LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKULER

EKSTRAKSI DNA, REAKSI BERANTAI POLIMERASE (PCR)

DAN ELEKTROFORESIS

Oleh :

Ahmad Fadli

2011 38 001

POGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI PAPUA

MANOKWARI

2013

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA adalah

molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses

metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu

gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk

nukleotida (Maulana dkk, 2010).

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan

penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein

dan proses metabolisme lain. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan

kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan

berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan

kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain

itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan

sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola

pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA

prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA

eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Maulana dkk, 2010).

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-

langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan

panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh

karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA.

Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki

tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis

jaringan (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan

bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak (Sutomo, 2002).

Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi

DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis

pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen

2

DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan

diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti

sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di

bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular

(Handoyo dan Ari, 2000).

Elektroforesis merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering

dipakai dalam bidang Biokimia dan Biologi Molekular. Secara prinsip, teknik ini

mirip dengan kromatografi, memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan

perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap

campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip

dalam elektroforesis) (Jusuf, 2001).

Berdasarkan latar belakang tersebut, praktikum ini penting dilakukan oleh

mahasiswa untuk mempelajari metode-metode dalam ekstraksi DNA, PCR dan

elektroforesis yang biasa dilakukan dalam analisis DNA dalam bidang Biologi

Molekuler.

1.2 Tujuan

Tujuan dilakukanya praktikum ini adalah :

1. Mempelajari bagaimana mengekstraksi DNA.

2. Mempelajari bagaimana proses ekstraksi DNA.

3. Mempelajari bagaimana mengamplifikasi fragmen DNA.

4. Mempelajari bagaimana kerja PCR.

5. Mempelajari bagaimana melakukan analisis dengan gel agarosa dan

poliakrilamida

6. Mempelajari bagaimana kerja elektorofresis gel agarosa dan bagaimana

menentukan ukuran fragmen DNA.

7. Mempelajari bagaimana elektroforesis gel poliakrilamida bekerja.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ekstraksi DNA

Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan

protein histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat

asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan

DNA. DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang

terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA

plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal (Fatchiyah dkk., 2012).

Ekstraksi DNA adalah prosedur umum memisahkan dan mengumpulkan

DNA untuk analisis rekayasa genetika, forensik, bioinformatika, komputasi,

analisis asal-usul dan antropologi. Ada beberapa teknik ekstraksi yang umum

digunakan dalam teknologi DNA termasuk teknik Chelex. Teknik ini

dikembangkan tahun 1991 dan hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR.

Meskipun memiiiki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan

efektif untuk ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA

karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan

menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks

PCR. Metode ini menjamin untuk menghasilkan sampel kecil sehingga disarankan

untuk semua sampel yang diuji dengan berbagai ukuran dan volume sampel

(Walsh and Higuchi, 1991).

2.1.1 Prinsip Dasar Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA berarti mengeluarkan DNA dari sel. Teknik Chelex

umumnya mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan prosedur

penambahan suspensi "resin-chelat" secara langsung untuk spesimen (darah,

noda darah, semen sebagai contoh) kemudian melalui resin penukar ion yang

mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam tahap terakhir, logam

membawa materi lain dengannya. Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi

DNA, yang rinciannya dapat berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang

mempengaruhi ekstraksi dan analisis lanjut (Walsh and Higuchi, 1991).

4

• Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan lipid

membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan vorteks

dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk memecahkan

protein dinding sel.

• Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui

penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat

ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-kloroform.

• Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di

dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam.

• Cuci pelet DNA dengan alkohol lagi dan sentrifugasi untuk mendapatkan

kembeli peletnya.

• Melarutkan DNA dalam buffer alkalin

Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memanaskan sejumlah

jaringan dalam larutan Chelex. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel

dan mendenaturasi protein. Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah

sampel dari kontaminan (Walsh and Higuchi, 1991).

2.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction

(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi

nukleotida secara in vitro. PCR adalah teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi

bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA yang telah

diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler untuk isolasi

dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran DNA melalui

replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti E. coli atau

ragi). Karena PCR merupakan teknik in vitro, teknik ini dapat digunakan tanpa

memotong DNA, dan dapat dimodifikasi secara ekstensif untuk mengikuti aturan

luas manipulasi genetik (Fatchiyah dkk., 2012).

PCR ditemukan oleh Kary Mullis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum

yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai

keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan, identifikasi

sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas), deteksi

5

dan diagnosis penyakit infeksi, dan pembentukan organisme transgenik. PCR juga

digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi, ekologi,

biologi perkembangan, dan genetika (Binur, 2013).

