Kalibrasi Pcr, Plsr & Ft-ir

© 2008 BAGIAN KIMIA ANALITIK

KALIBRASI

Prof Dr Ir Latifah K Darusman, MS

PendahuluanPendahuluan• Kimia Analitik menentukan kadar gula dalam darah

spektroskopi A [ ]

pada maks

y = a + bx

A [ ]

Teknik kalibrasi satu titik

kalibrasi multititik

• Contoh lain Kimia Fisik membuat model dari suatu reaksi sebagai fungsi suhu

menentukan laju reaksi

kalibrasi mencari hubungan faktor & respon yang sesuai orde 0, 1, 2, dst

univariat

PendahuluanPendahuluan

Univariat dan Multivariat

Univariat: penentuan pigmen klorofil dengan detektor UV pada KCKT

Multivariat: penentuan suatu ekstrak flavonoid (multikomponen dengan multistandar) pada KCKT UV, diode array

Kalibrasi UnivariatKalibrasi Univariat

• Kalibrasi klasik

x = bc atau x = b0 + b1c

• Kalibrasi terbalik

c = ax atau c = a0 + a1x

Kalibrasi UnivariatKalibrasi UnivariatHubungan antara kalibrasi klasik dan kalibrasi terbalik

Bila tidak ada pencilan harus sejalan

Persamaan KalibrasiPersamaan KalibrasiDapat lebih mudah dimengerti bila disajikan dalam bentuk matriks

a = konstanta atau skalar

c = vektor konsentrasi

x = vektor pengukuran (A)

Kalibrasi MultivariatKalibrasi Multivariat• Banyak digunakan terutama: untuk menganalisis campuran

dengan teknik spektroskopi

• Pada dasarnya dalam Kimia The Chemistry of mixture

merupakan hal yang penting & paling banyak dihadapi

• Contoh: - Farmasi mensintesis obat sulit 100% murni (ada 1% isomer dll) - mendeteksi?

- efek?

- Lingkungan komposisi udara di dalam pabrik tercemar?

mendeteksi? campuran?

efek?

- Deteksi konvensional --- OK

--- lama & mahal

Kalibrasi MultivariatKalibrasi MultivariatContoh: Analisis campuran bahan (3 bahan dalam contoh) dengan

spektroskopi UV

Kalibrasi MultivariatKalibrasi Multivariat

Kalibrasi MultivariatKalibrasi MultivariatProblem istilah vektor X C1S1 + C2S2 + C3S3

X = campuran spektrum vektor masing-

masing

C1 = konsentrasi 1 dst

S1 = spektrumnya

X S.C

seperti univariat, tetapi diukur pada berbagai

teknik analitiknya

ada syaratnya pengukuran simultan

Digunakan pada pengukuran

menentukannya??


SXC reaksi .

Multiple Linear Regression (MLR)

MLR CLS: Classical Least Square

ILS: Inverse Least Square

Contoh: pada spektroskopi analisis campuran suatu seri dari campuran spektrum

Dicirikan: (a) spektrum masing-masing komponen

(b) konsentrasi masing-masing komponen

(c) derau (galat eksperimental)

matriks X misalkan terdiri dari 30 spektrum UV dari reaksi A B + C

model kalibrasi:

X C.S + E


Principle Component Regression (PCR)

PCR dalam analisis campuran digunakan untuk mengidentifikasi beberapa komponen dalam campuran

Contoh: menentukan kadar senyawa karsinogenik di dalam air laut, tetapi tidak ada data atau tidak ingin diketahui data tentang identitas senyawa dan konsentrasi masing-masing

Cara:

Tahap 1 memperoleh seri spektrum (set kalibrasi/set training)

spektrum UV dari 20 sampel discanning pada 200

matrik = X = 20 x 200


Tahap 2 menjalankan PCA terhadap spektrum

diperoleh matrik skor dan loading

T & P

menentukan jumlah PC?

