodenya masing-masing,begitu juga dengan mikrotube positifstandarditambahkan 2 l positif standar dari hasilpengenceran standar kurva pada tahapsebelumnya.

Semua tube PCR 0,2 ml dispin 1detik, kemudian ditempatkan pada 36-WellRotor. Pasangkan 36-Well Rotor LockingRing ke dalam 36-Well Rotor denganbenar. Masukkan 36-Well Rotor dan 36-Well Rotor Locking Ring ke dalam mesin


Tabel 2. Formulasi PCR Mix untuk Metode Real Time

No. Komponen KonsentrasiAkhirVolume 1xReaksi (l)

1. Rnase-free water 92. 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix 1X 12,53. Primer WSSV270

(5-ACCATGGAGAAGATATGTACAAGCA-3) 0,4 M 0,5

4. Primer WSSV345(5-GGCATGGACAGTCAGGTCTTT-3) 0,4 M 0,5

5. Probe WSSV296T(5-FAM-

TTACAGTGATGGAATTTCGTTTATC-TAMRA

0,2 M 0,5

6. Template DNA/P(+) Standar 500 ng/ l 2Total Volume Reaksi 25

Rotor Gene-Q. Tutup pintu darimesin tersebut dan kemudian set up profilPCR sesuai dengan protokol yangdigunakan dengan menggunakan Rotor-Gene Q software. Program mesin realtime dengan pengaturan suhu yaitu PCRinitial activation 95 OC (15 menit).Kemudian denaturasi 94OC (15 detik),60OC (60 detik) sebanyak 40 siklus.

Analisis DataData yang diperoleh dari hasil

penelitian akan dianalisis secara deskriptifkualitatif yaitu membandingkan hasil DNAWSSV yang terdeteksi denganmenggunakan metoda PCR Konvensionaldan Real Time PCR.

HASIL DAN PEMBAHASANPengamatan Gejala Klinis

Berdasarkan hasil sampling yangdilakukan di 2 lokasi, yaitu tambak asalPasekan dan Karangsong diperoleh 14ekor kepiting masing-masing 7 ekor darisetiap lokasi yang terdiri dari 5 jeniskepiting. Adapun jenis kepiting yangdiperoleh dapat dilihat pada Tabel 3.

Secara fisik, semua sampelkepiting yang diperoleh tidak menunjukkangejala klinis terserang virus white spot,yaitu adanya bintik putih pada bagiantubuh. Hal ini sesuai dengan pernyataanSumawidjadja (2001) dalam Apriliza(2010) bahwa organisme carrier tidakmenunjukkan gejala klinis penyakitnyatetapi dapat menularkan penyakit padaorganisme lainnya.

Tabel 3. Jenis Kepiting yang DiperiksaLokasi Organisme Jumlah (ekor)

PasekanScylla serrata 2Helice tridens 1

Pachygrapsus marmoratus 4

KarangsongHelice tridens 4

Ocypode quadrata 1Uca minax 2

Total 14

Pengukuran Kualitas dan KuantitasDNA Genom

Kualitas dan kuantitas DNA yangtelah diisolasi dapat diuji secara kualitatifdengan elektroforesis gel agarose dankuantitatif dengan spektrofotometer.Pengukuran jumlah DNA melaluispektrofotometer didasarkan pada prinsipiradiasi sinar ultra violet (UV) yang diserap

oleh nukleotida dan protein dalam larutan(Tabel 4).

Kemurnian DNA diperoleh dariperbandingan absorban A260/280. MolekulDNA dikatakan murni jika rasio kedua nilaitersebut berkisar antara 1,8 2,0.Menurut Sambrook et al. (2001), DNAdengan rasio pada kisaran angka tersebuttelah memenuhi persyaratan kemurnian


yang dibutuhkan dalam analisis molekuler.Menurut Linacero et al., (1998) dalamTenriulo (2001), kontaminasi protein danbahan organik lainnya ditandai denganrendahnya nilai rasio A260/280 (< 1,8),

sebaliknya kontaminasi fenol ditandaidengan tingginya nilai rasio tersebut (>2,0).

Tabel 4. Hasil Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA Kepiting

Sampel

PanjangGelombang

(nm)Konsentrasi/C

(ng/l)Rasio

Absorbansi(R)A260 A280

Pachygrapsus marmoratus (A1) 0,031 0,012 160 2,583Pachygrapsus marmoratus (A2) 0,039 0,018 185 2,167Pachygrapsus marmoratus (A3) 0,001 0,009 5 0,111Pachygrapsus marmoratus (A4) 0,133 0,074 665 1,797

Scylla serrata (B1) 0,021 0,007 105 3,000Scylla serrata (B2) 0,067 0,035 330 1,914Helice tridens (C1) 0,016 0,004 75 4,000Helice tridens (D1) 0,200 0,111 1005 1,802Helice tridens (D2) 0,109 0,050 540 2,180Helice tridens (D3) 0,354 0,180 1765 1,967Helice tridens (D4) 0,115 0,053 565 2,170Uca minax (D5) 0,099 0,046 490 2,152

Ocypode quadrata (D6) 0,059 0,026 290 2,269Uca minax (D7) 0,064 0,030 320 2,133

Selain menggunakanspektrofotometer, untuk melihat kualitasisolat DNA dilakukan denganelektroforesis pada konsentrasi gelagarose 0,8%. Hasil elektroforesis DNAGenom (Gambar 1) menunjukkanseluruh sampel (kecuali sampel A3)menghasilkan pita DNA dengan ketebalanpita yang beragam. Ketebalan pita

yang beragam diakibatkan oleh nilaikemurnian pada masing-masing sampelberbeda dan nilai konsentrasi yangdiperoleh berbeda-beda pula (Tabel 4).Sedangkan pada sampel A3 (sumur 3)pita DNA tidak nampak, hal inidikarenakan nilai konsentrasi DNA yangdihasilkan relatif lebih kecil biladibandingkan dengan yang lainnya.

Gambar 1. Hasil Elektroforesis DNA Genom


Keterangan :1 = Sampel Pachygrapsus marmoratu (A1) 9 = Sampel Helice Tridens (D1)2 = Sampel Pachygrapsus marmoratus (A2) 10 = Sampel Helice Tridens (D2)3 = Sampel Pachygrapsus marmoratus (A3) 11 = Sampel Helice Tridens (D3)4 = Sampel Pachygrapsus marmoratus (A4) 12 = Sampel Helice Tridens (D4)5 = Sampel Scylla serrata (B1) 13 = Sampel Uca minax (D5)6 = Sampel Scylla serrata (B2) 14 = Sampel Ocypode quadrata (D6)7 = Sampel Helice Tridens (C1) 15 = Sampel Uca minax (D7)8 = Marker DNA Ladder 1kb

Selain pita DNA, hasilelektroforesis DNA genom menunjukkanadanya materi ikutan lain (smear) yangmasih terbawa dan nampak tebal sepertipada sampel B2 (sumur 6), D1 (sumur 9),D2 (sumur 10), D3 (sumur 11). Smeardapat disebabkan karena pada DNAmasih terdapat protein dan RNA. MenurutMulyani dkk., (2011), smear tersebut bisamerupakan sisa dari larutan-larutan yangmasih terbawa selama proses isolasi ataujuga dapat berupa DNA yangterdegradasi pada proses isolasi.

Hasil Deteksi WSSV dengan PCRKonvensional

Hasil deteksi terhadap seranganvirus white spot pada kepiting denganmenggunakan uji PCR Konvensionalnampak pita DNA WSSV pada beberapasampel baik sampel kepiting asal Pasekanmaupun Karangsong (Gambar 2). Hal inimenunjukkan bahwa PCR Konvensionalmampu mendeteksi serangan virusWSSV.

Berdasarkan Gambar 11 diatasdapat dilihat bahwa dari 14 sampel yangdiperiksa, 7 sampel menunjukkan hasilpositif WSSV yaitu dengan nampaknyapita DNA WSSV sesuai dengan positifstandar (sumur ke-1) pada ukuranfragmen 76 bp. Positif standarWSSV yang digunakan sebagai

kontrol positif merupakan stok kontrolpositif WSSV Laboratorium BiologiMolekuler BUSKI. Dari 7 sampel yangmenunjukkan hasil positif, 5 sampelberasal dari tambak asal Pasekan (sumurke-3, sumur ke-4, sumur ke-5, sumur ke-7,dan sumur ke-8) dan 2 sampel berasaldari tambak asal Karangsong (sumur ke-15 dan sumur ke-16). Hal ini menandakanbahwa 7 sampel tersebut positif membawapenyakit WSSV. Sedangkan pada sumurke-6, sumur ke-9 sampai sumur ke-14tidak menunjukkan adanya pita padaukuran fragmen 76 bp, hal inimenandakan bahwa sampel A4, C1, D1,D2, D3, D4, dan D5 negatif membawapenyakit WSSV.