Keuntungan menggunakan PCR adalah:

1. Deteksi dan identifikasi mikroorganisme secara cepat pada frekuensi yang

sangat rendah, mikroorganisme simbiotik, dan individu ikan dan larva

avertebrata;

2. Analisis cepat genom individu untuk mempelajari populasi;

3. Deteksi dan analisis "kejadian langka" yang terjadi pada fraksi sel kecil

dalam sampel jaringan atau kolesi lapangan; dan

4. Menduga kuaiitas air melalui deteksi virus, bakteri, dan/atau parasit

pathogen. Keuntungan lain PCR adalah mengurangi keperluan kultur yang

sering ditemukan untuk spesies atau jenis mikroba yang tidak dapat dikultur

untuk kepentingan ekologi atau biogeokimia.

Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan

kali dari jumlah semula, sekitar 106 - 10

7 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang

diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan

diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR

adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target

dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah dkk., 2012).

Tabel 1. Amplifikasi Geometrik (X=2n)

Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

10 1.024

20 1.048.576

30 1.073.741.824

Sumber : Fatchiyah dkk., 2012

2.2.1 Prinsip Dasar PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara

6

mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA

target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam

suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan

nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum

daerah target disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut

reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru

dikenal sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut

dalam teknik PCR diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis

Adenin), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine) (Muladno,

2010).

PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen, atau urutan

non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan dari DNA

cetakan. Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA sampai

10 kilo pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik dapat mengamplifikasi

fragmen berukuran sampai 40 kb (Binur, 2013).

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,

annealing dan ekstensi (pemanjangan) oleh enzim DNA polimerase. Taq DNA

polymerase diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada

tahun 1988. Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100° C, dan aktifitas

maksimal pada temperatur 70o - 72° C. Sepasang primer oligonukleotida yang

spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’

untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan (Fatchiyah

dkk., 2012).

PCR biasanya terdiri atas 20 sampai 35 siklus. Kebanyakan PCR dilakukan

dalam tiga tahap, yang didahului satu suhu tetap untuk awal dan diikuti satu

suhu lagi untuk akhir (Binur, 2013).

1. Tahap Inisiasi/Denaturasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering

dipanaskan pada suhu 94° - 96° C (atau 98° C jika menggunakan

polimerase termostabil), selama 1 - 9 menit. Ini berguna untuk menjamin

banyak cetakan DNA dan primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan

hidrogen basa-basa komplemen rantai DNA untuk menghasilkan rantai

tunggal DNA. Beberapa polimerase PCR juga membutukan kondisi tahap

7

ini untuk aktivasi (PCR awal-panas). Setelah itu, mulai siklus dengan

tahap satu pada 94° - 98° C selama 20 - 30 detik (tahap denaturasi).

2. Tahap annealing/Penempelan. Dalam tahap ini suhu reaksi diturunkan

sehingga primer dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal.

Gerakan Brownian menyebabkan primer bergerak di sekitar ikatan

hidrogen DNA-DNA yang secara konstan dibentuk dan diputuskan antara

primer dan cetakan. Ikatan stabil hanya terbentuk bila urutan primer sangat

sesuai dengan urutan cetakan. Bagian pendek DNA rantai ganda ini

dikatalisis oleh polimerase untuk memulai sintesis DNA. Suhu pada tahap

ini bergantung pada suhu leleh primer dan biasanya antara 50° - 64° C

selama 20 - 40 detik.

3. Tahap Ekstensi/Pemanjangan yaitu DNA polimerase memperpanjang

rantai DNA primer yang komplemen dengan rantai cetakan DNA. Suhu

pada tahap ini bergantung pada enzim DNA polimerase yang digunakan.

Polimerase Taq mempunyai suhu optimum 70° - 74° C. Umumnya reaksi

tahap ini menggunakan suhu 72° C. DNA polimerase melakukan

kondensasi gugus 5-fosfat dNTP dengan gugus 3'-hidroksil pada ujung

awal rantai DNA yang komplemen dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'.

Waktu pemanjangan bergantung pada DNA polimerase dan panjang

bagian DNA yang akan diampiifikasi. Tahap elongasi (peanjangan) akhir

selama 5 - 15 menit (tergantung panjang cetakan DNA) setelah siklus

terakhir dapat digunakan untuk menjamin DNA rantai tunggal sisa

diperpanjang seluruhnya. Akhirnya jaga suhu 4° - 15°C selama waktu

terbatas untuk penyimpanan singkat selama reaksi misalnya jika reaksi

dikerjakan semalam.

Secara ringkas, prinsip pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target

yang diinginkan melalui teknik PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu

95o

C, molekul DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai

ganda menjadi untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 50o

C sampai 60o

C,

primer, forward yang runutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu

untai tunggal akan menempel pada posisi komplemennya. Demikian juga primer

reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua primer

8

tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai

mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing-masing

primer pada suhu 72o

C. Proses ini disebut ekstensi. Dengan demikian, satu

molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA.

