ISSN No.2355-9292 Jurnal Sangkareang Mataram|27

http://www.untb.ac.id Volume 2, No. 3, September 2016

DETEKSI MOLEKULER STAPHYLOCOCCUS AUREUS SEBAGAI PENYEBAB MASTITISPADA PAYUDARA

Oleh:

I Gst. Ag. Ayu Hari TriandiniDosen Akademi Kebidanan Bhakti Kencana Mataram

AbstrakInfeksi payudara mastitis merupakan peradangan pada payudara. Penyebab infeksi tersebut umumnya adalahStaphylococcus aureus. Mastitis diakibatkan oleh sumbatan saluran susu yang berlanjut. Penelitian inidilakukan untuk mengetahui dasar-dasar teknik deteksi molekuler bakteri penyebab infeksi khususnya S.aureus guna menegakkan diagnosis. Teknik-teknik deteksi molekuler yang umum dilakukan yaitu analisisDNA genom, analisis DNA plasmid dan analisis protein. Ketiganya bermanfaat dalam identifikasi molekulermikrobia serta rekayasa genetika mikrobia.

Kata kunci: Staphylococcus aureus, mastitis, deteksi, molekuler

PENDAHULUAN

Mastitis adalah suatu rasa sakit yang terjadipada payudara yang ditandai dengan gejala payudaratampak merah, panas dan sakit (meradang). Mastitisberbeda dengan saluran tersumbat, karena salurantersumbat bukanlah infeksi, sehingga tidak perludiobati dengan antibiotik. Bakteri penyebab infeksimastitis adalah S. aureus. Staphylococcus aureusselain menimbulkan mastitis juga mampumenimbulkan berbagai macam kasus penyakit padamanusia antara lain infeksi kulit, keracunanmakanan, endokarditis, pneumonia, osteomielitis,sepsis artritis dan encephalitis (Tsen et al., 2002).Deteksi molekuler umumnya diperlukan untukidentifikasi mikrobia misalnya membedakan strainMRSA dan strain S. aureus yang lain sehingga dapatdiaplikasikan pada penanganan selanjutnya. DiIndonesia, masih menggunakan deteksikonvensional untuk mendiagnosis suatu penyakitinfeksi. Metode-metode dasar yang dilakukan dalamdeteksi molekular penting diketahui agar dapatmengefektifkan pemeriksaan.

METODE

a. Kultur S. aureusStaphylococcus aureus dikultur dalam medium

BHI, digojog pada suhu 37˚C semalaman.

b. Analisis DNA Genom

1. Isolasi DNA Genom

15 mL kultur S. aureus disentrifugasi 3000 rpmselama 15 menit pada suhu kamar. Supernatandibuang, pellet ditambahkan 750 µL buffer lysis,divortex dan ditambahkan Proteinase K 20 µL (10mg/mL) kemudian digojog kuat selama 30 menitdengan shaker (420 rpm). Tabung kemudiandiinkubasi pada suhu 55˚C selama 30 menit dalamwaterbath dan selanjutnya disentrifugasi pada 3000rpm selama 10 menit. Fenol 500 µL ditambahkan kedalam campuran dan digojog 15 menit. Campurankemudian disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menitdisertai etanol absolut dingin dengan perbandingan1:1 sampai 1:2 hingga terbentuk benang-benangDNA. Benang-benang DNA diambil, dicuci denganetanol 70% kemudian disentrifugasi 12000 rpmselama 10 menit. Supernatant dibuang. DNAdikeringanginkan. Buffer TE 250 µL dimasukkan kedalam campuran atau disesuaikan dengan banyaknyaDNA. DNA siap dielektroforesis.