dibantu dengan perkiraan jumlah senyawa dalam campuran bila diduga 10 10 PC/AKU

ukuran matrik T 20 x 10

P 10 x 200

secara statistika leave one out (LOO) cross validation


Tahap 3 tahap regressi, transformasi atau rotasi

dalam hal kalibrasi menentukan hubungan antara skor dengan konsentrasi yang sebenarnya dari masing senyawa

C = T r

ada 10 PC C = t1r1 + t2r2 + ……+ t10r10

C & T diketahui r = T+. C

Bila senyawa banyak C C (dalam matrik)

C = T.R

Kalibrasi MultivariatKalibrasi MultivariatPartial Least Square (PLS)

PCR KU dihitung pada blok matrik X dan tidak ikut diperhitungkan pada blok matrik C

PLS komponen diperoleh dengan menggunakan blok data matrik X dan C secara simultan

dengan harapan dapat memaksimumkan covariance diantara dua blok

Pada PCA memaksimumkan variance pada blok matrik X

PLS bertujuan untuk menemukan suatu variabel yang dapat memaksimumkan XC

berasumsi bahwa terdapat galat pada kedua blok matrik yang keduanya sama penting

Kalibrasi MultivariatKalibrasi MultivariatSebagai contoh: bila kita mengkalibrasi galat dapat ada pada konsentrasi juga pada absorbans/spektrum

Persamaan PLS dua persamaan: X = T.P + E

C = T.q + f

T skor orthogonalP loading orthogonal dinormalkan

Kalibrasi MultivariatKalibrasi MultivariatKualitas model ditentukan: ukuran galat (jumlah kuadrat C dan f)

PLS dimungkinkan untuk menentukan kebaikan model dari data yang dimodelkan baik menggunakan matrik blok C atau X

Galat pada C biasanya yang lebih diperhatikan

Kalibrasi MultivariatKalibrasi MultivariatPLS1 PLS2

matrik blok C terdiri lebih dari satu variabel

campuran 3 komponen

C matrik dengan 3 kolom

persamaan pada blok C

C = T.Q + F

untuk analitik begitu baik, tetapi pada QSAR akan lebih menguntungkan

Kalibrasi MultivariatKalibrasi Multivariat PLS2 dapat digunakan dengan variabel C yang banyak satu

model

PLS1 harus masing-masing variabel C

PLS dapat digunakan juga dari pengenalan pola terawasi (supervised pattern recognition)

Bagaimanakah mengukur kebaikan kalibrasi model yang tepat

• autoprediksi

• cross-validation

• test-sets

• bootstrap

FACTORIAL DESIGNDigunakan untuk menentukan faktor (x) yang paling berpengaruh terhadap respon atau hasil (y)Menggunakan 2 level untuk setiap faktor (namun dapat dikembangkan menjadi lebih dari 2)Level diberi simbol -1 (level bawah) dan +1 (level atas)Jumlah eksperimen (N) = lf l adalah jumlah level dan f adalah jumlah faktor

Eksperimen Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3 Respon

1 -1 -1 -1

2 +1 -1 -1

3 -1 +1 -1

4 +1 +1 -1

5 -1 -1 +1

6 +1 -1 +1

7 -1 +1 +1

8 +1 +1 +1

FACTORIAL DESIGN

Jumlah eksperimen (N) = (2)3

= 8

Contoh

Evaluasi pengaruh suhu, waktu ekstraksi, dan pH terhadap rendemen ekstraksi kafein dari oba sakit kepalaJumlah faktor 3 faktorLevel suhu 30 dan 45 ᵒC

waktu 30 dan 60 menit pH 5 dan 7

Eksperimen suhu waktu pH Respon

1 -1 -1 -1

2 +1 -1 -1

3 -1 +1 -1

4 +1 +1 -1

5 -1 -1 +1

6 +1 -1 +1

7 -1 +1 +1

8 +1 +1 +1

Eksperimen suhu waktu pH Respon

1 30 30 5

2 45 30 5

3 30 60 5

4 45 60 5

5 30 30 7

6 45 30 7

7 30 60 7

8 45 60 7

FACTORIAL DESIGN

fAK

Kelemahan: Jumlah eksperimen besarJika faktor 10, N =210 = 1024

Fractional factorial design

FRACTIONAL FACTORIAL DESIGNMengurangi jumlah eksperimen pada factorial designPengurangan jumlah eksperimen ½, ¼, 1/8 dari jumlah eksperimen pada fractional design