Setelah itu diulangi proses denatuasi, penempelan (annealing), ekstensi

(pemanjangan) yang disebut sebagai satu siklus. Proses PCR biasanya

berlangsung 35 - 40 siklus (Muladno, 2010).

Gambar 1. Siklus dasar PCR. A. Sistem tiga temperatur yang berbeda. B.

Kenaikan hasil amplifikasi menunjukkan pertumbuhan sigmoid

(Fatchiyah dkk., 2012).

9

2.2.2 Prosedur (Untuk Awal - Panas, Amplifikasi Rantai Ganda)

Reaksi PCR dilakukan dalam tabung reaksi kecil (volume 0.2 - 0.5 ml) yang

mengandung volume reaksi antara 15 - 100 µl, yang dimasukkan di dalam mesin

thermal cycler. Mesin memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi sesuai

dengan suhu yang diinginkan untuk setiap tahap reaksi. Kebanyakan mesin

memiliki penutup panas untuk mencegah kondensasi bagian dalam tutup tabung

reaksi. Kalau tidak, lapisan minyak dapat ditempatkan pada campuran reaksi

untuk mencegah evaporasi (Binur, 2013).

Menurut Binur (2013) PCR membutuhkan beberapa komponen dasar

seperti:

• DNA cetakan yang mengandung daerah bagian DNA yang akan

diamplifikasi.

• Satu atau lebih primer yang komplemen dengan bagian DNA pada ujung 5'

dan ujung 3' bagian DNA yang akan diamplifikasi.

• DNA polimerase (misalnya polimerase Taq atau DNA polimerase lain

dengan suhu optimum sekitar 70° C) digunakan untuk sintesis salinan DNA

bagian yang akan diamplifikasi.

• Deoksinukleotida trifosfat (dNTP) yang digunakan DNA polimerase untuk

membentuk DNA baru.

• Larutan buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang sesuai untuk

aktifitas dan kestabilan optimum DNA polimerase.

• Kation Divalen, ion magnesium atau mangan; umumnya menggunakan

Mg2+

, meskipun demikian Mn2+

dapat digunakan untuk mutagenesis DNA

PCR-mediated. Konsentrasi Mn2+

sangat tinggi dapat meningkatkan

kesalahan selama sintesis DNA.

• Kation Monovalen ion potassium.

2.3 Elektroforesis

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya

pengaruh medan listrik. Molekul DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat

ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan pada medan listrik akan

bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi molekul DNA tergantung

10

pada konsentrasi gel yang digunakan, ukuran molekul yang dianalisis, serta

tegangan listrik yang diberikan. Salah satu gel yang dapat digunakan pada

elektroforesis adalah gel agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA (Sambrook et al.,

1989).

Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh

komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion sangat

sedikit maka konduktifitas listrik sangat kecil dan migrasi DNA menjadi lambat.

Konsentrasi ion yang berlebih akan mengakibatkan gel mencair dan DNA

terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis, teknik elektroforesis DNA juga

memerlukan loading buffer. Buffer ini berfungsi meningkatkan densitas sampel

sehingga fragmen tersebut berada di dasar well dan tidak menyebar. Fungsi

lainnya adalah memberi warna pada fragmen DNA sehingga mempermudah

pengamatan proses elektroforesis. Buffer ini dapat juga membantu pergerakan

sampel ke anoda. Ukuran fragmen DNA hasil pemotongan dengan endonuklease

restriksi dapat ditentukan dengan memakai penanda DNA (marker). Penanda

DNA adalah fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya (Sambrook et

al.,1989).

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat

bermigrasinya molekul biologi dan untuk mencegah terjadinya difusi karena

timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Media penyangganya

bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media

penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas,

selulosa asetat dan gel. Gel yang dipakai dapat berupa pati, agarose ataupun

poliakrilamid. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang

banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Dalam perangkat

elektroforesis, gel diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk

menghubungkan kutub negatif dan kutub positif. Orientasi posisi gel dapat secara

vertikal dan horisontal atau disebut sebagai submarine (Fatchiyah dkk., 2012).

2.3.1 Prinsip Dasar Elektroforesis

11

Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda

negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel tergantung

pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh

pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi. Sebaliknya, protein

dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek

dengan kata lain mobilitisnya rendah. Berbagai jenis protein pada suatu sampel

akan terseparasi (terpisah-pisah) pada gel tergantung pada mobilitasnya. Protein

dengan mobilitas tinggi akan berhenti bergerak pada bagian yang lebih bawah

gel, sedangkan protein dengan mobilitas rendah cenderung berhenti bergerak

pada bagian atas gel. Dengan demikian, pada jalur pergerakan protein akan

didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band atau pita protein) yang sudah

terseparasi berdasarkan berat molekulnya. Dalam satu sampel protein bisa lebih

dari satu bahkan puluhan band dalam gel poliakrilamida. Dalam kondisi tidak

diwarnai, protein tersebut tidak terlihat karena memang protein dalam sampel

tidak berwarna. Setelah diwarna dengan staining solution yang mengandung

Coomassie brilliant blue R-250, protein yang tidak berwarna tersebut menjadi

berwarna biru karena mengikat Coomassie blue. Dalam kondisi ini kita bisa

mengetahui keberadaan dan mengukur mobilitas protein untuk kemudian

ditentukan berat molekulnya (Fatchiyah dkk., 2012).

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada

pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada

dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan

bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. pH bufer elektroforesis berkisar

8 - 9 yang akan menyebabkan sebagian besar protein bermuatan negatif yang

akan bergerak ke anoda. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk

memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya (Fatchiyah dkk., 2012).

Elekroforesis gel DNA yang berukuran besar biasanya menggunakan

elektroforesis gel agarosa. Hasilnya dapat dianalisis secara kuantitatif melalui

visualisasi gel dengan cahaya ultra violet dan peralatan gambamya. Gambar

direkam dengan kamera yang dioperasikan dengan computer dan intensitas pita

diukur dan dibandingkan dengan DNA baku atau penanda yang dimasukkan

12

pada gel yang sama. Pengukuran dan analisis kebanyakan dilakukan dengan

perangkat lunak khusus (Binur, 2013).

Perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh persentase agarosa, waktu

elekroforesis, konsentrasi Etidium Bromide, derajat superkoil dan ukuran serta

kompleksitas DNA. Peningkatan konsentrasi agarosa gel mengurangi kecepatan

migrasi dan kemampuan memisahkan molekul DNA lebih kecil. Lebih tinggi

voltase, lebih cepat migrasi DNA. Tetapi volstase dibatasi oleh panas dan

akhirnya dapat menyebabkan gel meleleh. Voltase tinggi juga mengurangi

resolusinya (di atas 5 sampai 8 V/cm). Molekul lebih pendek bergerak lebih

cepat daripada molekul lebih panjang (Binur, 2013).

Pada elektroforesis dalam matriks gel poliakrilamid, protein terseparasi

ketika protein bergerak melalui matriks tiga dimensi dalam medan listrik.

Matriks poliakrilamid berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran

dan menstabilkan pH bufer agar muatan protein tidak berubah. Poliakrilamid

dapat memisahkan protein dengan kisaran berat molekul 500 - 250.000 atau

polinukleotida dengan kisaran 5 - 2000 pasang basa. Pori matriks ini terbentuk

dari ikatan silang antara akrilamid dan bisakrilamid. Ukuran pori pada gel

poliakrilamid dapat dikecilkan dengan cara meningkatkan persentase total

akrilamidatau dengan meningkatkan banyaknya ikatan silang dengan

bisakrilamid (Fatchiyah dkk., 2012).

13

BAB III

METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 3 – 6 Desember 2013 yang

bertempat di Laboratorium Bioteknologi Universitas Negeri Papua. Ekstraksi

DNA dilakukan pada tanggal 3 Desember 2013 pukul 10.20 - 12.30 WIT, PCR

dilakukan pada tanggal 5 Desember 2013 pukul 08.00 - 10.30 WIT dan

Elektroforesis dilakukan pada tanggal 6 Desember 2013 pukul 08.00 - 10.30 WIT.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Ekstraksi DNA

No. Alat Bahan

1 Vorteks Sampel (Kaki Renang Udang Galah)

2 Mikrosentrifuge Larutan ekstraksi Chelex 10%

3 Alkohol burner Sarung tangan

4 Heating block Alkohol

5 Timer Tisu

6 Spiner

7 Pinset

8 Gelas piala

9 Pulpen waterproff

10 Lembar kerja Chelex

11 Microtube

3.2.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)

No. Alat Bahan

1 Mesin PCR (Thermal cycler) DNA template (Sampel hasil ekstraksi)

2 Micropipet eppendrof Kontrol positif dan kontrol negatif

3 Tip pipet ddH2O

4 Tube PCR + Rak 10 x PCR Buffer (PE-II)

5 Kalkulator dNTPs (8 µM)

6 Alat tulis MgCl2 (25 mM)

7 Lembar kerja PCR Primer 1 foward (10 mM)

8 Kotak sampah Primer 2 reverse (10 mM)

9 Pulpen waterproff PE Amplitaq (5 units/µL)

10 Mikrosentrifuge/Spiner

11 Sarung tangan

14

3.2.3 Elektroforesis

No. Alat Bahan

1 UV transluminator Agarose

2 Micropipet eppendrof TAE Buffer

3 Tip pipet EtBr (Ethidium Bromida)

4 Neraca digital ddH2O

5 Tabung Erlenmeyer Produk smapel PCR

6 Mikrowave Parafilm

7 Spatula Loading dye

8 Kamera digiatl DNA ladder

9 Sarung tangan putih + biru

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Ekstraksi DNA

1. Menggunakan sarung tangan dan mengambil sejumlah sampel udang galah

yang akan diekstraksi.