2. Analisis Kuantitatif dan Kualitatif DNA Genom

Analisis kualitatif DNA menggunakanelektroforesis sedangkan analisis kuantitatif DNAmenggunakan spektrofotometer pada λ = 260 nmdan λ= 280 nmKonsentrasi DNA = OD 260 x konstanta (50) xfaktor pengenceranKemurnian = OD 260/ OD 280, jika kurang dari 1,8maka kontaminasi protein, jika lebih dari 1,8 makakontaminasi RNA.3. Amplifikasi DNA Genom dengan PCR

28|Jurnal Sangkareang Mataram ISSN No.2355-9292

Volume 2, No. 3, September 2016 http://www.untb.ac.id

Amplifikasi DNA menggunakan bead ready togo. Dengan menggunakan primer Box A1R (5pmol/µL).

Program PCR:

94˚C 4 menit

92˚C 1 menit

50˚C 1 jam 30 menit (annealing)

68˚C 8 menit

12˚C 10 menit

Sebanyak 30 siklus

Running di gel agarose 2%, 100 V 30 menit

4. Elektroforesis dengan Gel PolyacrylamidGel yang disiapkan ada dua macam yaitu

gradient gel/separating gel 10% SDS PAGE danstacking gel 5% SDS PAGE. Bahan gradient geldicampur, kemudian dituang secara cepat kecetakan. Setelah dingin/mengeras, bahan stackinggel yang telah dicampur dimasukkan ke dalamcetakan bagian atas, untuk menghilangkangelembung ditambahkan larutan butanol. Sisirdipasang dan dilepas kembali setelah stacking gelmembeku, untuk menghilangkan larutan butanol,dicuci dengan aquades. Sumuran siap di-loadingdengan larutan sampel yang akan di-running.Sementara itu, 8 µl sampel dan 2 µl buffer 5xdimasukkan dalam ependorf, dipanaskan dalam airmendidih selama 2 menit dan selanjutnya sampelsiap di-running dalam SDS PAGE. Proses runningdilakukan selama 1,5 sampai 2 jam atau sampailarutan sampel dalam sumuran yang berwarna biruberada di bagian batas bawah gel polyacrylamid ataubagian kutub positif dengan tegangan 100 volt. Hasilelektroforesis kemudian diberi perlakuan silverstaining:

c. Analisis DNA Plasmid

1. Isolasi DNA Plasmid

Diambil 1-2 koloni bakteri dari lempeng agar,dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi 5 mLLB medium dan antibiotik yang sesuai. Tabungdigojog kuat-kuat dalam shaker inkubator 37˚C,semalaman dan disentrifuge 12.000 rpm selama 10menit. Supernatan dibuang, pellet disuspensikandengan 100 µL lysate solution I. (diamkan dalam esselama 5 menit). Ditambahkan 200 µL lysing

solution II (baru), kemudian dicampurkan denganmembolak-balikkan tabung (diamkan dalam esselama 5 menit). 150 µL lysing solution III,ditambahkan ke dalam campuran dan disentrifugasi12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambildan pellet dibuang. Ditambahkan phenol CIAA samabanyak dengan volume supernatan. Kemudiandisentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit.Ditambahkan 1/10 volume 3 M Na asetat dan 1:1etanol absolut dingin homogenisasi dan diamkandalam -20˚C selama 10 menit dilanjutkan dengansentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10menit. Pellet dicuci dengan etanol 70%, diinkubasi 1menit. Supernatan dibuang, pellet dikeringkan.Ditambahkan TE 50µL. DNA siap dielektroforesis.

2. Transformasi Plasmid dengan TSS

Bakteri disentrifugasi 2500 rpm selama 10menit pada suhu 4˚C. Cairan dibuang, pada pelletditambahkan 1 mL 2x TSS (disuspensikan). 100 µLkultur bakteri diambil tambahkan DNA plasmid(pUC) 2-3µL dicampur dan diinkubasikan ke dalames/ suhu 4˚C selama 45 menit heat shock 42̊ Cselama 90 detik. Ditambahkan 500 µL TSS 1x danpastikan TSS dingin dan diinkubasi pada suhu 37˚Cselama 1 jam dan diinokulasi 100 µL, 50 µL dan 25µL pada media seleksi (LB medium+antibiotic).Diinkubasi semalam pada suhu 37˚C.

d. Analisis Protein

1. Isolasi Protein:

Supernatan S. aureus ditambahkan 9 mL bufferPBS dan diresuspensi. Sentrifugasi pellet dansupernatant pada kecepatan 3000 rpm dengan suhu4˚C selama 15 menit. Pelet kemudian ditambahkan 1mL buffer PBS dan diresuspensi. Supernatanditambahkan 9 mL buffer PBS dan diresuspensi lagi.Sentrifugasi pellet dan supernatan pada kecepatan3000 rpm dengan suhu 4˚C selama 15 menit. Peletkemudian ditambahkan 0,5 mL buffer PBS dandiresuspensi. Sonikasi 6x selama masing-masing 30detik. Sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpmselama 5 menit (pellet dibuang). Supernatan (proteinintraseluler) disimpan pada suhu -20˚C.

2. Membuat Kurva Standar BSA (bovine serumalbumin)

Dalam penentuan kadar protein suatu sampel,diperlukan suatu kurva standar kadar protein. Kurvaini diperoleh dengan terlebih dahulu menyiapkanlarutan standar protein berupa bovine serum albumin(BSA) dari stok yang berkadar 1 mg/mL.

denaturasi

ekstensi

ISSN No.2355-9292 Jurnal Sangkareang Mataram|29

http://www.untb.ac.id Volume 2, No. 3, September 2016

No. dH2O (µL) BSA (1mg/mL) (µL)

BradfordAssay (µL)

1. 800 - 2002. 799 1 2003. 798 2 2004. 796 4 2005. 792 8 2006. 784 16 2007. 768 32 200

Running SDS PAGE dibutuhkan 15 µL proteinper sumuran. Dari 100 µL protein diambil 25 µL dandiberi sample buffer 5x, direbus selama 2 menit dandimasukkan dalam es.Pengukuran Konsentrasi Protein:Blanko = 800 µL dH2O +200 µL Bradford ProteinAssay = 1000 µLSampel = 798 µL dH2O + 2 µL protein + 200 µLBradford = 1000 µLDibaca pada spektrofotometer UV vis denganpanjang gelombang 595 nm.

3. Elektroforesis Protein dengan SDS PageSampel buffer ditambahkan ke dalam sampel

protein (perbandingan 1:1) dalam tabung Eppendorf.Sampel dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5menit. Setelah dingin, sampel disimpan pada suhu20˚C bila sampel tidak langsung dipakai. Separatinggel 10% dan stacking gel 5% disiapkan dan sampeldimasukkan pada sumur gel kemudian runningsampel.

4. Pewarnaan gel dengan Comassie Briliant Blue(CBB)Untuk tahap ini diperlukan larutan staining

untuk mewarnai protein pada gel dan larutandestaining untuk menghilangkan warna pada gel danmemperjelas pita protein yang terbentuk. Gel hasilelektroforesis direndam secara bergiliran padalarutan staining dan destaining.

5. Pewarnaan SilverGel dilepas, tambahkan 40 mL asam asetat 10%

dan dishaker selama 1 jam pada suhu kamar ataupada suhu 4˚C semalaman. Asam asetat dibuang, geldicuci dengan H2O, 3 x 2 menit atau 3 x 5 menit(penyimpanan 4˚C). Tambahkan larutan staining(AgNO3 0,15% dan formaldehyde 0,056%), dishakerselama 45 menit pada suhu kamar dalam kondisigelap. Larutan staining dibuang, gel dicuci H2Oselama 15 detik dan dimasukkan larutan developing(3% Na2HCO3, 0,056% formaldehyde, 0,0002%sodium thiosulfate) kemudian dishaker/ goyang padasuhu kamar. Setelah band tampak jelas, ganti larutandeveloping. Pewarnaan dihentikan dengan 10% asamasetat.

