Polymerase chain reaction (PCR)

(Diajukan guna memenuhi tugas mata kuliah Genetika SP)

Disusun oleh:

FENTI RIADIYATI (110210103009)

UMI FADILAH (110210103034)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

JURUSAN PENDIDIAKAN MIPA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS JEMBER

20131

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas)

serta segala sluk beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan,

ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana

sifat keturunan ilmu itu diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi

yang mungkin timbul didalamnya atau yang menyertainya. Pewarisan sifat

tersebut dapat terjadi melalui proses seksual. Genetika berusaha membawakan

material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik), bagaimana

informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana informasi

tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode

in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan

menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang

berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat

kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini

semakin luas penggunaannya.

Dunia sekarang sedang mengalami perkembangan teknologi secara besar-

besaran. Hal ini dapat kita rasakan dalam berbagai bidang, salah satunya adalah

bidang kedokteran. Sebagai contoh dari perkembangan teknologi kedokteran

adalah ditemukannya ilmu biologi molekuler. Biologi molekuler merupakan salah

satu cabang biologi yang merujuk kepada pengkajian mengenai kehidupan pada

skala molekul. Ini termasuk penyelidikan tentang interaksi molekul dalam benda

hidup dan kesannya, terutama tentang interaksi berbagai sistem dalam sel,

termasuk interaksi DNA, RNA, dan sintesis protein, dan bagaimana interaksi

tersebut diatur. Biologi molekuler memberikan kontribusi yang amat sangat nyata

dalam bidang kedokteran. Dahulu, untuk mengetahui penyakit yang diderita harus

dengan menemukan organisme penyebab penyakit tersebut didalam tubuh. Dan

jika tidak ditemukan pasien dinyatakan negatif dan tidak diberikan tindakan

apapun. Padahal kenyataanya tidak semua penyakit organisme penyebabnya dapat

2

ditemukan dengan mudah. Namun dengan adanya biologi molekuler dokter dapat

memeriksa penyebab sampai dengan pada DNA pasien.

Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang

tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan

fosfodiester. Fungsi utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan

pemindahan informasi genetik. Informasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak

melalui proses replikasi. Sel memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam

deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam ribonukleat

(ribonucleic acid/RNA).

Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni DNA

cetakan, oligonukleotida primer, deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri

dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan) enzim polimerase yang digunakan untuk

mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yakni

denaturasi, penempelan (annealing), dan amplifikasi.

1.2 Rumusan masalah

2. Apa pengertian PCR?

3. Bagaimana tahapan PCR dapat berlangsung?

4. Kapan PCR mulai berperan?

5. BAGAIMANA Aplikasi Teknik PCR dalam kehidupan sehari-hari?

1.3 Tujuan

2. Untuk memahami konsep kegunaan tentang PCR

3. Menjadi referensi tambahan yang menunjang keberhasilan pembelajaran

matakuliah genetika.

4. Untuk mengetahui komponen dan proses PCR

1.4 Manfaat

Bagi penulis dan pembaca dapat memperoleh pengetahuan tentang prose

polymerase chain reaction serta manfaat PCR bagi manusia.

3

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Definisi PCR ( Polymerase Chain Reaction )

Pada tahun 1987 Kary Mullis menemukan teknik penggandaan urutan basa

nukleotida secara in vitro, sehingga tidak hanya sekedar digunakan untuk

membuat fragmen pelacak. Fragmen pelacak yang diperlukan dalam seleksi

rekombinan merupakan molekul DNA untai ganda yang urutan basanya harus

komplementer dengan sebagian urutan basa fragmen (gen) yang dilacak.

Dengan demikian, maka PCR adalah teknik yang digunakan untuk

memperbanyak DNA secara in vitro dengan cara menginkubasinya bersama

primer spesifik, polimerase DNA tahan panas dan nukleotida. Teknik atau reaksi

PCR akan lebih cepat dan selektif jika sumber DNA hanya sedikit atau tidak

murni, namun jika DNA tersedia dalam jumlah besar maka pengklonaan DNA

didalam sel merupakan metode yang paling baik untuk mempersiapkan gen

tertentu.

