PENENTUAN METHEMOGLOBIN

DENGAN SPEKTROFOTOMETRI

Pengantar

Fungsi utama hemoglobin adalah untuk mengangkut oksigen dan

karbon dioksida di dalam tubuh.Molekul hemoglobin normal terdiri dari

empat rantai polipeptida yang disebut globin, yang secara protektif

membungkus sekitar empat subunit berpigmen yang disebut heme. Setiap

hemes mengandung besi dalam bentuferro (Fe2+) yang dapat mengikat

secara reversibel dengan molekul oksigen tunggal.

Methemoglobin adalah bentuk hemoglobin yang abnormal yang

memiliki kapasitas untuk mampu mengurangipembawaan

oksigen. Methemoglobin diproduksi ketika besi ferro (Fe2+) dalam molekul

heme yang teroksidasi menjadi bentuk ferri (Fe3+). Sementara dalam bentuk

teroksidasi, besi ferri dalam subunit heme tidak mampu mengikat

oksigen. Senyawa ini tidak dapat memberikan oksigen ke jaringan, karena

itu, hal ini menguntungkan untuk mengubah 3+ hemoglobin ke bentuk ferro

2+ sehingga jaringan bisa mendapatkan oksigen yang mereka butuhkan.

Adanya substansi teroksidasi endogen dan eksogen yang konstan

menghasilkan pembentukan methemoglobin secara terus-menerus. Pada

individu normal, tingkat methemoglobin dipertahankan di bawah 1% melalui

dua jalur metabolisme. Jalur utama melibatkan reduksi enzimatik dari produk

glikolitik NAD menjadi NADH (Nikotinamida adenin dinukleotida). NADH

kemudian bertindak sebagai donor elektron dalam reduksi besi ferri (Fe3+)

methemoglobin menjadi bentuk ferro (Fe2+). Enzim NADH methemoglobin

reduktase diperlukan untuk reduksi NAD dan methemoglobin.

Dalam eritrosit, proses reduksi enzimatik methemoglobin juga dapat

dicapai melalui reduksi NADP yang dihasilkan melalui jalur heksosa

monofosfat.NADPH kemudian bertindak sebagai agen pereduksi dalam

konversi tergantung dari enzim methemoglobin dengan

hemoglobin. Sementara jalur ini memiliki peran sangat kecil dalam reduksi

harian methemoglobin, hal ini dapat menyebabkan adanya donor elektron

eksogen, seperti metilen blue. Ketika diberikan metilen blue

teradministrasi,hal ini kan terkonversi menjadi sebuah agen reduksi kuat

yang disebut leukomethyleneblue oleh NADPD. