Elektroforesis gel

41

Transcript of Elektroforesis gel

Page 1: Elektroforesis gel
Page 3: Elektroforesis gel

Prinsip• Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan.

• Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz

F = gaya Lorentz, q = muatan objek, E = medan listrik

Page 4: Elektroforesis gel

How will you do if :

• You’re holding a small plastic tube with some clear liquid in it

• You’ve been told that the liquid contains DNA strands of several different lengths

• Your job is to figure out what those lengths are

Page 5: Elektroforesis gel
Page 6: Elektroforesis gel

Apa Itu Elektroforesis Gel?

Metode Elektroforesis yang digunakan untuk

memisahkan dan menganalisis fragmen-

fragmen makromolekul (asam nukleat dan

protein)

Menggunakan gel sebagai “saringan”

Page 7: Elektroforesis gel

Kapan Kita MenggunakanElektroforesis Gel?

Page 8: Elektroforesis gel

Jenis-Jenis Elektroforesis Gel

Elektroforesis DNA/RNA :• Elektroforesis gel agarose : horizontal

• Elektroforesis gel poliakrilamida : vertikal

Elektroforesis Protein :• PAGE (PolyAcrilamide Gel Electrophoresis)

Sistem yang digunakan dalam PAGE- Flat Bed- Rod atau Column- Vertical Slab- Capillary

• SDS PAGE

• Blue Native PAGE (BN-PAGE)

• Zymogram PAGE

• Isoelectric Focusing (IEF)

• 2-D Electrophoresis

Page 9: Elektroforesis gel
Page 10: Elektroforesis gel

Komponen

Elektroforesis Gel

Page 11: Elektroforesis gel

Gel

1. Berfungsi sebagai matriks Penyaring molekul

2. Pemilihan gel bergantung pada ukuran

molekul yang akan di elektroforesis

3. Biasanya terdiri dari

• Agarose : digunakan secara horizontal

• Poliakrilamida : digunakan secara vertikal

Page 12: Elektroforesis gel

Agarose ditujukan pada berat molekul lebih dari 100 kb dan untuk

poliakrilamida untuk molekul –molekul 1-300 pasang basa, bahkan

mampu membedakan molekul-molekul dengan selisih panjang 1

nukleotida

Page 13: Elektroforesis gel

Agarose Gel

1. Dimurnikan dari polisakarida alga Rhodophyla.

2. Gelidian dan Glaucaria adalah komponen yang dimodifikasi residu galaktosanya. Didalam hubungan dengan polisakarida, agropefin dibentuk agar.

3. Agarose larut pada buffer (TAE) yang mendidih dan ditunggu untuk dingin, Hasil ini dicetak pada cetakan gel yang ditempatkan pada suhu ruang.

Page 14: Elektroforesis gel

Struktur Agarose Gel

Page 15: Elektroforesis gel
Page 16: Elektroforesis gel

Gambar SEM struktur agarose gel 2%(a) 70 oC (b) 40 oC (c) 30 oC (d) 20 oC

Page 17: Elektroforesis gel

Resolusi Gel Agarose

Resolusi : kemampuan memisahkan molekulsehingga dapat terbaca dengan jelas

Page 18: Elektroforesis gel
Page 19: Elektroforesis gel
Page 20: Elektroforesis gel

Gel Poliakrilamida

Poliakrilamida dibentuk dari akrilamida dan N,N’-methyle-bis-akrilamida yang dihubungkan dengan reaksipolimerisasi dengan penambahan ammonium perisulphate dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMEDadalah katalis yang dibentuk dari radikal bebas ionperisulfate dan diinisiasi polymerization dari acrilamida.

Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang netral, kationik, anionik, atau amfoter dengan sifat fisika dan kimia, panjang dan berat molekul yang bervariasi

Page 21: Elektroforesis gel

Polimerisasi Akrilamida

Page 22: Elektroforesis gel

Hasil SEM polyacrilamide gelFrom :Journal of material chemistry website

Page 23: Elektroforesis gel

• Fungsi : menjaga kesetimbangan pH, memberikan ion untuk konduktivitas,

• Elektroforesis DNA :Buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), atauTBE (Tris-borate-EDTA ) Loading buffer

• Elektroforesis Protein :Buffer Tris

Buffer

Page 24: Elektroforesis gel

Bagaimana caranya?

Membuatmatriks gel

Proses

elektroforesis

Visualisasi(staining)

Page 25: Elektroforesis gel
Page 26: Elektroforesis gel
Page 27: Elektroforesis gel
Page 28: Elektroforesis gel

Gel Documentation System

Page 29: Elektroforesis gel
Page 30: Elektroforesis gel

Visualisasi Elektroforesis DNA

• Etidium Bromida disinari lampu UV berpendar

Page 31: Elektroforesis gel

Staining

Dilakukan agar pemisahan elektroforesisdapat teramati.

Staining untuk elektroforesis DNA :

• Etidium bromida (penambahan EtBrmengurangi laju migrasi sebesar 15% )

• SYBR Gold, SYBR Green, Crystal Violet, Methyl Blue

Staining untuk elektroforesis protein:

• Coomasie Blue

• Silver Staining

Page 32: Elektroforesis gel

Elektroforesis Protein

Page 33: Elektroforesis gel

Protein Molecular Weight Markers

Page 34: Elektroforesis gel

Autoradiografi DNA

Page 35: Elektroforesis gel
Page 36: Elektroforesis gel

Seperti apa hasilnya?

• Elektroforesis DNA (EtBr Staining)

Page 37: Elektroforesis gel

• elektroforesis protein

Page 38: Elektroforesis gel

Elektroforesis protein

• Silver staining

Page 39: Elektroforesis gel

Migrasi Molekul DNA Pada Gel• Molekul DNA yang bermuatan negatif

karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis

• Fragmen DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama

• Topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak. Topologi molekul DNA

hasil Elektroforesis.

Page 40: Elektroforesis gel

• Konsentrasi gel agarose---->

• Pengaruh Voltase : makintinggi voltase, migrasifragmen yang lebih besarakan lebih cepat

• Buffer Elektroforesis

• Efek Etidium Bromida

Faktor yang mempengaruhi pemisahankomponen pada elektroforesis DNA

Page 41: Elektroforesis gel

Faktor yang mempengaruhi pemisahankomponen pada elektroforesis protein

• Densitas molekul : berbeda diantara pH media dan pl molekul

• Pengaruh buffer :

• Bentuk dan ukuran molekul

• Media pendukung: • Restriksi pada mobilitas

• Pengaruh difusi

• Elektroendosmosis

• Mikro-heterogenitas molekuler spesies