Aline LemesFernanda Aquino

Marília GomesViviane Pessin

Inflamação das glândulas mamárias Prejuízos econômicos:1. Queda na produção2. Queda na qualidade3. Perda de teto4. Descarte de animais5. custos com drogas, veterinário e mão de obra

Perda mundial 35 bilhões $/ano Atividade leiteira

Multifatorial1. Trauma2. Irritação química3. Infecção microbiana

Predomínio de Staphilococcus e Streptococcus

Tipos: sub clínica ou clínica

Clínica Sub clínica

IRRITAÇÃOPERSISTENTE

III

PERDA DO EPITÉLIO

SECRETOR

Patógenos contagiosos:1. Contaminam os quartos – ordenha2. S. agalacteae, S. aureus, Corynebacterium

bovis

Patógenos ambientais:1. Fezes, cama, solo, represas...2. E. coli, S. dysgalacteae, S. uberis

S. aureus, S. agalacteae, S. dysgalacteae, S. uberis90 – 95% dos casos

Etiológico é fundamental1. Rápido2. Barato3. Eficiente

Análise fenotípica:Expressão de fatores biológicos celulares – produção

de enzima, utilização de nutrientes, metabolismo, susceptibilidade aos agentes químicos

Análise genotípicaDetectam variações no DNA, normalmente estáveis e

pouco afetadas pelas condições ambientais – identifica espécie, virulência, transmissão e fonte de infecção

Bacteriológico1. Caro2. Ineficiente3. Baixa sensibilidade4. Cultura bacteriológica lenta5. Isolamento e identificação6. Técnicas bioquímicas

Vacas sub clinicamente infectadas podem eliminar intermitentemente o patógeno

Cultura negativa por resíduos de antibióticos

ETIOLÓGICOBacteriológico

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus resistente à

meticilinaStreptococcus

MOLECULAR PCR Multiplex PCR Ribotipagem Detecção de microrganismos no leite

Local: EV – DMP – UFMG

Doações da Embrapa Gado de Leite, Universidade Federal de Lavras e Hospital das Clínicas da UFMG

As amostras foram mantidas em caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth Acumedia Manufacters) com 50% de glicerol a -20ºC até o momento do uso.

Plano de execução do experimento

PCR – Primer – amplifica segmentos específicos

Extração de DNA1. Preparação da amostra: retira cálcio, principal

inibidor da PCR no leite

2. Extração: retira o DNA

3. Purificação do DNA: retira proteínas e debris celulares através do protocolo de Fenol-Clorofórmio

Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura

Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em leite artificialmente contaminadas

Extração de DNA a partir de amostras de leite de tanque de expansão

Padronização das PCRs Individual

Multiplex

Ambas com DNA obtido a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura

PCR Multiplex para detecção de microrganismos a partir das amostras de leite de tanque de expansão

Avaliação da especificidade verificada:

Utilizando Streptococcus bovis, Staphylococcus intermedius e S. epidermidis, comumente encontradas no leite

Especificidade dos Primers

Bandas de DNA esperadas para cada microorganismo

Exceto, S.aureus em que se observou 3 bandas com predomínio de 900pb na maioria

Figura 1: Fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de culturas puras de S. aureus e Streptococcus spp.

Sensibilidade do PCR a partir de culturas puras

PCR Individual 10pg de DNA

PCR multiplex 500pg de DNA

S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. aureus

MRSA 250pg de DNA

Sensibilidade da PCR a partir de amostras do leite

PCR individual 10²UFC/mL

PCR multiples 10³UFC/mL

Figura 2. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. agalactiae (270 pb), visualizados em gel de agarose 2%.

Figura 3. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. dysgalactiae (264 pb), visualizados em gel de agarose 2%.

Figura 4. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. uberis (330 pb), visualizados em gel de agarose 2%.

Figura 5. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. aureus (900 pb, 420 pb, 200 pb), visualizados em gel de agarose 2%.

Figura 6. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de MRSA (533 pb), visualizados em gel de agarose 2%.

Testes em amostras de leite de tanque de expansão

Nas figuras e na tabela a seguir se encontram os resultados obtidos das 30 amostras de tanque de expansão.

Não foi observada interferência do azidiol presente na amostra.

Figura 7. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.

Figura 8. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.

Figura 9. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.

Tabela 1. Utilização da PCR multiplex para detecção de microrganismos em leite bovino com diferentes contagens bacterianas totais e contagens de células somáticas, diretamente do tanque de expansão.

Teste diagnóstico

Controlar e erradicar doenças

OBJETIVO

Para garantia de sucesso, temos como característica impressindível a Sensibilidade

Desenvolvimento de métodos rápidos e sensíveis para a diferenciação de microorganismos

Com isso, metódos genotípicos substituem métodos fenotípicos

Métodos fenotípicos Métodos genotípicos

Falso negativo Rápida e acurada identificação

Valores ambientais interferem

Não tem interferência do meio (genoma)

Baixa reprodutibilidade Vantagem da reprodutibilidade

Baseia em características instáveis dos microorganismos

Rapidez Sensibilidade Reprodutibilidade

A caseína é um dos principais inibidores presentes no leite, em associção com cálcio forma micelos

Adição de solução com alta concentração de EDTA quelam (eliminam os metais tóxicos) o cálcio dissolvendo os micelos de caseína

No experimento usou-se o tampão NET (alta [EDTA])

No trabalho realizado utilizou-se bactérias Gram-positivas

parece celular mais resistenteparece celular mais resistente

O método de extração para DNA dessas bactérias na amostra apresentada mostrou-se:

Eficiente Fácil realização Reagentes econômicos Equipamentos sofisticados não foram requeridos Pouca manipulação da amostra Tempo de análise de processo

aproximadamente 8 horas

Pré dipping e pós dipping

Terapia da vaca seca

Tratamento eficaz e eficiente

Descarte de animais crônicos

Manutenção regular da ordenhadeira mecânica

Marisa Araújo Silva. Utilização de PCR multiplex para o diagnóstico etiológico da mastite bovina. Dissertação de mestrado UFMG. 2008.