7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 1/12

Dasar Teknik Amplifikasi DNA

http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teaching-

responsibility/general/bbbb/Oleh: Fatchiyah

Universitas Brawijaya

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction 

(PCR! meru"akan suatu "roses sintesis en#imatik untuk mengam"li$ikasi nukleotida secara in

vitro% &etoda PCR da"at meningkatkan jumlah urutan ') ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula! sekitar *+,-*+. kali% /etia" urutan basa nukleotida yang diam"li$ikasi akan

menjadi dua kali jumlahnya% Pada setia" n siklus PCR akan di"eroleh 0n kali banyaknya ')

target% 1unci utama "engembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara am"li$ikasi hanya "ada urutan ') target dan meminimalkan am"li$ikasi urutan non-target%

Penggunaan PCR telah berkembang secara ce"at seirama dengan "erkembangan biologi

molekuler% PCR digunakan untuk identi$ikasi "enyakit genetik! in$eksi oleh virus! diagnosis dini

 "enyakit se"erti )2'/! Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologievolusi! Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel atau"un jaringan%

1.1 Teknik Dasar Amplifikasi P! 

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan "ada tiga aterbaths yang mem"unyai tem"eraturyang berbeda% !hermal-cycler  "ertama kali di"ublikasikan "ada tahun *34,! akan teta"i "NA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable! dan harus ditambahkan disetia"

siklusnya% 1elemahan lain tem"erature 5.6C yang digunakan bias dan menyebabkan non-

 specific priming ! sehingga menghasilkan "roduk yang tidak dikehendaki% !a#  "NA polymerase 

yang diisolasi dari bakteri !hermus a#uaticus (!a#$ dikembangkan "ada tahun *344% 7nsim initahan sam"ai tem"erature mendidih *++6C! dan akti$itas maksimal "ada tem"eratur 30-386C%

Proses PCR meru"akan "roses siklus yang berulang meli"uti denaturasi! annealing dan ekstensi

oleh enzim DNA polimerase% /e"asang "rimer oligonukleotida yang s"esi$ik digunakan untukmembuat hibrid dengan ujung-89 menuju ujung-59 untai ') target dan mengam"li$ikasi untuk

urutan yang diinginkan% Dasar siklus P!  ada 5+-58 siklus meli"uti:

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 2/12

  denaturation (386C! 5+ detik 

  annealing (88,+6C! 5+ detik 

  e"tension (.06C! waktu tergantung "anjang "endeknya ukuran ') yang diinginkan

sebagai "roduk am"li$ikasi%

Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 58 siklus tidak memberikan e$ek yang "ositi$%

1.1.1 Denaturasi untai ganda DNA

 "enaturasi untai ganda "NA meru"akan langkah yang kritis selama "roses PCR% ;em"eratur

yang tinggi "ada awal "roses menyebabkan "emisahan untai ganda ')% ;em"eratur "ada taha"denaturasi "ada kisaran 30-38<C! suhu 3=<C meru"akan "ilihan standar%

;em"eratur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan >C yang tinggi dari "NA template!

teta"i half-life dari !a# "NA Polymerase menekan secara tajam "ada tem"eratur sekitar 38<C%

1.1.# Primer Annealing

 Primer Annealing ! "engenalan (annealing  suatu "rimer terhada" ') target tergantung "ada "anjang untai! banyaknya kandungan >C! dan konsentrasi "rimer itu sendiri% O"timalisasi

tem"eratur annealing  dimulai dengan menghitung %elting !emperature (;m dari ikatan "rimer

dan ') tem"late% Cara termudah menghitung untuk menda"atkan melting-tem"eratur yangte"at menggunakan rumus ;m ? @(>AC= A@ ()A;0% Rumus standar da"at dilihat di

subbab "rimer "ada kom"onen PCR% /edang tem"eratur annealing biasanya 8<C ddibawah ;m

 "rimer yang sebenarnya% /ecara "raktis! ;m ini di"engaruhi oleh kom"onen bu$$er! konsentrasi "rimer dan ') tem"late%

1.1.$ DNA Polymerase e"tension

Pada taha" e&tension ini terjadi "roses "emanjangan untai baru ')! dimulai dari "osisi "rimer

yang telah menem"el di urutan basa nukleotida ') target akan bergerak dari ujung 89 menujuujung 59 dari untai tunggal ')% Proses "emanjangan atau "embacaan in$ormasi ') yang

diinginkan sesuai dengan "anjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan% Pada setia" satu

kilobase (*+++b" yang akan diam"li$ikasi memerlukan waktu * menit% /edang bila kurand dari

8++b" hanya 5+ detik dan "ada kisaran 8++ ta"i kurang dari *kb "erlu waktu =8 detik! namun

a"abila lebih dari *kb akan memerlukan waktu 0 menit di setia" siklusnya (lihat contoh "adatabel 0% )da"un tem"eratur ekstensi berkisar antara .+-.06C%

Tabel 1 Amplifikasi %eometrik &'(# n)

/iklus PCR Dumlah Relati$ &olekul

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 3/12

* 0

0 =

5 4

= *,

8 50

, ,=

*+ *%+0=

0+ *% +=4%8.,

5+ *%+.5%.=*%40=

**. +omponen P! 

Pada reaksi PCR di"erlukan ') tem"late! "rimer s"esi$ik! ensim ') "olimerase yang

thermostabil! bu$$er PCR! ion &g 0A! dan thermal cycler%

#.1 Template DNA

Ukuran target am"li$ikasi biasanya kurang dari *+++ "asangan basa (b" atau *1B! Easil

am"li$ikasi yang e$isien antara *++-=++b"% alau"un kemungkinan hasil am"li$ikasi lebih dari *

kB teta"i "rosesnya kurang e$isien! karena "roduk yang "anjang rentan terhada" inhibitor yang

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 4/12

mem"engaruhi kerja ensim ') "olymerase dan waktu yang di"erlukan lebih lama% Eal ini

da"at menyebabkan hasil am"li$ikasi yang tidak diinginkan%

#.# Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida se"anjang *8-50b" dan "rimer ini harus mam"umengenali urutan yang akan diam"li$ikasi% Untuk standar am"li$ikasi se"asang "rimer akan

mem"unyai kisaran "asangan basa sekitar 0+ basa "anjangnya "ada tia" "rimernya% 1andungan

>C harus antara =8-,+G% )nnealing tem"eratur antara "rimer yang digunakan harus berkisarantara *6C% Ujung 59 dari setia" "rimer harus > atau C! akan teta"i hindari susunan nukleotida

>HC berturut-turut tiga "ada ujung ini! misal CC>! >C>! >>C! >>>! CCC! >CC% Pada

 "enentuan atau "enyusunan se"asang "rimer! "enting di"erhatikan urutan "rimer tidak salingkom"lementer sehingga membentuk dimer-primers! berikatan satu sama lain! atau membentuk

hairpins% Eal lainnya hindari menyusun "rimer "ada daerah ') re"etiti$%

#.$ Ta, DNA polymerase7n#im ini bersi$at thermostabil dan diisolasi dari ;hermus aIuaticus% )ktivitas "olimerisasi')nya dari ujung-89 ke ujung-59 dan aktivitas en#imatik ini mem"unyai waktu "aruh sekitar

=+ menit "ada 38<C% Biasanya untuk setia" *++Jl volume reaksi ditambahkan 0%+-0%8 unit%

#. P! buffer dan konsentrasi g#

Bu$$er standar untuk PCR tersusun atas 8+m& 1Cl! *+m& ;ris-Cl ("E4%5 dan *%8m& &gCl0%Bu$$er standard ini akan bekerja dengan baik untuk ') tem"late dan "rimer dengan kondisi

tertentu! teta"i mungkin tidak o"timum dengan kombinasi yang lain% Produk PCR bu$$er ini

terkadang dijual dalam bentuk tan"a atau dengan &gCl0%

1onsentrasi ion magnesium dalam PCR bu$$er meru"akan $aktor yang sangat kritikal! karenakemungkinan da"at mem"engaruhi "roses annealing "rimer! tem"eratur dissosiasi untai ')

tem"late! dan "roduk PCR% Eal ini disebabkan konsentrasi o"timal ion &g 0A itu sangat rendah%

Eal ini "enting untuk "re"arasi ') tem"late yang tidak mengandung konsentrasi chelatingagent  yang tinggi! se"erti 7';) atau "hos"hat% 2on &g0A yang bebas bila terlalu rendah atau

tidak ada! maka biasanya tidak menghasilkan "roduk akhir PCR! sedang bila terlalu banyak ion

&g0Ayang bebas akan menghasilkan "roduk PCR yang tidak diinginkan%

#.0 Nucleotides &dNTPs)1onsentrasi yang biasanya digunakan untuk setia" d;P adalah 0++ J&% Pada konsentrasi ini

 "enting untuk mengatur konsentrasi ke-em"at d;P "ada titik estimasi 1m untuk setia" d;P%

8+m&! harus selalu diatur "E.%+% 1onsentrasi yang tinggi akan menimbulkanketidakseimbangan dengan en#im "olymerase% /edang "ada konsentrasi rendah akan

memberikan kete"atan dan s"esi$itas yang tinggi tan"a mereduksi hasil akhir% ;otal konsentrasi

d;P dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas%

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 5/12

#. P! Thermal ycler

 PCR thermal cycler  "ertama kali dikembangkan oleh "erusahaan Per'in(lmer  sebagai "emegang

 "aten asli% Pada saat ini telah di"roduksi berbagai macam ti"e alat PCR thermal cycler ini dari berbagai "erusahaan yang bergerak dalam bioteknologi% alau"un nama masing-masing alat itu

 berbeda teta"i "rinsi" kerjanya sama%

engenal P! &Polymerase hain !eaction)&ay1htt"s:HHkenjiediary%word"ress%comH0+**H+8H*,Hmengenal-"cr-"olymerase-chain-reactionH

KukssL% buat yang "engen tau a"a sih PCR ( Polymerase Chain Reaction iniL mungkin disini

 bisa baca-baca dikit ya%%

aktu "ertama kali dengar PCR dulu! langsung blink blonk blank ni ke"alaL a"a tuuuMMM! truscoba buka buku! baca dikit%% makin "uyeng%% gak kebayang! a"aan sihhhhMMMM

 ah! ternyata! PCR itu lebih gam"ang kalo di animasikan! kayak $ilm kartun%% hehe% ga "ercayaM

 APA SIH PCR??

 PCR ini sebenarnya adalah metode penggandaan dari potongan DNA) 

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 6/12

 Nah, DNA itu apa ya?.

!ubuh manusia tersusun dari organ-organ, seperti darah, tulang, otot dan lain-lain) *rgan

tubuh tersusun dari +aringan, seperi +aringan lema', +aringan otot, +aringan hati, dan

 sebagainya) ebih 'ecil lagi, +aringan tubuh tersusun dari 'umpulan sel-sel) Nah, didalam selini ada banya' se'ali organelorgan. sel, +uga ada inti sel nucleus) "idalam nucleus inilah

terdapat yang namanya "NA, atau "eo&y Ribonucleic Acid) *ya, selain di dalam nucleus, "NA

 +uga tersimpan di dalam organel lain didalam sel, yaitu

mito'ondria

Gimana Sih entu!nya DNA?, uat apa sih DNA itu??

 "NA itu dianimasi'an seperti untaian . buah 'alung mutiara yang dironce dari berbagaimacam arna) /pernah liat 'an gelang atau 'alung yang dironce terus diputar-putar0) 'ira.

bentu'nya seperti itu$) !ali atau benang yang mengi'at mutiara itu adalah tali Sugar"Phosphate

 a#!$one , sementara mutiara-nya adalah asa yang terdiri dari 'ombinasi Purin atau Pirimidine) 1ombinasi inilah yang a'an membeda'an arna dari 2mutiara3-nya) iat deh

 gambar stru'tur "NA ini, canti' 'an00) Secara umum, "NA ini membaa 'ode geneti' masing-

masing individu) "NA mempunyai 'ode-'ode untu' menentu'an arna 'ulit seseorang, sepertiarna bola mata, hidung mancung dan sifat-sifat fisi' lainnya) Semua sel mempunyai "NA,

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 7/12

bu'an cuma sel manusia tapi sel hean dan tumbuhan termasu' ba'teri) Sel normal, sel 'an'er,

 sampai sel yang sudah mati +uga masih mengandung "NA)

 APA H%%NGANN&A PCR D'NGAN DNA??

 1arena "NA membaa 'ode-'ode geneti' di setiap rang'aian 2'alung mutiara3-"NA, para

ahli mencari cara untu' melihat 'ode-'ode geneti' tersebut) NA4, bayang'an a+a gimanacaranya melihat sebuah sel) 1ita harus mengintip dibali' mi'ros'op dengan mata setengah

 +uling))hihi5), apalagi melihat 'ode geneti' yang super duper halusssssssss5) its

impossible55 1arena itulah metode PCR ini dicipta'an, untu' mengganda'an 6 set 'ode geneti', men+adi milyaran set 'ode geneti' /bu'an semua 'alung mutiaranya lho, tapi potongan

'ecil dari 'alung mutiara tadi$) sehingga 'adar +umlah 'ode geneti'nya bisa didete'si)

 

 APA G%NAN&A PCR???Secara garis besar, PCR ini bertu+uan untu' mendete'si satu +enis 'ode geneti' yang 'ita

ingin'an) %isalnya dalam dete'si penya'it, seorang do'ter ingin mengetahui apa'ah pasiennya

terinfe'si oleh ba'teri !uberculosis /!7C$ , ma'a a'an dicari 'ode geneti' dari "NA ba'teri!7C dari dalam darah pasien tersebut) "emi'ian +uga untu' mendete'si 8irus 498, 8irus

 "engue dan 1uman %alaria) %endete'si adanya sel 'an'er +uga merupa'an salah satu

'egunaan PCR, dengan melihat apa'ah pada +aringan yang dicurigai terserang 'an'er terdapat'ode-'ode geneti' yang biasanya terdapat didalam "NA sel 'an'er) Selain itu, PCR banya'

diguna'an sebagai metode penelitian-penelitian biologi mole'uler)

  AGAI(ANA CARA )'R*A PCR???

 %esin PCR adalah mesin termosi'li' yang mengatur 'enai'an dan penurunan suhu secarabertahap) "NA yang sudah diisolasi a'an dicampur dengan reagencairan yang mengandungenzim"enzim dan primer DNA) :ang dima'sud dengan primer  adalah 'ode geneti' potongan

 "NA yang ingin 'ita lihat dari 'umpulan "NA yang sudah diisolasi tadi) Primer  ini dibuat oleh

 pabri', dan bisa 'ita pesan sesuai 'ebutuhan 'ita /'aya' men+ahit ba+u5hehe$) Prinsip dasar

 PCR adalah Repli'asi "NA , dimana pada tahap aal, 'edua 2'alung mutiara3-"NA a'andipisah'an oleh proses pemanasan /sampai ;<=C$) 4al ini bisa ter+adi 'arena "NA merupa'an

mole'ul protein yang a'an mengalami proses denaturasi apabila dipanas'an) Setelah 'edua

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 8/12

rantai terlepas, ma'a suhu a'an diturun'an sampai >?@C untu' memulai proses penempelan primer  di bagian rantai "NA yang coco' /  primer ini a!an men#ari !ode geneti! yang sesuai,

 +adi ga! a!an nempel di tempat lain-) Setelah primer menempel di 'edua rantai "NA, salah satu enim yang tadi +uga ditambah'an 'edalam larutan "NA yang bernama ag

 Polymerase +uga i'ut menempel disitu, enim ini lah yang a'an meronce untaian 'alung mutiara

 yang baru sebagai pasangan dari masing-masing 'alung mutiara tadi) Badi, pada a'hir si'lus pertama ini, a'an dihasil'an . buah 'alung mutiara yang baru) Si'lus ini a'an terus diulangi

 sampai >? 'ali) dan5)) 'alau masih ada yang ingat teori e'sponensial, berapa banya' 'alung

mutiara yang didapat pada a'hir si'lus 'e >?0 hayoooo)) +aabannya adaSetelah proses PCR selesai, ma'a bisa dilan+ut'an dengan ele'troforesa atau metode lain, untu'

mengu'ur atau melihat 'adar potongan "NA yang sudah +adi bermilyar-milyar banya'nya5

So5 mudah.an tulisan ini ga' bi'in puyeng ya, 'alo udah puyeng coba a+a liat gelang  +ni5)D, mirip ama "NA 'an000

 

Polymerase hain !eaction &P!)

https://mahmuddin.2ordpress.com/#313/34/$1/polymerase-

chain-reaction-pcr/

Posted by &ahmuddin "ada )gustus 5*! 0+*+

A. Prinsip +er5a

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 9/12

Polymerase Chain Reaction (PCR adalah metode untuk am"li$ikasi ("erbanyakan "rimer

oligonukleotida diarahkan secara en#imatik urutan ') s"esi$ik% ;eknik ini mam"u

mem"erbanyak sebuah urutan *+8-*+,-kali li"at dari jumlah nanogram ') tem"late dalamlatar belakang besar "ada seIuence yang tidak relevan (misalnya dari total ') genomik%

/ebuah "rasyarat untuk mem"erbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki "engetahuan!

urutan segmen unik yang menga"it ') yang akan diam"li$ikasi! sehingga oligonucleotidestertentu da"at di"eroleh% Eal ini tidak "erlu tahu a"a-a"a tentang urutan intervening antara

 "rimer% Produk PCR diam"li$ikasi dari tem"late ') menggunakan ') "olimerase stabil-

 "anas dari ;hermus aIuaticus (;aI ') "olimerase dan menggunakan "engatur siklus termalotomatis (Perkin-7lmerHCetus untuk menem"atkan reaksi sam"ai 5+ atau lebih siklus

denaturasi! anil "rimer! dan "olimerisasi% /etelah am"li$ikasi dengan PCR! "roduk ini di"isahkan

dengan elektro$oresis gel "oliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah "ewarnaan

dengan bromida etidium%

PCR ( Polymerase Chain Reaction meru"akan suatu teknik "erbanyakan (am"li$ikasi "otongan

') secara in vitro "ada daerah s"esi$ik yang dibatasi oleh dua buah "rimer oligonukleotida%

Primer yang digunakan sebagai "embatas daerah yang di"erbanyak adalah ') untai tunggalyang urutannya kom"lemen dengan ') tem"latnya% Proses tersebut miri" dengan "roses

re"likasi ') secara in vivo yang bersi$at semi konservati$%

PCR memungkinkan adanya "erbanyakan ') antara dua "rimer! hanya di dalam tabung reaksi!

tan"a "erlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo% Pada "roses PCR dibutuhkan ') untaiganda yang ber$ungsi sebagai cetakan (tem"lat yang mengandung ')-target (yang akan

diam"li$ikasi untuk "embentukan molekul ') baru! en#im ') "olimerase!

deoksinukleosida tri$os$at (d;P! dan se"asang "rimer oligonukleotida% Pada kondisi tertentu!

kedua "rimer akan mengenali dan berikatan dengan untaian ') kom"lemennya yang terletak "ada awal dan akhir $ragmen ') target! sehingga kedua "rimer tersebut akan menyediakan

gugus hidroksil bebas "ada karbon 59% /etelah kedua "rimer menem"el "ada ') tem"lat! ') "olimerase mengkatalisis "roses "emanjangan kedua "rimer dengan menambahkan nukleotidayang kom"lemen dengan urutan nukleotida tem"lat% ') "olimerase mengkatalisis

 "embentukan ikatan $os$odiester antara OE "ada karbon 59 dengan gugus 89 $os$at d;P yang

ditambahkan% /ehingga "roses "enambahan d;P yang dikatalisis oleh en#im ') "olimeraseini berlangsung dengan arah 89N59 dan disebut reaksi "olimerisasi% 7n#im ') "olimerase

hanya akan menambahkan d;P yang kom"lemen dengan nukleotida yang terda"at "ada rantai

') tem"lat%

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga taha" berurutan! yaitu "emisahan (denaturasi rantai ') tem"lat! "enem"elan (annealing  "asangan "rimer "ada

') target dan "emanjangan (e&tension "rimer atau reaksi "olimerisasi yang dikaalisis oleh

') "olimerase%

6. +egunaan

Polymerase Chain Reaction (PCR da"at digunakan untuk:

*% am"li$ikasi urutan nukleotida%

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 10/12

0% menentukan kondisi urutan nukleotida suatu ') yang mengalami mutasi%

5% bidang kedokteran $orensik%

=% melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan $inger "rint%

. 7aktu yang Dibutuhkan

*% *-0 hari

0% PCR: 5-, jam atau semalam

5% Polyacrylamide gel electro"horesis using &ighty-small 22 gel a""aratus: 0%8 hours

 "oliakrilamid gel elektro$oresis menggunakan &ighty-small 22 bahan gel: 0!8 jam

=% 7tidium bromide staining dan $otogra$i: =8 menit

D. !eagen +husus

*% Pasangan "rimer oligonukleotida sintetik menga"it urutan yang akan diam"li$ikasi

0% Bu$$er PCR 8Q (08+ m& 1Cl! 8+ m& ;ris-ECl "E 4!5! .!8 m& &gCl0

5% Cam"uran dari em"at d;P (d>;P! d);P! d;;P! dC;P masing-masing sebesar 0!8 m&

(ultra murni ';P set! Pharmacia 0.-0+58-+*% ';P cam"uran dibuat dengan

volume *+ m& larutan dari masing-masing em"at d;P ter"isah yang digabung%

=% ;aI ') Polymerase ()m"li;aI;&! Perkin-7lmerHCetus

8% &inyak mineral ringan

,% )krilamida (grade elektro$oresis

.% ! 9-&ethylenebisacrylamide (grade elektro$oresis! Ultra-PureHBRS! 88*,UB

4% )monium "ersul$at (Ultra-PureHBRS! 8805U)

3% ;7&7' (! ! 9 T;etramethylethylenediamine! Ultra-&urni H BRS! 880=UB

8. Peralatan +husus

*% &ighty-small 22 /7-08+ vertical gel electro"horesis unit (Eoe$er

0% Perkin-7lmerHCetus ;hermal Cycler 

5% /terile ;hin-wall +%8 ml ;hermocycler micro$uge tubes: (;C-8! &idwest /cienti$ic

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 11/12

 )omponen PCR lainnya/ 

* 7n#im ') Polymerase

'alam sejarahnya! PCR dilakukan dengan menggunakan 1lenow $ragment ') Polimerase 2

selama reaksi "olimerisasinya% 7n#ime ini ternyata tidak akti$ secara termal selama "rosesdenaturasi! sehingga "eneliti harus menambahkan en#im di setia" siklusnya% /elain itu! en#im ini

hanya bisa di"akai untuk "er"anjangan 0++ b" dan hasilnya menjadi kurang s"esi$ik% Untuk

mengatasi kekurangan tersebut! dalam "erkembangannya kemudian di"akai en#im !a# "NA polymerase yang memiliki keakti$an "ada suhu tinggi% Oleh karenanya! "enambahan en#im tidak 

 "erlu dilakukan di setia" siklusnya! dan "roses PCR da"at dilakukan dalam satu mesin

0 Primer  

Primer meru"akan oligonukleotida "endek rantai tunggal yang mem"unyai urutan kom"lemen

dengan ') tem"lat yang akan di"erbanyak% Panjang "rimer berkisar antara 0+-5+ basa% Untuk

merancang urutan "rimer! "erlu diketahui urutannukleotida "ada awal dan akhir ') target%Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut "NA synthesier %

5 Reagen lainnya

/elain en#im dan "rimer! terda"at juga kom"onen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksiPCR% 1om"onen tersebut adalah d;P untuk reaksi "olimerisasi! dan bu$$er yang mengandung

&gCl0% 1onsentrasi ion &g0Adalam cam"uran reaksi meru"akan hal yang sangat kritis%

1onsentrasi ion &g0A ini sangat mem"engaruhi "roses "rimer annealing! denaturasi! s"esi$isitas "roduk! aktivitas en#im dan $idelitas reaksi%

9. Tahapan P!

1) Denaturasi

/elama "roses denaturasi! ') untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal% Eal ini

disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan "utusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang kom"lemen% Pada taha" ini! seluruh reaksi en#im tidak berjalan! misalnya reaksi