Keberadaan WSSV ditentukanoleh desain primer yang digunakan,karena ukuran DNA genom WSSVberukuran besar maka didesain fragmendengan ukuran tertentu untuk mendeteksikeberadaan WSSV. Pada penelitian iniuntuk mengamplifikasi sekuen DNAWSSV digunakan 1 pasang primer yangberbeda urutan nukleotidanya. Primeryang digunakan yaitu WSSV270(5ACCATGGAGAAGATATGTACAAGCA3) dan primer WSSV345(5GGCATGGACAGTCAGGTCTTT3)akan menghasilkan ukuran produkamplikon 76 bp.


M 1 2 3 4 5 6 7 8

910 11 12 13 14 15 16 Gambar 2. Hasil Elektroforesis Sampel Kepiting

Keterangan :M = Marker 100 bp DNA Ladder 9 = Sampel C1 Helice Tridens1 = Kontrol Positif (76 bp) 10 = Sampel D1 Helice Tridens2 = Kontrol Negatif 11 = Sampel D2 Helice Tridens3 = Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus

(76 bp)12 = Sampel D3 Helice Tridens

4 = Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus(76 bp)

13 = Sampel D4 Helice Tridens

5 = Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus(76 bp)

14 = Sampel D5 Uca minax

6 = Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus 15 = Sampel D6 Ocypode quadrata(76 bp)

7 = Sampel B1 Scylla serrata (76 bp) 16 = Sampel D7 Uca minax (76 bp)8 = Sampel B2 Scylla serrata (76 bp)

Hasil Deteksi WSSV dengan Real TimePCR Pengenceran Standar Kurva

Amplifikasi yang dijalankan dalamRotor Gene Q ditampilkan dalam bentukgrafik pada layar komputer dengansoftware Rotor Gene Q Series. Grafik-grafik yang ditampilkan berupa grafiksampel kontrol positif WSSV (grafik kurvastandar) dan grafik amplifikasi sampel uji.Amplifikasi beberapa tingkat pengencerankontrol positif WSSV (hasil kloning) secaraotomatis oleh software Rotor Gene QSeries akan digambarkan dalam bentukkurva standar, selain grafik amplifikasisampel uji. Tiga titik pada kurva standar

(Gambar 3 dan Gambar 4) menunjukkanterdapat tiga tingkat pengenceran yangmasing-masing memiliki nilai Ct. Kurva iniakan memplotkan log dari konsentrasi tigaatau lebih sampel yang telah diketahuinilai konsentrasinya, sehingga kurvastandar ini dapat digunakan untukmenghitung konsentrasi sampel.

Kurva standar sampel asal tambakPasekan memiliki nilai slope -4,45724,nilai efisiensi 67,63% dan nilai R2mencapai 0.99398. Adapun persamaangaris dari kurva standar (Gambar 3) yaituy = -4.457x + 39.629 dengan y adalah nilaiCt dan x adalah log konsentrasi virus yangdiuji.


Gambar 3. Kurva Standar antara Konsentrasi WSSV dan Nilai CT Sampel Asal TambakPasekan

Kurva standar sampel asal tambakKarangsong memiliki nilai slope -4.64589,nilai efisiensi 64,15% dan nilai R2mencapai 0.99941. Sedangkan

persamaan garis dari kurva standar(Gambar 4) yaitu y = -4.646x + 43.805dengan y adalah nilai Ct dan x adalah logkonsentrasi virus yang diuji.

Gambar 4. Kurva Standar antara Konsentrasi WSSV dan Nilai CT Sampel Asal TambakKarangsong

Nilai slope kedua kurva standartersebut tidak berada dalam selang slopeyang diharapkan, sehingga nilai efisiensiyang diperoleh tidak bagus yaitu kurangdari 100%. Menurut Pestana et al. (2010)sebuah kurva standar dengan standarpositif harus memiliki kriteria nilai efisiensi

>80%, nilai slope diantara -3.1 sampai -3.8, dan nilai R2 >0.980.

Amplifikasi Sampel UjiHasil deteksi sampel asal tambak

Pasekan dengan real time PCRmenunjukkan dari 7 sampel yangdiperiksa, terdapat 6 sampel memberikanhasil yang positif WSSV (Tabel 5).

