Alat Laboratorium PCR ( Polymerase Chain Reaction )

Alat Laboratorium PCRPolymerase Chain Reaction ( PCR ) adalah teknik yang paling umum digunakan oleh para peneliti bidang biologi molekuler dan genetika.Prinsip umum kerja PCR adalah mengadakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim. Nama lainya adalah ( Thermal Cycler ) Prinsip kerja dari PCR Dengan ilmu elektronika adalah pada dasarnya menggunakan Peltier di mana komponen tersebut berfungsi sebagai peng hantar panas dan penghantar dinggin dengan cara merubah tegangan power pada inputan.Dimana peltier ini memiliki kecepatan akan perubahan suhu. dengan kecepan yang sangat tinggi .Para Ahli teknologi elektronika di jaman sekarang bisa mencapai kecepatan 10 derajat per detik di mana peltier tersebut hanya berfungsi sebagai pemanas maupun pendingginan ,dalam hal ini saya membahas prinsip Dasr kerja alat PCR Yang terdiri dari:Power supply,Control program ,Peltier ,Heater lid ( pintu penutup )

Power supply : Sebagai power pada keseluruhan alat tersebut di mana Pada alat PCR power Suply sama seperti pada power supply pada umumnya yang membedakan adalah pada alat PCR ada yang menggunakan satu peltier atau lebih dari satu peltier biasanya bisa mencapai 30Amp

Control program : di mana alat PCR di Kendalikan dengan Program. Di mana Program tersebut hanya berfungsi mengendalikan Peltier ,berapa derajat yang akan di gunakan untuk pemanasan dan kerapa derajat pendinginan serta waktu. Dan berapa cycle kita akan mengulang suhu tersebut dengan kecepatan waktu yang sangat singkat disini kita bisa membedakan Kemampuan alat dan keakurasian temperatur pada alat tersebut karenabisa mempengaruhi hasil dari sampel yang akan di uji oleh peneliti

Ada 3 tahap dalam kerja PCRDenaturing : adalah proses memisahkan 2 untai pilihan DNA. Pada tahap ini ,ikatan hydrogen yang menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing- masing akan menjadi untai tunggal . biasanya suhu Denaturing berkisar antar 92-94 derajat celcius

Aneling : adalah tahapan di mana primer forward dan reverse mencari pasanganya di untai DNA jika pas dia akan melekat suhu aneling biasanya berkisar antara 40-50 derajat celcius suhu yang biasanya umum di pakai adalah 50-52 derajat C.Setelah itu mesin PCR akan kembali memanaskan sup DNA lagi ke suhu 72 derajat C.agar Taq polymerase bekerja menggandakan potongan DNA.Biasanya ketiga tahap ini di ulang sebanyak 30 kali untuk mendapatkan 1.073.741.766 clone potongan DNA

Biasanya potongan DNA inilah yang di manfaatkan oleh para peneliti untuk mendeteksi penyakit,silsilah keturunan ,dan membuktikan kasus criminalhttp://boemitechnoinstrument.blogspot.com/2013/01/alat-laboratorium-pcr-polymerase-chain.html

Alat laboratorium Thermal CyclerAlat laboratorium Thermal Cycler  (juga dikenal sebagai thermocycler,

mesin PCR atau amplifier DNA) adalah peralatan laboratorium yang paling

umum digunakan untuk memperbanyak segmen DNA melalui polymerase

chain reaction (PCR).  Thermal Cycler  juga dapat digunakan di

laboratorium untuk memfasilitasi reaksi lain yang membutuhkan reaksi

yang sensitif terhadap suhu, termasuk reaksi enzim restriksi atau

diagnosa yang cepat. Perangkat ini dilengkapi dengan blok termal dengan

lubang yang dapat menampung tabung reaksi (tube) dimana yang

menampung reagensia. Thermal Cycler kemudian mengontrol suhu, naik

dan turun sesuai dengan program yang dimasukan kedalam komputer

PCR tersebut, sehingga proses polymerase chain reaction (PCR) terjadi.

http://www.biozatix-news.com/alat-laboratorium-thermal-cycler-pcr/

PERALATAN LABORATORIUM UNTUK ANALISA METODA PCRPosted April 6th, 2012 by copernicus  & filed under Product .Peralatan laboratorium untuk analisa dengan metoda PCR sekarang berkembang dengan sangat cepat. Berikut kami tuliskan daftar peralatan yang dibutuhkan, semoga bermanfaat.

Daftar Peralatan Laboratorium yang dibutuhkan :

Rocker, Shakers, Rotators Mini-Rocker Shaker

Shaker-Rocker

Mini Shaker

Shaker

Mini Shaker for immunology

Orbital Shaker

Multi Functional Orbital shaker

Mini Rotator for test tube with timer

Programmable rotator

Thermo-Shakers, Shakers-Incubators Plate Shakers-Thermostats

Thermo-Shaker for microtubes and PCR Plates

Thermo-Shaker with cooling for microtubes and PCR Plates

Enviromental Shaker-Incubator

Vortexes Personal vortex for tube

Multi vortex for tubes

Multi Speed Vortex

Centrifuge, Combispins, Multispins Mini-Centrifuge / Vortex

Centrifuge / Vortex Multispin

Laboratory Centrifuge

Laboratory Bench-top centrifuge with refrigeration

High Speed Mini Centrifuge

 

Thermostats Dry Block thermostats

Heating and cooling thermostats

Heating / Cooling Dry Block

Universal stirred water bath

Stirred water bath

Dry Block thermostats for spectrocells and strips

unstirred water bath

Dry block heating systems with interchangeable blovks

Stirred thermostatic baths and hearting circulators

Refrigerated thermostatic baths and circulators

linear Shaking baths

Magnetic Stirrers, Overhead Stirrers High speed magnetic stirrers

Magnetic stirrers with hot plate

Overhead stirrer multi mixer

UV-cabinets for PCR, UV Air Recirculators UV-cabinets for PCR operations

UV-air flow cleaner -recirculators

Densitometers, Fluorometers Densitometers ( suspensions turbidity detector )

3 Channel fluorometer

Washers, Aspirators Inteliwasher

Aspirator with trap flask

Life Science products Pipette tips and Filter tips

Precison Dispenser Tips

Microcentrifuge Tubes

PCR Tubes

Sample Storage

Microplates

Cuvettes

Untuk informasi spesifikasi dan harga peralatan laboratorium , silahkan hubungi kami di O852-6727-7949, 0857-7432-3083  atau e mail kami di sales@AlatAlatLaboratorium.com.

http://alatalatlaboratorium.com/Blog/peralatan-laboratorium

PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis. Tehnik PCR telah dikembangkan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi, seperti Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M. TuberculosisMerupakan pemeriksaan dengan menggunakan teknologi amplifikasi asam nukleat virus, untuk mengetahui ada tidaknya virus / DNA virus, untuk memperkirakan jumlah virus dalam tubuh, untuk mengetahui jenis virus ( genotipe atau subgenotipe ) yang menginfeksi.Tujuan :Pemantauan terapi obat anti – viral , melihat respon terapi dan menentukan lama terapi yang dibutuhkan. Jenis pemeriksaan : HBV – DNA, HCV Genotipe, HCV-RNA kualitatif, HCV-RNA kuantitatif, HPV-DNA ( High-Risk Type )Syarat : Tidak diperlukan persiapan khusus sebelumnya.