 "olimerisasi "ada siklus yang sebelumnya% 'enaturasi biasanya dilakukan antara suhu 3+ oC 38oC%

#) Penempelan primer

Pada taha" "enem"elan "rimer (annealing ! "rimer akan menuju daerah yang s"esi$ik yangkom"lemen dengan urutan "rimer% Pada "roses annealing ini! ikatan hidrogen akan terbentuk

antara "rimer dengan urutan kom"lemen "ada tem"late% Proses ini biasanya dilakukan "ada suhu

8+ oC ,+ oC% /elanjutnya! ') "olymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebutakan menjadi sangat kuat dan tidak akan "utus kembali a"abila dilakukan reaksi "olimerisasi

selanjutnya! misalnya "ada .0 oC%

7/18/2019 Cara Penggunaan PCR

http://slidepdf.com/reader/full/cara-penggunaan-pcr 12/12

$) !eaksi polimerisasi &e0tension)

Umumnya! reaksi "olimerisasi atau "er"anjangan rantai ini! terjadi "ada suhu .0 oC% Primer yang

telah menem"el tadi akan mengalami "er"anjangan "ada sisi 59nya dengan "enambahan d;Pyang kom"lemen dengan tem"lat oleh ') "olimerase%

Dika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua "rimer akan

diam"li$ikasi secara eks"onensial (disebut am"likon yang beru"a untai ganda! sehingga

menca"ai jumlah co"y yang da"at dirumuskan dengan (0n% 'imana n adalah jumlah siklus dan adalah jumlah awal molekul ')% Dadi! seandainya ada * co"y ') sebelum siklus

 berlangsung! setelah satu siklus! akan menjadi 0 co"y! sesudah 0 siklus akan menjadi =! sesudah

5 siklus akan menjadi 4 ko"i dan seterusnya% /ehingga "erubahan ini akan berlangsung secaraeks"onensial% PCR dengan menggunakan en#im !a# "NA polimerase "ada akhir dari setia"

siklus akan menyebabkan "enambahan satu nukleotida ) "ada ujung 59 dari "otongan ') yang

dihasilkan% /ehingga nantinya "roduk PCR ini da"at di kloning dengan menggunakan vektor

yang ditambahkan nukleotida ; "ada ujung-ujung 89-nya% Proses PCR dilakukan menggunakan

suatu alat yang disebut thermocycler %

%. !eerse Transcription Polymerase hain !eaction &!t-Pcr)

R;-PCR meru"akan singkatan Reverse !ranscription Polymerase Chain Reaction% /e"erti

namanya! "roses R;-PCR meru"akan bagian dari "roses PCR biasa% Perbedaanya dengan PCRyang biasa! "ada "roses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya "erubahan R)

menjadi c') (complementary ') dengan menggunakan en#im Reverse ;ranskri"tase%

Reverse ;ranscri"tase adalah suatu en#im yang da"at mensintesa molekul ') secara in vitromenggunakan tem"late R)%

/e"erti halnya PCR biasa! "ada "engerjaan R;-PCR ini juga di"erlukan ') Polimerase! "rimer! bu$$er! dan d;P% amun berbeda dengan PCR! tem"lat yang digunakan "ada R;-PCR

adalah R) murni% Oleh karena "rimer juga da"at menem"el "ada ') selain "ada R)! maka') yang mengkontaminasi "roses ini harus dibuang% Untuk "roses am"li$ikasi mR) yang

mem"unyai "oly() tail "ada ujung 5! maka oligo d;! random heksamer! mau"un "rimer

s"esi$ik untuk gen tertentu da"at diman$aatkan untuk memulai sintesa c')%

;. etoda Deteksi Produk P! 

Produk PCR adalah segmen ') (am"likon yang berada dalam jumlah jutaan co"y! teta"i tidak da"at dilihat dengan mata telanjang% Oleh karena itu PCR "erlu diikuti dengan suatu taha" akhir

yang bertujuan untuk memvisualisasikan "roduk PCR serta sekaligus bertujuan untukmengetahui ukuran "roduk PCR dan mengetahui a"akah "roduk yang dihasilkan adalah benarse"erti yang diinginkan% /alah satu metoda deteksi yang umum dilakukan adalah elektro$oresis

gen agarosa%