POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Laboratorium GenetikaDepartemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Indonesia

2011

DETEKSI MATERI GENETIK

Isolasi DNA

PCR

Elektroforesis

Sekuensing

Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Pertama kali ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1983.

• PCR merupakan teknik biologi molekuler yang berguna untuk memperbanyak (amplifikasi) sekuen DNA spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan kopi.

Prinsip Kerja PCR

• Memperbanyak kopian DNA spesifik dari primer inisiator oleh enzim DNA polymerase dengan caramenghubungkan dNTP-dNTP dalam suatu reaksitermal.

Tujuh Komponen Reaksi PCR

No. Komponen PCR Keterangan

1. DNA template cetakan yang akan diperbanyak sekuensspesifiknya.

2. PCR buffer menjaga kestabilan pH dalam reaksi PCR

3. Kation divalen mengkatalisis reaksi dengan berperansebagai kofaktor enzim

4. Nuclease free water

berfungsi sebagai pelarut

No. KomponenPCR

Keterangan

5. dNTP membentuk basa komplementer pada hasil cetakanDNA

Terdiri atas 4 macam:o deoksiadenosin trifosfat (dATP)o deoksitimidin trifosfat (dTTP)o deoksitidin trifosfat (dCTP)o deoksiguanosin trifosfat (dGTP)

6. Enzim DNA polymerase

menghasilkan produk pemanjangan cetakan DNA dengan menghubungkan dNTP-dNTP

Taq DNA polymerase bakteri Thermus aquaticus(hidup di daerah panas sehingga mempunyai enzimyang termostabil

Tujuh Komponen Reaksi PCR

Tujuh Komponen Reaksi PCRNo. Komponen

PCRKeterangan

7. Primer mengapit daerah spesifik pada DNA template dan menginisiasi replikasi produk cetakan

didesain secara khusus untuk fragmen yang ingin diperbanyak

Primer universal: primer yang dapat digunakanpada berbagai template yang bebeda karenaadanya sekuens-sekuens yang saling homolog

Primer yang digunakan dalam satu set reaksiPCR:• Primer Forward• Primer Reverse

Primer yang digunakan dalam satu set reaksi PCR terdiri atas dua macam:

Kenapa tidak?

Polimerisasi/Elongasi (±72oC)

DNA polymerasemelakukan pemanjangan primer dari arah 5’ ke 3’ dengan menghubungkan dNTP-dNTP.

Setelah beberapa basa terbentuk, ikatan hidrogen antara primer dan templateakan menjadi sangat kuat sehingga keduanya tidak terpisah selama tahap

selanjutnya

Annealing/Pelekatan (±54oC)

Primer melekat pada situs yang tepatDNA polymerasemelekat pada untai

DNA

Denaturasi (±94oC)Reaksi

enzimatikberhentiIkatan hidrogen rusak

Untai ganda DNA terpisah untai tunggal

SIKLUS PCR

Kondisi Siklus PCR

Dirancang dan dioptimasi secara khusus

Suhu dan waktu setiap tahap dalam siklus reaksi PCR dapat dipengaruhi oleh:

• Panjang fragmen yang hendak diperbanyak

• Panjang sekuen primer

• Suhu optimal enzim

• Jumlah/volume template

• Kandungan basa pada template dan primer

Penentuan suhu annealing primer

• Keberhasilan pelekatan antara primer dan templateditentukan oleh melting temperature (Tm).

• Perhitungan Tm(oC) metode Wallace:

• Suhu annealing yang optimal berkisar ±5oC dari suhuTm.

Tm = 2(A+T)+ 4(G+C)

Kelebihan dan Kekurangan PCR

• Reaksi sangat spesifik dan akurat

• Mudah dilakukan secara otomatis

• Waktu relatif cepatKelebihan

• Biaya relatif mahal

• Rentan terhadap kontaminasi

• Tidak dapat mengekspresikan mutasi

Kekurangan

Aplikasi PCR & Deteksi Materi Genetik

• Deteksi penyakit akibat infeksi bakteri atau virus

• Paternity testing

• Studi forensik (DNA fingerprinting)

• Diagnosis penyakit genetik

• Analisis Filogenetik

• Studi Paleontologi

• Pengklonaan & Terapi gen

• Mutagenesis artifisial

• Proyek pemetaan genom

Tabung PCR0,2 ml

Tips

Mikropipet

Thermal cyclerPerkin Elmer

GeneAmp PCR System 9600

Alat

Thermal Cycler

• Merupakan mesin yang dapat diprogramuntuk menaikkan dan menurunkan suhusesuai dengan urutan dan waktu yang diinginkan.

Reaction mixture (1 x reaksi)Bahan Volume

sampel isolasi darahVolume

sampel isolasitanaman

10XPCR buffer 2,5 µl 1,5 µl

25 mM MgCl2 4 µl 0,9 µl

10 mM dNTP 0,5 µl 0,3 µl

20 µM primer forward 0,5 µl 0,75 µl

20 µM primer reverse 0,5 µl 0,75 µl

Taq DNA Polymerase (5 U/µl)

0,04 µl 0,12 µl

ddH20 steril 11,96 µl 9,68 µl

DNA template 5 µl 5 µl

TOTAL 25 µl 20 µl

Primer

• Sampel Isolasi tanaman:

– Primer Par1 OPG 16

– Primer Par2 OPG 16

• Sampel Isolasi darah:

– Primer Fy3F1 (forward), Tm = 64,5° C

– Primer Fy3R1 (reverse), Tm = 62° C

Kondisi Siklus ReaksiHasil Isolasi Tanaman

95oC 94oC

36oC

72oC 72oC

15oC

40 siklus

3’ 1’

1’

1’ 5’

Kondisi Siklus ReaksiHasil Isolasi Darah

94oC 94oC

62oC

72oC 72oC

4oC

40 siklus

3’ 30’’

30’’

35’’ 5’

Cara Kerja

Reaction mixdimasukkan ke

dalam tabung PCR

1µl DNA templatedimasukkan ke dalam tabung

PCR

Tabung PCR dimasukkan ke dalam thermal

cycler

Suhu, waktu setiap proses PCR, dan

jumlah siklus diatur pada mesin PCR

Program PCR dijalankan

SELAMAT BEKERJA DAN TERIMA KASIH