2. Mengambil microtube yang berisi 0,65 mL Chelex dari lemari pendingin

sebanyak jumlah sampel yang akan diekstraksi.

3. Mengisi lembar kerja Chelex dengan jenis Sampel, Tanggal, Metode

Ekstraksi, Kode Sampel, dan Lokasi pengambilan sampel, kemudian

menandai tabung (microtube) Chelex sesuai dengan daftar sampel dalam

lembar kerja Chelex dengan menuliskan kode sampel pada tutup tabung

dan tanggal ekstraksi di samping tabung.

4. Menghidupkan heating bock dan mengaturnya hingga suhu 95o

C.

5. Menuangkan alkohol 96% ke dalam gelas piala untuk mencuci penjepit

(pinset).

6. Memasukkan pinset dalam alkohol lalu memanaskan dengan alkohol

burner dan mengulaginya sebanyak 3 kali.

7. Menggunakan penjepit steril, mengambil potongan kecil dari jaringan

sampel, membuka tutup tabung Chelex, memasukkan potongan sampel

sebesar titik (.) ke dalam tabung Chelex yang sudah ditandai, lalu tabung

ditutup kembali.

8. Mengulangi langkah 6 - 7 di atas untuk setiap sampel dengan tabung

chelex baru, memastikan penjepit tetap steril dengan tiga kali pemanasan

dengan dicelupkan terlebih dahulu kedalam alkohol antara sampel-sampel.

9. Setelah selesai, sampel-sampel dalam Chelex diaduk secukupnya selama

15 detik dan sampel-sampel dispin (diputar) selama 20 detik dengan

kecepatan tinggi dalam microsentrifuge.

10. Sampel diinkubasi selama 30 menit pada suhu 95o

C dalam heating block.

11. Setelah selesai, sampel-sampel tersebut diaduk atau digoyang getar lagi

secukupnya selama 15 detik dan sampel-sampel dispin (diputar) selama 20

detik dengan kecepatan tinggi dalam microsentrifuge.

15

12. Sampel siap digunakan untuk Reaksi PCR dan lebih baik jika disimpan

dulu selama semalam dalam freezer.

3.3.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)

1. Keluarkan reagen: ddH2O, dNTPs, buffer PCR, MgCI2, Primer 1, dan

Primer 2 dari freezer untuk mencairkan.

2. Mengisi formulir Hotstart PCR (24 µL) dengan mengisi tanggal, locus,

primer, Nama, dan Spesies sampel.

3. Menghitung dan menggandakan volume dari protokol baku dalam formulir

Hotstart PCR untuk membuat Master Mix (MM1 dan MM2) sebanyak jumlah

sampel yang digunakan ditambah dengan dua buah kontrol dan dilebihkan satu

untuk menghindari kekurangan pada saat digunakan.

4. Menandai dan menomori tabung PCR dalam rack, mengatur sampel

sehingga berada dalam pola yang berhubungan dengan tabung PCR yang

ditandai, serta mengatur tabung ekstra untuk kontrol.

5. Membuat campuran Master Mix (MM1) gunakan pipet NO DNA,

tambahkan bahan sesuai dengan volume yang telah dihitung dalam daftar

di lembar PCR di tabung 1.5 mL. Menggunakan tip berbeda untuk setiap

penambahan reagen. Pipet naik dan turun untuk mencampur reagen

sepenuhnya.

6. Menggunakan pipet NO DNA untuk membagi 14 µL MM1 ke dalam

setiap tabung PCR dan menambahkan 1 µL DNA template (hasil

ekstraksi) untuk setiap tabung. Sampel-sampel ini termasuk DNA ekstrak,

control positif PCR dan control negative Chelex. Ambil dari atas setiap

ekstrak Chelex karena tambahan butiran Chelex akan menghambat PCR.

Selau mengganti tip baru untuk setiap sampel.

7. Mengambil Taq dari freezer. Mengunakan pipetteman Enzim, mengambil

Taq sesuai dengan jumlah yang diinginkan dari bagian paling atas cairan.

Mengembalikan Taq ke freezer. Dengan hati-hati menambahkan Taq ke

MM2. Pipet naik turun untuk mencampur. mengamati hilangnya gliserol

dalam larutan.

8. Memilih dan memulai program hot-star PCR. Membiarkan penutup panas

dan menahan sebentar bila suhu mencapai 80° C.