Dalam teknik PCR segmen sasaran spesifik apa pun didalam satu atau

banyak molekul DNA dapat dengan cepet di perbanyak atau disalin berkali-kali

dalam tabung reaksi. Sehingga dengan otomatis PCR dapat membuat milyaran

salinan segmen sasaran DNA dalam beberapa jam. Sedangkan jika dibandingkan

dengan teknik mempertemukan klona dengan gen yang dikehendaki dan

membiarkan gen itu bereplikasi didalam sel inang, maka akan membutuhkan

waktu yang jauh lebih lama. Jika di ibaratkan cara kerja PCR adalah memfotokopi

satu halaman saja, bukan memeriksa semua buku dalam perpustakaan.

Pengklonaan gen adalah proses yang menghasilkan banyak salinan gen

yang dikehendaki. Salinan-salinan ini dapat digunakan dalam sekuensing gen

tersebut, dalam menghasilkan protein yang dikodekan oleh gen tersebut.

2.2 Komponen PCR (Polymerase Chain Reaction)

Penggandaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi

polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa

putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen

4

sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat),

molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi

sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.

DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa

fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan

target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan

akumulasi hasil polimerisasi molekul primer.

Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas

sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya

penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA

polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus

termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA

yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA

polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari

bakteri termofilik Thermus aquaticus.

2.3 Teknik dan Tahapan Terjadinya PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat,

penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung

pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan

untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal.

Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer.

Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal

DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward

primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai

DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya

hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung

5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya) . Dengan demikian,

pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika

DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.

5

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran

reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya

hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek

sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang

ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen

pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk

digandakan (diamplifikasi).

Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja,

maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 – 2.20

= 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA

templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak

mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat

awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20

menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai

fragmen pelacak.

Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer.

Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan

dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada

kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus

komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan

urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita

belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu,

diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan

digunakan.

Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai

kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari

sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan.

Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat

mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat

digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas

fluorescens, P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.

6

Urutan-urutan

basa fragmen tertentu

dari berbagai strain

tersebut kemudian

dijajarkan dan dicari

satu daerah atau lebih

yang memperlihatkan

homologi tinggi antara

satu strain dan lainnya.

Daerah ini dinamakan

daerah lestari

(conserved area).

Sebagian/seluruh

urutan basa pada

daerah lestari inilah

yang akan menjadi

urutan basa primer.

Sebenarnya,

daerah lestari juga

dapat ditentukan

melalui penjajaran

urutan asam amino

pada tingkat protein.

Urutan asam amino ini

kemudian diturunkan

ke urutan basa DNA.

Dari satu urutan asam

amino sangat mungkin

akan diperoleh lebih

dari satu urutan basa

DNA karena setiap

asam amino dapat

7

disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer

yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan

urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang

disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer

degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak

selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).

Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis

menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya

primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang

(cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah

tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis

juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan

kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai Tm yang relatif

sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi.

2.4 Aplikasi teknik PCR

Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada

tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam

kebutuhan, diantaranya:

a.      Isolasi Gen

DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja

panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen.

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik,

yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip

menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai

asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang

menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein

atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan

baik. Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen

tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin

langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes,

proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena

8

insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat

teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin

dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E.

coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama

persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal

diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang

cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. Untuk mengisolasi

gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki

urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat

dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

b.      DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing,

metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination

method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana

proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu

hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya

tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent

untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa

ditentukan.

c.       Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau

korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik

sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang

tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan

analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut

fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang.

Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki

pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang

sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak

9

kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua

‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

d.      Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah

saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini

memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering

digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam

dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu

DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki

oleh virus atau makhluk lainnya.

 

10

BAB III

KESIMPULAN

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR

(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan

suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa

menggunakan organisme. Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-

ulang antara dua puluh sampai tiga puluh kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga

tahap yaitu Tahap peleburan (melting) atau denaturasi, Tahap penempelan atau

annealing dan Tahap pemanjangan atau elongasi. Lepas tahap ketika, siklus

diulang kembali mulai tahap satu. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa

berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat

berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA

yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial.

11

DAFTAR PUSTAKA

http://apikdewefppundip2011.wordpress.com/2012/06/29/makalah-genetika-pcr-

polimerase-chain-reaction/

http://pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2011/09/pustaka_unpad_pcr.pdf

http://apikdewefppundip2011.wordpress.com/2012/06/29/makalah-genetika-pcr-

polimerase-chain-reaction/

12