Dengue RNA

Nama Pemeriksaan DENGUE VIRUS RNA

Manfaat PemeriksaanDeteksi virus dengue dengan metode RT-PCR

untuk diagnosis infeksi oleh Dengue Virus

Metode PCR

Sampel Serum

Volume Minimal 2 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel

Pada phase Viraemia serum dapat disimpan

pada suhu -20° C max 1 minggu atau pada

suhu -80° C untuk waktu tak terbatas

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan

Nilai Rujukan Negatip

HBV DNA

Nama Pemeriksaan HBV – DNA ( kuantitatif )

Manfaat Pemeriksaan

Deteksi HBV-DNA dalam darah dengan metode

PCR untuk management infeksi oleh virus

Hepatitis B

Metode PCR

Sampel Serum

Volume Minimal 1 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel

Serum disimpan di -20° C max 2 minggu atau

disimpan pada suhu – 80° C untuk waktu tak

terbatas

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai RujukanDetection Limit : 6 IU/mLRange Liniaritas : 29

– 1.10 x 10^8 IU/mL

HCV Genotype

Nama Pemeriksaan HCV GENOTYPING

Manfaat PemeriksaanKlasifikasi HCV kedalam sub-type metode PCR

untuk diagnosis, prognosis dan therapy

Metode PCR

Sampel Serum

Volume Minimal 1 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel

Serum disimpan di -20° C max 2 minggu atau

disimpan pada suhu -80° C untuk waktu tak

terbatas

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai Rujukan Negatip

HCV RNA

Nama Pemeriksaan HCV-RNA ( kualitatif )

Manfaat Pemeriksaan

Deteksi HCV-RNA dalam darah dengan metode

RT-PCR untuk management infeksi virus

Hepatitis C

Metode PCR

Sampel Serum

Volume Minimal 1 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel 2 – 8 ⁰C , 7   hari

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai Rujukan Negatif

Catatan

Sensitivity :+/- 10 copy RNA/ml        

Specitivity : Dengan menggunakan 5 UTR

region primer positif untuk semua sub type

HCV RNA Kuanti

Nama Pemeriksaan HCV-RNA ( kuantitatif )

Manfaat Pemeriksaan

Menghitung jumlah HCV-RNA dalam darah

dengan metode RT-PCR (Viral Load) untuk

monitor terapi infeksi oleh virus Hepatitis C

Metode PCR

Sampel Serum

Volume Minimal 1 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel 2 – 8 ⁰C , 7 hari

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai Rujukan Negatif

Catatan

Sensitivity :+/- 500 copy RNA/ml        

Specitivity : Dengan menggunakan 5 UTR

region primer positif untuk semua sub type

MTB DNA

Nama Pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis-DNA

Manfaat PemeriksaanDeteksi Mycobacterium tuberculosis dengan

metode PCR

Metode PCR

Sampel Sputum

Volume Minimal 1 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas SampelUntuk darah dapat dipakai 2ml EDTA

(penyimpanan suhu 4° C )

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai Rujukan Negatip

CatatanSampel bisa berupa cairan otak maupun cairan

tubuh yang lain

S. Typhi DNA

Nama Pemeriksaan Salmonella typhi DNA

Manfaat PemeriksaanDeteksi Salmonella typhi dalam darah dengan

metode PCR untuk diagnosis demam typhoid

Metode PCR

Sampel EDTA ( 2ml darah : 1 tetes EDTA 10%)

Volume Minimal 2 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel suhu 2 – 8°   C : 6 hari

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai Rujukan Negatip

TTV DNA

Nama Pemeriksaan TTV-DNA

Manfaat PemeriksaanDeteksi TTV-DNA dalam serum dengan metode

PCR,untuk diagnosis infeksi virus Hepatitis TT

Metode PCR

Sampel Serum

Volume Minimal 1 ml

Persiapan Pasien Tidak diperlukan persiapan khusus

Stabilitas Sampel

Serum disimpan si -20° C max 2 minggu atau

disimpan pada suhu -80° C untuk waktu tak

terbatas

Penanganan Sampel/

Transportasiice pack (suhu: 2 – 8° C )

Kriteria Penolakan Hemolisis

Nilai Rujukan Negatip

http://labcito.co.id/pemeriksaan-pcr/

Molecular facilitiesA wide range of DNA techniques and data analysis.Ancient DNA lab

Ion Torrent lab

Barcoding sampling lab

Barcoding molecular lab

Post lab

Ancient DNA labIn this laboratory, DNA extractions on very old specimens such as mammoths and museum

material, are performed under ultra clean conditions.

1. PCR-cabinet. Provides an ultra-clean working space during PCR setup minimizing the risk of

contamination. A powerful UV light is used to sterilize the interior before use.

2. UV cross linker. Sterilizes all lab ware before use.

3. Extraction cabinet. Provides an ultra-clean space to work in during DNA extraction. A powerful

UV light is used to sterilize the interior before use.

Ion Torrent labIn this laboratory, large amounts of DNA reads from e.g. environmental samples or genomes, are

produced cost and time effective by means of next generation sequencing.

1. One Touch 2. Attaches one DNA fragment to a particle. This fragment will be multiplied on the

particle.

2. Enricher. Purifies only the particles with DNA attached to them out of the mix coming from the

One Touch 2.

3. Ion Torrent. Sequencer which can simultaneously read the DNA-sequence of 1,000,000

fragments. Each fragment is attached to a particle and each particle is in its own well on a chip.

4. Argon tank. Provides pressure for the operation of different Ion Torrent machines.

5. Server. Processes all data from the Ion Torrent.

6. Bioanalyzer. Determines the length and concentration of DNA-fragments by means of a chip.

7. Qubit fluorometer. Quantitates DNA, RNA, and protein concentration with fluorescence.

8. QIAxcel. Determines the length and concentration of DNA-fragments.

9. Thermocycler. Amplifies the signal of particular DNA-fragments by means of a chain reaction.

10. Real-time thermocycler. Amplifies the signal of particular DNA-fragments by means of a chain

reaction. During the reaction the amount of DNA is measured with fluorescence.

11. SpeedVac. Removes solvents from DNA-solutions for long term storage.

Back to top

Barcoding sampling labIn this part of the DNA barcoding lab, specimens are photographed, sub-sampled and prepared for

high-throughput DNA extraction.

1. SLR setup. To photograph samples larger than 3 cm.

2. Carl Zeiss Discovery V20 stereo microscope for stacking photography. To photograph samples

smaller than 3 cm. By merging several photographs of one sample, at different focal planes, a

single final photograph is created in which the entire sample is in focus.

3. Carl Zeiss Discovery V12 stereo microscope for stacking photography. To photograph samples

smaller than 3 cm.

4. Carl Zeiss Discovery V8 stereo microscope. Enlarges up to 60x to aid with subsampling small

samples.

5. Hot bead sterilizers. Sterilizes forceps in 20 seconds, without damaging them, by using glass

beads heated to 250°C.

6. Fume hood. Extracts hazardous vapors of e.g. alcohol or formalin.

7. Cabinet. For temporary storage of samples.

Back to top

Barcoding molecular labIn this part of the DNA barcoding lab, DNA is extracted and prepared for PCR.

1. Vortex. For mixing the contents of plates or tubes.

2. Shaking heat block. Heats the contents of plates while shaking them, thus dissolving tissue.

3. Scales. For very accurately weighing chemicals.

4. Centrifuge. Can spin plates at 3700 rpm to move all liquid to the bottom of the wells.

5. Scanner. Reads the matrix-codes on the bottom of tubes with DNA-extracts.

6. Xiril pipetting station. Automatically fills plates, creates dilutions, reaction mixes and can join

samples from several plates to a single plate using 8 automatic pipettes.

7. Fume hood. Extracts hazardous vapors of e.g. chloroform.

8. Heat block. Heats tubes accurately to the desired temperature.

9. Kingfisher extraction robot. Extracts DNA from dissolved tissue using magnetic beads. These

beads are covered with a coating to which the DNA is attached.

10. SELMA pipetting station. Can pipette an entire plate at once with 96 pipettes.

Back to top

Post labIn this laboratory, the size and amount of DNA in PCR products is analyzed.

1. E-gel. Separates DNA-fragments of different lengths by running them on an agarose-gel with an

electric current. Additionally ethidium bromide is attached to the DNA.

2. Gel imager. Visualizes DNA-fragments in an agarose-gel with uv-light. Ethidium bromide,

attached to the DNA, is illuminated by uv-light.

https://science.naturalis.nl/en/labs-services/laboratories/molecular-biology-facilities/

ArticlesDebbie S. Retnoningrum, PhDPolymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction atau sering disingkat sebagai PCR adalah suatu teknik

perbanyakan materi genetik baik DNA yang terdapat pada kebanyakan

mikroorganisme penyebab penyakit maupun RNA yang terdapat pada virus

tertentu seperti virus imunodefisiensi manusia (HIV, penyebab AIDS) dan virus

hepatitis C (HCV, penyebab hepatitis C). Karena kemampuan PCR untuk

memperbanyak jumlah materi genetik sangat tinggi, maka PCR dapat digunakan

untuk mendeteksi keberadaan materi genetik dengan jumlah sangat rendah dalam

suatu spesimen atau sampel. PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap

siklus terjadi penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-

ulang, maka materi genetik yang diperoleh akan menjadi banyak sehingga

mempermudah deteksi keberadaannya. Secara umum, PCR dilakukan sebanyak

25 – 35 siklus.

Kegunaan PCR

PCR banyak digunakan untuk berbagai tujuan, misalnya mendiagnosis penyakit

keturunan (penyakit genetik), mendeteksi keberadaan penyebab penyakit infeksi

seperti bakteri dan virus, mempelajari evolusi manusia, forensik dan lain

sebagainya.

Peran PCR dalam laboratorium klinik

PCR dapat digunakan untuk menentukan secara kualitatif keberadaan suatu

penyebab penyakit (patogen) dalam suatu spesimen dari individu yang diduga

terinfeksi oleh suatu patogen. Selain itu, PCR juga dapat digunakan untuk

menentukan kandungan materi genetik baik DNA maupun RNA dalam suatu

spesimen. Penentuan kandungan materi genetik dapat dilakukan dengan PCR

kuantitatif dan sangat penting untuk pemantauan terapi obat penyakit hepatitis B,

hepatitis C dan AIDS.

Bagaimana PCR dilakukan?

PCR dilakukan menggunakan beberapa tahap. Pertama-tama, materi genetik harus

diisolasi dari spesimen biologi, kemudian materi genetik diperbanyak secara

spesifik menggunakan reaksi enzimatik dan tahap terakhir adalah tahap deteksi

untuk mengetahui keberadaan dan kebenaran produk PCR. Tahap deteksi dapat

dilakukan dengan beberapa cara salah satunya yaitu dengan hibridisasi. 

Hibridisasi adalah suatu metode dimana produk PCR akan dikenali secara spesifik

dengan suatu reagen, berupa materi genetik. Reagen ini disebut pelacak. Pelacak

dapat ditandai dengan penanda warna atau fluoresense.

PCR konvensional

PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi genetik dan

tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi

dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Tahap deteksi dapat

dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya menggunakan

elektroforesis gel kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi pada membran

menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi dalam tabung reaksi. Jika yang

diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka DNA dapat langsung

diperbanyak, tetapi jika yang diisolasi berupa RNA, maka diperlukan tahap

tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap transkripsi balik.

Dalam hal ini, metode yang digunakan disebut RT-PCR (reverse-transcription

PCR). Tahapan dalam PCR dan RT-PCR konvensional dengan format deteksinya

dapat dilihat pada gambar di atas.

Keterbatasan PCR konvensional

Pada PCR konvensional, deteksi produk PCR dilakukan hanya pada tahap akhir.