HASIL

a. Analisis DNA Genom dan Plasmid

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNAdari kandungan biomolekul lainnya serta menjagakeutuhan struktur primernya. Secara umum,prosedur dasar isolasi DNA terdiri dari: perusakansel (lisis sel) serta ekstraksi, presipitasi dan pelarutanDNA. Analisis kuantitatif DNA dilakukan untukmengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yangdidapatkan. Hasil spektrofotometri menunjukkandata sebagai berikut:OD 260 = 0,3041OD 280 = 0,1616Ratio OD = 1,8821Konsentrasi DNA genom yang diperoleh = 0,3041 x50 x 100 = 1520,5 µg/mLTingkat kemurnian DNA dapat dilihat dari rasiokonsentrasi aliquot DNA pada absorbansi 260 nmdibandingkan dengan konsentrasi aliquot DNA padaabsorbansi 280 nm. Jika rasio kurang dari 1,8menunjukkan adanya pengotor protein atau fenol,sedangkan lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA.Uji kualitatif dengan gel agarose dapat digunakanuntuk mengetahui keberadaan DNA dan jugamengukur kualitas kemurnian isolasi DNA.

Gambar 1. Hasil Isolasi DNA Genom

Gambar 2. Hasil Elektroforesis DNA Genom S.aureus

30|Jurnal Sangkareang Mataram ISSN No.2355-9292

Volume 2, No. 3, September 2016 http://www.untb.ac.id

Sesuai hasil yang diperoleh pada gambar 2,diperoleh bahwa DNA yang dihasilkan masih murnikarena ratio OD = 1,8821 dan tidak adanya smearpada band elektroforesis. Hasil isolasi DNA plasmidyang didapat seperti tertera pada gambar 3 yaitumenunjukkan bentuk DNA plasmid linear. Dalampenelitian ini digunakan bead PCR ready to go yaitumerupakan reagen pre-mixed, pre-dispensed PCRyang dikemas dalam bentuk bead (bola pejal).Dalam bead mengandung stabilizer,deoxynucleotides, 1-1.5 unit Taq polymerase danbuffer (50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 dan 10 mMTris-HCl pH 9.0 pada suhu kamar). Bahan tambahanyang perlu disediakan adalah template, primer dandH2O.

Gambar 3. Hasil Elektroforesis DNA Plasmid S.aureus

Siklus PCR secara umum terdiri dari (Yuwono,2006):1) Denaturasi yaitu untai ganda DNA terpisah menjadi

masing-masing untai tunggal.2) Annealing yaitu terjadi pengenalan/penempelan

primer cetakan DNA, Suhu annealing disesuaikandengan template DNA. Umumnya lebih kecil 5˚Cdari Tm.

3) Ekstensi yaitu terjadi proses polimeriasasi untukpembentukan untai DNA baru. Waktu untuk ekstensitergantung ukuran DNA yang digandakan.

Dengan diperoleh hasil PCR maka dapatdilanjutkan dengan analisis molekuler lainnyaseperti kloning, sekuensing, deteksi mutasi dankajian forensik.

b. Analisis Protein

Purifikasi dan analisis protein berguna untukmendesain probe oligonukleotida untuk cloning,mengkonfirmasi sekuen DNA, mensintesis peptideuntuk mendapatkan antipeptide-antibodi. Proteinyang diisolasi adalah protein intrasel, jadi bagian

yang lebih banyak dianalisis adalah supernatan.Sonikasi merupakan metode homogenisasi denganmenggunakan gelombang yang bertujuan untukmenghancurkan membran sel untuk mengambilkandungan sitoplasma dan organelnya. Metodeekstraksi sonikasi memanfaatkan gelombangultrasonik dengan frekuensi 42 kHz yang dapatmempercepat waktu kontak antara sampeldan pelarut pada suhu ruang. Sonikasimengandalkan energi gelombang yang menyebabkanproses kavitasi, yaitu proses pembentukangelembung-gelembung kecil akibat adanya transmisigelombang ultrasonik untuk membantu difusi pelarutke dalam dinding sel bakteri (Ashley et al., 2001).Sonikasi dilakukan pada suhu rendah agar proteintidak mudah rusak bila di luar kondisi fisiologisnya.homogenisasi dengan sonikasi akan menghasilkanhomogenate yang berupa larutan keruh yang terdiriatas debris sel (bagian yang tidak hancur), organel-organel sel dan makromolekul penyusun sel yangdiantaranya adalah protein. Sentrifugasi bertujuanuntuk memisahkan debris dan organel sel yangmengendap di dasar tabung (pellet) dan supernatanyang berupa protein dengan ukuran lebih kecildaripada debris dan organel yang kemudianmengendap tapi terlarut dengan buffer. Homogenatmasih mengandung crude protein.