Eksperimen Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3

1 +1 +1 +1

2 +1 +1 -1

3 +1 -1 -1

4 +1 -1 -1

5 -1 +1 +1

6 -1 +1 -1

7 -1 -1 +1

8 -1 -1 -1

Eksperimen Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3

1 +1 +1 +1

2 +1 -1 -1

3 -1 -1 +1

4 -1 +1 -1

FACTORIAL DESIGNFRACTIONAL FACTORIAL DESIGN

FRACTIONAL FACTORIAL DESIGN

Jumlah eksperimen factorial design (N) = (2)3 = 8Jumlah eksperimen fractional factorial design =1/2 X 8 = 4

Evaluasi pengaruh suhu, waktu ekstraksi, dan pH terhadap rendemen ekstraksi kafein dari oba sakit kepalaJumlah faktor 3 faktorLevel suhu 30 dan 45 ᵒC

waktu 30 dan 60 menit pH 5 dan 7

Eksperimen Suhu Waktu pH

1 45 60 7

2 45 30 5

3 30 30 7

4 30 60 5

Contoh

MIXTURE DESIGNDigunakan saat jumlah seluruh faktor (campuran faktor) konstan (100%)Biasa digunakan untuk design campuran pelarut ekstraksi, fase gerak kromatografi, atau campuran komponen

2 faktor 3 faktor 4 faktor

MIXTURE DESIGNSaat digunakan 3 faktor, design dapat mengikuti bentuk:Simplex centroidSimplex latticeSimplex centroid with axial design

Simplex centroid design

Ekstraksi asiaticosida dari pegagan dilakukan dengan

menggunakan campuran 3 pelarut, yaitu metanol, air, butanol.

Campuran palarut yang paling optimal mixture design

Jika digunakan simplex centroid design, kombinasi pelarut sbb:

MIXTURE DESIGN

air

metanol

butanol

metanol air butanol

Contoh



Jika digunakan simplex lattice design, kombinasi pelarut sbb:

Contoh

Metanol

Air Butanol



Jika digunakan simplex centroid with axial design, kombinasi

pelarut sbb:

Contoh

Experiment Metanol Air Butanol1 1 0 02 0 1 03 0 0 14 1/2 1/2 05 1/2 0 1/26 0 1/2 1/27 1/3 1/3 1/38 1/6 2/3 1/69 1/6 1/6 2/310 2/3 1/6 1/6

Kimia Analitik FMIPA IPB

Rudi Heryanto

The use of FT-IR technique in herbal medicine quality control:

A tutorial


Segments of quality Control

– Identification of adulterants– Differentiation of herbal medicines with multiple

sources– Determination of the best harvesting time– Confirmation of collection sites– Assessment of processing methods– Quality evaluation of herbal parts– Identification and quantitative determination of

proprietary products– Stability test of proprietary products– Diagnosis of herbal intoxication