Seperti terlihat pada gambar di samping ini, deteksi tahap akhir menunjukkan

hasil yang bervariasi sehingga dapat memberikan pembacaan yang kurang akurat.

PCR hibridisasi merupakan salah satu contoh PCR konvensional dengan produk

komersialnya yaitu Cobas Amplicor. Pada Cobas Amplicor, deteksi dilakukan

secara kolorimetri setelah perbanyakan materi genetik selesai. Keterbatasan lain

untuk PCR hibridisasi adalah batas deteksi atau batas kuantitasi kandungan DNA

atau RNA dalam sampel tidak cukup rendah dan rentang linearitas yang tidak

cukup luas. 

Real-time PCR 

Berbeda dengan PCR konvensioal, pada real-time PCR tahap deteksi dan tahap

penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan). Hal ini

menawarkan beberapa keunggulan yaitu: deteksi produk PCR dilakukan pada fase

eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan

presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan menggunakan pelacak bertanda

fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan kespesifikan hasil.

Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi.

Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang

linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA

di dalam spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang

menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman.  

Real-time PCR dalam diagnosa klinik

Real-time PCR atau RT-PCR (jika materi genetik berupa RNA) dapat digunakan

untuk penentuan kandungan DNA virus (misalnya virus hepatitis B) dan RNA

virus (misalnya virus hepatitis C). Penentuan kandungan DNA atau RNA virus

sangat dibutuhkan untuk pemantauan dan penentuan waktu yang tepat memulai

pengobatan. Pemantauan pengobatan diperlukan untuk mengetahui apakah obat

telah bekerja dengan baik atau tidak.  

Laboratorium Klinik PRAMITA telah dapat melakukan pemeriksaan HBV DNA

Kuantitatif dan HCV RNA Kuantitatif dengan metode Real Time PCR, sebagai bentuk

komitmen untuk selalu berinovasi dalam memenuhi kebutuhan akan diagnosa dan

pelayanan yang berkualitas. 

http://pramita.co.id/index.php/component/content/article/30-real-time-polymerase-chain-reaction

UJI VALIDITAS TEKNIK PCR (Polymerase Chain Reaction) DAN PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS BAKTERI TAHAN ASAM SEBAGAI ALAT DIAGNOSIS PENDERITA TB PARU DI RUMAH SAKIT PERSAHABATAN, JAKARTABasundari Sri Utami, Syahrial Harun, Riyanti Ekowatiningsih, Enny Yuwarni, Liliana Kurniawan, Tjandra Yoga Aditama

Abstract

Salah satu faktor yang menghambat program pemberantasan tuberkulosis paru adalah belum tersedianya alat diagnosis cepat yang dapat menentukan adanya bakteri Mycobacterium tuberculosis dalam sputum. Diagnosis cepat dan tepat sangat penting untuk menentukan pengobatan dan memutus rantai penularan. PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis. Tehnik PCR telah dikembangkan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi, seperti Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M.tuberculosis.

Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan validitas PCR sebagai perangkat diagnosis pada tersangka penderita tuberkulosis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi manfaat bagi program pemberantasan tuberkulosis terutama sebagai informasi tentang validitas diagnosis dan kemungkinan penggunaan PCR sebagai alat diagnosis.

Sebanyak 70 sampel sputum diambil dari tersangka penderita tuberkulosis, diperiksa menggunakan 3 jenis pemeriksaan: mikroskopis bakteri tahan asam (BTA), uji PCR dan metode biakan yang berfungsi sebagai baku emas (gold standard). Validitas diagnosis ditentukan dengan menghitung sensitifitas, spesifisitas, nilai duga positif dan negatif, rasio kecenderungan positif dan negatif, akurasi dari masing masing hasil diagnosis (mikroskopis BTA dan PCR).