Tabel 1. Hubungan Volume Protein BSA denganNilai Absorbansi pada 595 nm

Nilai Absorbansipada λ=595 nm

Kadar BSA(µg/2µL)

0 0

0.036 1

0.092 2

0.17 4

0.226 8

0.486 16

0.71 32Sumber: Data primer, 2015

Nilai kadar BSA (nilai X) dicari denganmemasukkan nilai y (nilai absorbansi pada panjanggelombang 595 nm):

Y= 0,113x-0,2063

X= = = 5.126 µg dalam 2 µL.

Sehingga konsentrasi BSA yang didapat adalah2.563 µg/µL.

ISSN No.2355-9292 Jurnal Sangkareang Mataram|31

http://www.untb.ac.id Volume 2, No. 3, September 2016

Gambar 4. Kurva Standar Kadar Protein BSA

Reagen Bradford dapat digunakan untukmenentukan konsentrasi protein dalam sebuahlarutan. Melalui kurva yang didapat, didapatkan nilairegresi 0,8776. Berarti data hubungan antara kadarBSA dengan nilai absorbansi dapat dipolakandengan model regresi linear (persamaan garis lurus).

Semakin tinggi kadar BSA maka semakin tingginilai absorbansi. Bradford assay bersifat lebih cepat,memerlukan langkah-langkah pencampuran yangtidak terlalu banyak, tidak memerlukan pemanasanserta memberikan respon kolorimetrik yang lebihstabil dibandingkan assay protein lainnya.Kelemahan metode Bradford assay adalahmembutuhkan pengenceran sebelum analisis,dihambat oleh keberadaan detergen (Anonim, 2004).Metode ini berfungsi untuk mendeteksi protein,meningkatkan sensitivitas kisaran microgram yangbiasanya digunakan dalam pewarnaan coomassieblue menjadi ke level yang lebih tinggi yaitu ketingkatan nanogram. Untuk melihat pita komponenyang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarnakhusus. Beberapa pewarna yang dapat digunakandalam SDS-PAGE adalah Commasie Brilliat Bluedan Silver Salt Staining. Commasie Brilliant Bluemengikat protein secara spesifik dengan ikatankovalen.

Gambar 5. Hasil Pewarnaan Gel dengan CBB

Gambar 6. Hasil Pewarnaan Gel dengan SilverStaining

Metode silver staining dikembangkan untukmenutupi kekurangan pewarnaan dengan coomassieblue dari segi pembiayaan, kualitas latar belakang.Commasie Brilliant Blue mengikat protein secaraspesifik dengan ikatan kovalen. Silver Salt Stainingmemiliki sifat lebih sensitif dan akurat namunmembutuhkan proses yang lebih lama.

PENUTUP

Teknik-teknik deteksi molekuler yang umumdilakukan yaitu analisis DNA genom, analisis DNAplasmid dan analisis protein. Ketiganya bermanfaatdalam identifikasi molekuler mikrobia serta rekayasagenetika mikrobia.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2004.http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html

Ashley, K., Andrews R.N, Cavazosa L., DemangeM. 2001. Ultrasonic Extraction as ASample Preparation Technique ForElemental Analysis By AtomicSpectrometry. Journal of AnalyticalAtomic Spectrometry 16:1147-1153.

Tsen, S.D. Fang, S.S. Chen, M.J. Chien, J.Y. Lee,C.C. and Tsen, D.H. 2002. Natural PlasmidTransformation in Escherichia coli.Journal of Biomedical Science, vol. 9, no.3, p. 246-252.

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi PolymeraseChain Reaction. Andi. Yogyakarta.

marker

marker