Tabel 5. Hasil Deteksi Sampel asal Tambak Pasekan dengan Real Time PCR

K onsentrasi WSSV

CT

(Sik

lus

ke-)

Konsentrasi WSSV

CT(S

iklu

ske

-)


Apabila dilihat pada grafikamplifikasi positif kontrol WSSV (kurvastandar) dan grafik amplifikasi sampel,hasil positif ditandai dengan adanyaakumulasi pada signal fluoresen danmelintasi base line threshold. Sedangkansampel C1 dan NTC tidak melintasi base

line threshold sehingga menunjukkan hasilnegatif. Grafik amplifikasi sampel uji dankurva standar berbentuk sigmoid yangterdiri atas beragam warna yang masing-masing menunjukkan fragmen DNAWSSV sampel uji yang teramplifikasi(Gambar 5).

Gambar 5. Grafik Amplifikasi Sampel Asal Tambak PasekanKeterangan :

STD = Standar Pengenceran WSSV 2 X 105 A4 = Pachygrapsus marmoratusSTD = Standar Pengenceran WSSV 2 X 104 B1 = Scylla serrataSTD = Standar Pengenceran WSSV 2 X 103 B2 = Scylla serrataA1 = Pachygrapsus marmoratus C1 = Helice TridensA2 = Pachygrapsus marmoratus NTC = No Template Control

A3 = Pachygrapsus marmoratus

Hasil deteksi sampel asal tambakKarangsong menunjukkan dari 7 sampelyang diperiksa, terdapat 6 sampel

memberikan hasil yang positif WSSV(Tabel 6).

Tabel 6. Hasil Deteksi Sampel asal Tambak Karangsong dengan Real Time PCR

Apabila dilihat pada grafikamplifikasi positif kontrol WSSV (kurvastandar) dan grafik amplifikasi sampel,hasil positif ditandai dengan adanyaakumulasi pada signal fluoresen danmelintasi base line threshold. Sedangkansampel D2 dan NTC tidak melintasi base

line threshold sehingga menunjukkan hasilnegatif. Grafik amplifikasi sampel uji dankurva standar berbentuk sigmoid yangterdiri atas beragam warna yang masing-masing menunjukkan fragmen DNAWSSV sampel uji yang teramplifikasi(Gambar 6


Gambar 6. Grafik Amplifikasi Sampel Asal Tambak KarangsongKeterangan :

STD = Standar Pengenceran WSSV 2 X105

D4 = Helice Tridens


D5 = Uca minax


D6 = Ocypode quadrata

D1 = Helice Tridens D7 = Uca minaxD2 = Helice Tridens NTC = No Template ControlD3 = Helice Tridens

Amplifikasi DNA menggunakanmesin real time PCR selainmengamplifikasi sampel dan standarpositif juga disertakan kontrol negatif atauNTC (No Template Control = tidakdisertakan template). Kontrol negatifberfungsi untuk mengetahui apakah saatmencampurkan mix reagen ke dalamsampel terdapat kontaminasi atau tidak.Kontrol negatif akan tetap negatif setelahpembacaan jika tidak terdapat kontaminasiatau dalam arti lain bahwa pengerjaan darimixing reagen berhasil dan hasil PCRdianggap layak dan dapat dipercaya. Haltersebut berlaku sebaliknya yakni jikakontrol negatif menjadi positif makadapat diperkirakan telah terjadikontaminasi dan hasil dari pembacaan

dianggap tidak dapat dipercaya untukselanjutnya pemeriksaan akan diulang(Kartikasari 2008).

Perbandingan Hasil Deteksi PCRKonvensional Dan Real Time

Pemeriksaan kepiting yang didugasebagai carrier WSSV dari 14 sampelyang diuji, dengan menggunakan PCRkonvensional 7 sampel menunjukkan hasilpositif WSSV, sedangkan denganmenggunakan Real Time PCR 12 sampelmenunjukkan hasil positif WSSV.Adapun perbandingan hasil deteksisampel uji kepiting asal tambak Pasekandan tambak Karangsong dengan PCRkonvensional dan real time PCR disajikanpada Tabel 7 berikut ini.