Sensitifitas dan spesifisitas pemeriksaan mikroskopis BTA adalah 77,2% (CI = 95%; 0,7837- 0,7603) dan 95,8% (CI = 95%; 0,96361- 0,9523) dengan nilai duga positif dan negatif 89,4% dan 90,1% dengan rasio kecenderungan (LR +) = 18,8 dan (LR -) = 0,23. Hasil uji PCR menunjukkan sensitifitas dan spesifisitas pemeriksaan sebesar 90% (CI = 95%; 0,90705 - 0,89295) dan 79% (CI = 95%; 0,7995 - 0,78043) dengan nilai duga positif dan negatif 66% dan 95% dengan rasio kecenderungan (LR +) = 3,18 dan (LR -) = 0,11.

Sebagai perangkat diagnosis TB paru, PCR valid dapat membedakan penderita TB paru dan bukan penderita TB paru, akan tetapi kurang reliabel dibanding hasil pemeriksaan mikroskopis BTA.

http://ejournal.litbang.depkes.go.id/index.php/MPK/article/view/1072

PCR (Era Uji Diagnoistik Molekuler Terkini) UJI DIAGNOSTIK MOLEKULER Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan), uji-uji diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. Berbagai uji diagnostik telah dikembangkan, baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit, reraksi kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. Dengan berkembangnya teknologi dalam bidang biologi molekuler, maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya. Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen, yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin); 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA); dan 3) fosfat. Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama, yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda, untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]; dan G dengan C). Unsur gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA. DNA memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan RNA. Berdasarkan materi genetik tersebut, uji-uji diagnostik dikembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat; polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing asam nukleat. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis, telah membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis DNA baru, karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C. Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA yang tepat. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. Berbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepanjang rantai DNA, maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu, tetapi hanya untuk satu segmen tertentu saja dari suatu DNA. Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun 1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April, malam Jumat, 1983, saat membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific, 1990, yang memberiny peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis, khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek (<200bp), tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar, karena hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang heterogen. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Situasi yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan dari PCR. Setelah beberapa tahun berikutnya

didapatkan enzim thermostable DNA Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase, PCR menjadi sangat populer dalam penelitian. Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR secara automatis, sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin. Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya. Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut, maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya, dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar 4 jam pada mesin PCR. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai zat lainnya, kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi. Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. Pada perkembangan penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. Permunian sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). Metode ini menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. GuSCN dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam sampel dari rumah sakit. GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam nukleat, sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat. Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. Satu siklus terdiri dari 3 tahap, yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C, tahap hibridisasi primer pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C. Secara umum, DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. DNA target yang akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan, kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. Bila tahap polimerisasi dimulai, maka rantai DNA target yang terdapat di antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama seperti DNA target. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi, hibridisasi dan polimerisasi beberapa kali, maka DNA target akan diperbanyak secana efektif. Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA, digunakan pada tahap awal proses PCR, maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat diamplifikasi. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada temperatur yang berbeda pada tahap, dalam suatu siklus PCR, yaitu tahap : 1. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah, karena panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. 2. Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses pembentukan iktan hidroksi.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer. 3. Extension ( Perpanjangan) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah proses pemanjangan rantai baru DNA yang berkomplementar, dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA, temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72o C. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat yang spesifik, atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing. Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR, dibedakan antara PCR unipleks dan PCR multipleks. Bila digunakan hanya satu pasang

primer disebut PCR unipleks, sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi, annealing dan elongation, terkecuali pada kandungan PCR-miks, waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur. PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi, termasuk M. tuberkulosis dan mikobakterium lain, sedangkan PCR multipleks selain digunakan untuk diagnosis, juga untuk tes resistensi terhadap OAT. Copy the BEST Traders and Make Money (One Click) : http://ow.ly/KNICZ

Copy the BEST Traders and Make Money (One Click) : http://ow.ly/KNICZ

http://teklabkes.blogspot.com/2010/06/pcr-era-uji-diagnoistik-molekuler.html