9. Menempatkan strip tabung ke dalam mesin PCR (memastikan semua

tertutup untuk mencegah penguapan reaksi PCR).

10. Dengan pipet DNA rendah, mengatur 10 µL pipetman, pipet naik turun

MM2 untuk mencampur campuran master. Kemudian, dalam satu waktu,

membuka tutup tabung, menambahkan MM2, pipet naik turun, dan

menutup kembali. Mengulangi untuk setiap tabung dan mengganti tip

untuk setiap sampel.

16

11. Memeriksa kembali untuk memastikan semuanya telah tertutup. Unpause

program dan lihat layar mesin PCR untuk menjamin bahwa mesin PCR

sedang bekerja.

12. Membersihkan tempat kerja, meletakkan reagen ke dalam freezer dan

ekstrak DNA ke dalam lemari pendingin.

3.3.3 Elektroforesis

1. Membuat gel agarosa 2% dengan cara menyiapkan erlenmeyer,

menimbang 0,8 gram agarosa dan memasukkan ke dalam erlenmeyer,

kemudian menambahkan 40 ml TAE Buffer.

2. Memanaskan dalam microwave dan mengecek setiap menit serta

mengaduk-aduk (dengan menggoyang-goyang erlenmeyer) hingga jernih.

3. Mengambil dan mengaduk lagi, kemudian menyiapkan cetakan agarosa

dan sisir pembuat sumur.

4. Menuangkan gel agarosa ke dalam cetakan, dan meratakan serta

memastikan tidak ada gelembung dan kotoran di dalam gel. Mendiamkan

selama kurang lebih 30 menit sampat memadat.

5. Setelah dingin dan padat, melepar sisir dan memasukkan gel yang telah

jadi beserta cetakanya ke dalam tangki elektroforesis yang telah bereisi

buffer.

6. Mengambil parafilm, kemudian meneteskan loading dye di atas parafilm,

kira-kira volumenya 1 µL.

7. Mengambil 4 µL DNA PCR produk, kemudian mencampurkan dengan

loading dye, dan mengambil menggunakan pipet serta memasukkan ke

dalam sumur gel nomor dua yang berada dalam tangki elektroforesis.

8. Setelah semua sampel selesai, memasukkan DNA ladder atau penanda

pada sumur nomer 1 masing-masing baris, lalu tutup tangki tersebut.

9. Mensetting mesin pada voltase 200 V dan arus 72 mA dan waktu 15

menit, kemudian jalankan mesin.

10. Setelah selesai, ambil jel dan rendam selama 15 menit dalam larutan EtBr

lalu cuci dengan ddH2O. Selalu menggunakan sarung tangan berwarna

biru dalam melakukan langkah ini.

11. Setelah selesai, mengambil jel dan meletakkan di atas box UV

transluminator, kemudian tutup box kaca UV, dan nayalakan lampu UV.

12. Melihat adanya pita terang pada sampel yang positif mengandung DNA

dan berhasil diamplifikasi dengan PCR.

13. Mengambil kamera dan memfoto gel, setelah itu membuang gel ke dalam

box tempat pembuangan gel.

14. Membersihkan semua lokasi yang digunakan untuk bekerja.

17

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum

4.1.1 Ekstraksi DNA

Tabel 2. DNA Extraction Data Sheet

Samples : Udang Galah Date : 03 Desember 2013

Extraction Mthod : Chelex

Tube

Type

Number Locality PCR Col

Seq

Other

UGMK02 Merauke

UGMK03 Merauke

UGMK06 Merauke

UGMK07 Merauke

UGMK08 Merauke

UGMK11 Merauke

UGMK13 Merauke

UGMK14 Merauke

UGMK15 Merauke

UGMK16 Merauke

UGJA03 Jayapura

Supernatan/DNA template

Chelex

(a) (b)

Gambar 2. a. Sampel udang galah; b. Hasil ekstraksi DNA

4.1.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)

Tabel 3. Perhitungan penggandaan Master Mix untuk: 7 tubes (Bidik Misi)

STANDART PROTOCOL

( 1 µL of Template DNA) Total MM1 MM2 ACTUALPROTOCOL

( 1 µL of Template DNA) MM1 MM2

ddH2O 14,5 5,5 9 ddH2O 38,5 63 10 x PCR Buffer (PE-II) 2,5 1,5 1 10 x PCR Buffer (PE-II) 10,5 7 dNTPs (8 µM) 2,5 2,5 -- dNTPs (8 µM) 17,5 -- MgCl2 (25 mM) 2,0 2,0 -- MgCl2 (25 mM) 14 -- Primer 1 foward (10 mM) 1,25 1,25 -- Primer 1 foward (10 mM) 8,75 --