Tabel 7. Perbandingan Hasil Deteksi WSSV pada PCR Konvensional dan Real Time PCR

No. KodeSampel SpesiesPCR

Konvensional*RealTimePCR

NilaiCt

JumlahKopi

WSSV1. Kontrol

+ Std wssv 2 x 105 16.20 180,335.5

2. Kontrol+ Std wssv 2 x 10

4 20.06 24,599.6

3. Kontrol+ Std wssv 2 x 10

3 25.12 1,803.4

4. A1 Pachygrapsusmarmoratus

Positif Positif 29.84 157.0






Negatif Positif 30.92 89.9

8. B1 Scylla serrata Positif Positif 30.19 131.29. B2 Scylla serrata Positif Positif 31.67 61.0

10. C1 Helice tridens Negatif Negatif - -11. D1 Helice tridens Negatif Positif 37.39 24.112. D2 Helice tridens Negatif Negatif - -13. D3 Helice tridens Negatif Positif 37.83 19.314. D4 Helice tridens Negatif Positif 37.78 19.815. D5 Uca minax Negatif Positif 37.19 26.516. D6 Ocypode quadrata Positif Positif 36.67 34.317. D7 Uca minax Positif Positif 35.03 77.6

Keterangan : *) Deteksi dengan PCR Konvensional menggunakan 1 kontrol Positif

Berdasarkan Tabel 7 dapat dilihatbahwa real time PCR lebih sensitifdaripada PCR konvensional denganpersentase yang terdeteksipositif mencapai 85,71%. Hal ini terlihatdari dengan menggunakan primer yangsama, PCR konvensional hanya mampumendeteksi 7 sampel positif dari14 sampel yang diperiksa, sedangkan realtime PCR mampu mendeteksi 12 sampelpositif dari 14 sampel yang diperiksa.Pada sampel A4, D1, D3, D4, dan D5PCR konvesional menunjukkan hasilnegatif palsu karena pemeriksaansampel-sampel tersebut dengan real timePCR menunjukkan hasil positif WSSV.Hasil negatif palsu yang ditunjukkan PCRkonvensional dilihat berdasarkan jumlahkopi WSSV yang dihasilkan sampel D1,D3, D4, dan D5 oleh real time PCRmenghasilkan jumlah kopi dengan kisaran19 27 kopi yang tergolong relatif sangatsedikit sehingga tidak dapat dideteksi olehPCR konvensional. Hal ini dibuktikan darihasil elektroforesis Gambar 2 pada sumurke-10, sumur ke-12, sumur ke-12, dan

sumur ke-14 yang tidak menunjukkanfragmen DNA WSSV. Menurut Dwinanti(2006), pada PCR konvensional hasilnegatif yang salah dapat disebabkankarena jumlah kopian DNA yang tidakmencukupi dan tingkat infeksi yang terlalurendah sehingga pita DNA berpendarredup atau bahkan tidak berpendar.Sampel C1 asal tambak Pasekan dan D2asal tambak Karangsong baik padapemeriksaan dengan PCR konvensionalmaupun dengan real time PCR sama-sama menunjukkan hasil negatif yaitupada spesies Helice tridens. Sehinggasampel C1 dan D2 dapat dikatakan bebasWSSV.

KESIMPULANBerdasarkan hasil penelitian dan

pembahasan dapat ditarik kesimpulansebagai berikut :a. Real Time PCR lebih mampu

mendeteksi keberadaan WSSV padakepiting tanpa gejala klinis


dibandingkan dengan PCRkonvensional.

b. Kepiting yang berpotensi sebagaicarrier WSSV diantaranya adalahPachygrapsus marmoratus, Scyllaserrata, Helice tridens, Ocypodequadrata, dan Uca minax.

c. Deteksi dengan PCR konvensionaltujuh sampel kepiting positif WSSVpada ukuran fragmen 76 bp, terdiri dari3 sampel Pachygrapsus marmoratusdan 2 sampel Scylla serrata asalKecamatan Pasekan, sedangkansampel Ocypode quadrata dan Ucaminax asal Karangsong, KecamatanIndramayu.

d. Deteksi dengan real time PCRmenunjukkan 12 sampel positif WSSVyang ditandai dengan adanyaakumulasi pada signal fluoresen. Duabelas sampel positif terdiri dari 4sampel Pachygrapsus marmoratus dan2 sampel Scylla serrata asalKecamatan Pasekan, 3 sampel Helicetridens, 1 sampel Ocypode quadratadan 2 sampel Uca minax asalKarangsong, Kecamatan Indramayu.