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

3996 3659 3321 2984 2646 2309 1971 1634 1296 959 621

Bilangan Gelombang

Abso

rban

s

IVNF1-1

K32I10

LC17-2

PS1-4

PS4-16

SLW8-1

U22-2

InformationFingerprint

Chemometrics …


Spektroskopi FTIR

• Spektra FTIR Representasi khas dari suatu sistem kimia

• Cepat• Nondestructive• Reagentless • High-throughput

analysis of a diverse range of sample types


FTIR for QC : The strategy

Sample preparation

Spectra collection and Prepocessing

Data analysis : Classification and Discrimination

Observations

Sim

ilari

ty

BGR_

GNP_

67

PNG_

SLH_

48

PNG_

SLH_

47

KRA_

TMG_

43

SMD_

RKL_

51

PNG_

SLH_

46

KDR_

SMN_

44

BGR_

CMP_

68

KDR_

SMN_

45

WNG

_NGD

R_36

SMD_

TJK_

50

KRA_

TMG_

42

WNG

_NGD

R_37

BGR_

DMG_

69

SMD_

TJK_

49

WNG

_PK_

35

0.00

33.33

66.67

100.00

Dendrogram with Complete Linkage and Euclidean Distance

Validation


FTIR for QC : The Procedure

• Collect specimens– Number of specimens : ~ 15 per specimen

or more

• Measure corresponding IR spectra– ATR, Drift : raw material or extracts– Abs FTIR : extracts



Ethanol extract

Raw material

The detail of FTIR absorption spectra of ethanol extract (Curcuma longa) was better than FTIR spectra from powder of raw material



a

b

c

IR spectra of ethanol extract (a) resolution 4 cm-1, scanning rate 32 (b) resolution 8 cm-1, scanning rate 32, (c) resolution16 cm-1, scanning rate 32.

Optimisation for IR spectra collection IR



• Designate two-thirds of the total number of spectra as the calibration set and the remaining one-third of spectra as the validation set

• Preprocess spectra– Baseline correction: to flatten the baseline (or the

baseplane) and make it equal to zero – Normalization : to bring their peaks to comparable

heights – Smoothing– Derivative



Original Spectra

After Baseline correction and Normalization



• Choose modeling method (e.g. PCA, PLS-DA, SIMCA)

• Generate models ranging in complexity from a very few variables (wavelength terms for MLR; factors for PLS-DA, PCA) to many variables

• Identify outliers and correct or remove as appropriate

• Recalibrate models with outliers removed• Evaluate standard errors of calibration and

cross-validation for each model and plot as a function of the number of variables in the model



UNSCRAMBLER from CAMO


Example …• Differentiation of Differentiation of Curcuma longaCurcuma longa, , Curcuma xanthorrhizaCurcuma xanthorrhiza

and and Zingiber cassumunar Zingiber cassumunar by Fourier-Transform Infrared by Fourier-Transform Infrared SpectroscopySpectroscopy

• Researchers : M. Rafi, E. Rohaeti, UD Syafitri, LK Darusman

• Problems : Curcuma longa, Curcuma xanthorrhiza, and Zingiber cassumunar are belong to the family of Zingiberaceae and therefore contain some common bioactive chemical compounds such as curcuminoids. Traditionally, authentication or differentiation of these herbs mainly depends on smell, taste and appearance of the plants. If they are pulverized as powder or cut into slice, the differentiation becomes more difficult

• Objectives : to develop a rapid analytical method using Fourier transform infrared spectroscopy to differentiate of these herbs


Z. cassumunar

C. longa

C. xanthorrhiza

Wave number ~3400 cm-1 OH3000 cm-1 C-H1740–1680 cm-1 C=O1600 dan 1475 cm-1 C=C 1260–1000 cm-1 C-O

Example …


Example …

Cluster analysis for Z. cassummunar, C. longa, dan C. xanthorrhiza


Plot PCA (▲) Bangle () kunyit (■) temulawakPC1 = 60% dan PC2 = 15%

Example …


Example …

Canonic plot from PLS-DA result Z. cassummunar,

C. longa, dan C. xanthorrhiza


CAN1

CA

N2

1050-5-10-15

7.5

5.0

2.5

0.0

-2.5

-5.0

C_B

C_K

C_T

B

B

B

K

KK

TT T

T

Canonic plot from PLS-DA validation Z. cassummunar (B), C. longa (K), dan C. xanthorrhiza (T)

Example …


Thank You!

Kalibrasi Pcr, Plsr & Ft-ir

Documents

Transcript of Kalibrasi Pcr, Plsr & Ft-ir