18

Primer 2 reverse (10 mM) 1,25 1,25 -- Primer 2 reverse (10 mM) 8,75 -- PE Amplitaq (5 units/µL) 0,125 -- 0,125 PE Amplitaq (5 units/µL) -- 0,875 Total 24 14 10,125 Total 98 70,875

Gambar 3. Setingan Siklus Reaksi Polimerasi dalam Thelmal Cycler

Gambar 4. Hasil PCR

4.1.3 Elektroforesis

(a) (b)

Gambar 5. Hasil elektroforesis produk PCR pada gel agarosa

dilihat dengan sinar UV

4.2 Pembahasan

Pada praktikum kali ini kami telah melakukan analisis DNA dari udang galah

sebanyak 11 sampel, yang dibagi menjadi 7 sampel kelompok Bidik Misi dan 4

sampel kelompok umum. Rangkaian kegiatan dalam praktikum ini dimulai dari

Ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase (PCR) dan diakhiri dengan

Elektroforesis.

DNA

Ladder

19

Ekstraksi DNA

Teknik ekstraksi yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah teknik

Chelex. Teknik ini hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR. Meskipun

memiiiki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan efektif untuk

ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA karena tidak

membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan menghasilkan

kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks PCR.

Teknik Chelex umumnya mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan

prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk spesimen,

kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,

magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya.

Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memasukkan potongan

jaringan sampel dengan ukuran seperti sebuah titik (.) ke dalam larutan Chelex.

Pemotongan yang terlalu besar dapat menghambat reaksi. Setelah itu larutan

dispin (diputar) dan dipanaskan dengan suhu 95oC selama 30 menit. Pemanasan

tersebut membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein. Seluruh kegiatan

ekstraksi dilakukan dalam kondisi steril untuk menghindari kontaminasi. Selain

itu, Chelex juga dapat melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel dari

kontaminan. Setelah pemanasan selesai, larutan dispin kembali dan akan

menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan

supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex.

Supernatan tersebut merupakan bagian yang akan digunakan dalam reaksi PCR.

Reaksi Polimerase Berantai (PCR)

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction

(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi

nukleotida secara in vitro. PCR adalah teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi

bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA yang telah

diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler untuk isolasi

dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran DNA melalui

replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti E. coli atau

ragi).

20

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis

molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut

melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermo

Cycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida

yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target

disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut reverse. Enzim

yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai

enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR

diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP

(Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine).

Dalam satu tube reaksi PCR harus mengandung beberapa komponen, yaitu

DNA template (sampel hasil ekstraksi) 1 µL dan komponen campuran 24 µL,

sehingga dalam satu tube volume total yang dibutuhkan adalah 25 µL.

Komponen-komponen campuran tersebut antara lain ddH2O 14,4 µL, 10 x PCR

Buffer (PE-II) 2,5 µL, dNTPs (8 µM) 2,5 µL, MgCl2 (25 mM) 2 µL, Primer

forward (10 mM) 1,25 µL, Primer reverse (10 mM), dan PE Amplitaq (5

units/µL) 0,125 µL. Komponen ddH2O merupakan air steril atau air yang bebas

molekul. Dalam reaksi PCR, dibutuhkan buffer sebagai penyangga reaksi.

Deoxyribonukleat Tri Phospat (dNTPs) merupakan komponen yang penting

dalam berjalannya reaksi PCR. Kedua primer digunakan untuk menginisiasi reaksi

PCR dari ujung 3’ ke 5’ dan sebaliknya. Yang paling penting dalam reaksi PCR

adalah enzim polymerase, contohnya PE Amplitaq.

Dalam mengerjakan reaksi PCR, selain sampel juga dibutuhkan suatu DNA

control positif dan DNA control negatif. DNA control positif merupakan suatu

DNA template yang sebelumnya telah berhasil dikerjakan dalam reaksi PCR,

sedangkan DNA control negatif merupakan hasil ekstraksi yang tidak

mengandung sampel yang digunakan untuk mengetahui adanya kontaminan antar

sampel. Selain itu komponen-komponen PCR harus dipisahkan dalam bentuk 2

buah Master Mix, yaitu MM1 dan MM2 untuk memudahkan langkah pengerjaan

PCR. Pemisahan ini harus dihitung dengan mengalikan jumlah tube yang

21

diinginkan dengan faktor perkalian yang telah ditentukan pada MM1 dan MM2.

Hal ini tergantung metode PCR yang digunakan.