DAFTAR PUSTAKAAngelia, Tri Octora. 2009. Kajian Metode

Deteksi Bakteri Patogen PenyebabPenyakit Asal Pangan Di PusatRiset Obat Dan Makanan BadanPOM RI. Skripsi. Bogor :Departemen Ilmu dan TeknologiPangan, Fakultas TeknologiPertanian, Institut Pertanian Bogor.

Aprijani, Dwi Astuti., Elfaizi, M.Abdushshomad. 2004.Bioinformatika : Perkembangan,Disiplin Ilmu dan Penerapannya diIndonesia.

Aprilliza, Eka. 2010. Potensi Udang Rebon(Carrier) Dalam Penularan WSSV(White Spot Syndrome Virus) PadaUdang Vannamei Yang DipeliharaDengan Berbagai TeknologiBudidaya Di Tambak KabupatenIndramayu. Skripsi. Jatinangor :Fakultas Perikanan dan IlmuKelautan, Universitas Padjadjaran.

Dwinanti, Sefti Heza. 2006. KeberadaanWhite Spot Syndrome Virus(WSSV), Taura Syndrome Virus(TSV) Dan Infectious HypodermalHaematopoitic Necrosis Virus(IHHNV) Di Tambak Intensif UdangVannamei Litopenaeus vannameiDi Bakauheni, Lampung Selatan.Skripsi. Bogor : Program StudiTeknologi dan ManajemenAkuakultur, Fakultas Perikanandan Ilmu Kelautan, InstitutPertanian Bogor.

Fatimi, Humairah. 2010. PolymeraseChain Reaction (PCR). Palembang: Program Studi Ilmu Biomedik,Program Pasca Sarjana,Universitas Brawijaya.

Kartikasari, D.S. 2008. PerbandinganTingkat Sensitivitas danSpesifisitas Pada PemeriksaanInfluenza A Dengan MenggunakanRapid Tes dan Real Time-ReverseTranscriptase PCR (Rrt-PCR).Artikel Karya Tulis Ilmiah.Semarang : Fakultas Kedokteran,Universitas Diponegoro.

Mulyani, Y., A. Purwanto., I. Nurruhwati.2011. Perbandingan BeberapaMetode Isolasi DNA untuk DeteksiDini Koi Herpes Virus (KHV) PadaIkan Mas (Cyprinus carpio L.).Jatinangor : Fakultas Perikanandan Ilmu Kelautan, UniversitasPadjadjaran. Jurnal Akuatika Vol. IINo. 1/Maret Tahun 2011.

Octaviana, Rany Surya. 2005. DiagnosaTingkat Serangan Virus White SpotPada Benur Udang Windu diHatchery dan Tambak TradisionalDesa Karanganyar KecamatanBangil. Skripsi. Jatinangor :Fakultas Perikanan dan IlmuKelautan, Universitas Padjadjaran.


Pestana, E.A., S. Belak., A. Diallo., J.R.Crowther., G.J. Viljoen. 2010.Early, Rapid andSensitiveVeterinary MolecularDiagnostics - Real Time PCRApplications. Springer. DordrechtHeidelberg London New York.

Promega. 2010. Technical Manual WizardGenomic DNA Purification Kit.USA.

Sahana, Cuk. 2010. Produksi UdangTurun Akibat Serangan Virus.Diakses darihttp://techno.okezone.com/read/2010/09/22/373/374602/produksi-udang-turun-akibat-serangan-viruspada tanggal 15 Januari 2012pukul 16:29.

Sambrook, J., dan D. W. Russel. 2001.Molecular Cloning : A LaboratoryManual (Third Edition). Cold SpringHarbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York.

Tenriulo, A., E. Suryati., A. Parenrengi.,Rosmiat. 2001. Ekstraksi DNARumput Laut Kappaphycusalvarezii dengan Metode FenolKloroform. Makassar : JurusanKimia, Fakultas Matematika danIlmu Pengetahuan Alam,Universitas Hasanuddin. Vol. 2 No.2 ISSN 1411-2132.

Hal 61.pdfHal 62-74.pdf

Aplikasi PCR Konvensional Dengan RT-PCR Untuk Deteksi White Spot Syndrom Virus Pada...

Documents

Transcript of Aplikasi PCR Konvensional Dengan RT-PCR Untuk Deteksi White Spot Syndrom Virus Pada...