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,

annealing dan ekstensi (pemanjangan). Sesuai profil yang digunakan seperti

dalam gambar 3, proses berjalanya siklus PCR dalam Thermal Cycler dapat

dijelaskan sebagai berikut. Langkah awal proses didahului dengan tahap

pradenaturasi yaitu pemanasan sampai suhu 80o C. Pada suhu 94

o C, molekul

DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai ganda menjadi

untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 50o C, primer forward yang runtutan

nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel

pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reversenya akan menempel

pada untai tunggal lainnya. Proses ini disebut annealing. Setelah kedua primer

tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai

mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing-masing

primer pada suhu 72o C. Proses ini disebut ekstensi/pemanjangan. Dengan

demikian, satu molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul

DNA. Setelah itu proses denatuasi, penempelan (annealing), ekstensi

(pemanjangan) tersebut diulangi sebagai suatu siklus. Dalam proses PCR yang

telah kami lakukan, siklus tersebut diulang sebanyak 38 siklus. Hasil PCR

tersebut kemudian diverifikasi keberhasilannya menggunakan elektroforesis.

Elektroforesis

Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose, karena dengan

menggunakan gel agarose teknik yang digunakan cukup sederhana, dan mudah

penanganannya. Selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan

dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000

pb. Penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari

DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Ethidium

Bromida (EtBr) sebagai pewarna. EtBr nantinya akan berinteraksi dengan basa

dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu

UV. Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita

DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.

22

Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk

memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul

DNA/RNA. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel

DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA ladder) yang telah diketahui

ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah terlebih dahulu direndam di dalam larutan EtBr sebelum

dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Dalam proses elektroforesis yang telah dilakukan, sampel molekul DNA yang

telah dicampur dengan larutan loading dye ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik

dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel

tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai

dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju

elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat

yang dimilikinya. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses

pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi.

Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat

pewarnanya.

Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet, apabila proses PCR berhasil maka

akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel. Satu

lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Penanda (marker) atau

DNA ladder yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda

dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan

mengelektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel.

Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk

menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap

logaritma ukuran molekul.

23

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-

langkah kerja analisis DNA. Teknik Chelex adalah metode ekstraksi yang cepat

dan efektif menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji

kompleks PCR. Teknik Chelex mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan

prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk spesimen,

kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,

magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya yang

menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan

supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex.

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis

molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut

melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermo

Cycler. Dalam satu tube reaksi PCR harus mengandung beberapa komponen,

yaitu DNA template (sampel hasil ekstraksi) 1 µL dan komponen campuran antara

lain ddH2O 14,4 µL, 10 x PCR Buffer (PE-II) 2,5 µL, dNTPs (8 µM) 2,5 µL,

MgCl2 (25 mM) 2 µL, Primer forward (10 mM) 1,25 µL, Primer reverse (10

mM), dan PE Amplitaq (5 units/µL) 0,125 µL. Proses PCR merupakan proses

siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi/pemanjangan

dengan pengulangan sebanyak kurang lebih 38 siklus.

Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk

mengidentifikasi atau memverifikasi keberhasilan reaksi PCR molekul DNA.

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Molekul

DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui

matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran molekulnya, makin

rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan

dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen

24

molekul DNA standar (DNA ladder) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi

DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih

dahulu direndam di dalam larutan EtBr sebelum dipaparkan di atas sinar

ultraviolet.

5.2 Saran

1. Sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum harus dilakukan dengan

tepat dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat

mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini

terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah

ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum.

2. Seluruh kegiatan analisis DNA harus dilakukan secara aseptis dan steril

agar tidak terjadi kontaminasi yang dapat mempengaruhi hasil reaksi.

3. Praktikan harus berhati-hati saat melakukan perendaman dalam EtBr dan

visualisasi dengan sinar UV, karena kedua hal tersebut sangat berbahaya

bagi kesehatan apabila dilakukan dengan ceroboh.

25

DAFTAR PUSTAKA

Anam K. 2010. Isolasi dan Pemetaan DNA Plasmid. Bogor : Bioteknologi

Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Binur, Robi. 2013. Panduan Praktikum Biologi Molekuler. Manokwari: Jurusan

Biologi FMIPA UNIPA

Fatchiyah dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler. Malang:

Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler FMIPA Universitas

Brawijaya.

Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction. Surabaya: Pusat Studi Bioteknologi.

Universitas Surabaya.

Jusuf, Muhammad. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bandung: ITB.

Juwita dan Sinaga, Rika Nailuvar. 2012. Laporan Praktikum Isolasi DNA dan

Teknik PCR. Medan : USU Resepstory.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Geneitika. Bogor : IPB Press

Maulana, Ridwan. dkk. 2010. Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA. Jakarta:

Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA UPI

Prasetyoputri, Anggia. 2005. Bengkel Ilmu Genetik. Jakarta: Erlangga.

Sutomo, Juanda. 2002. Genetika Lanjutan Universitas. Jakarta: Erlangga.

Walsh, PS, Mezger, D.A., Higuchi, R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple

extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.

Biotechniques.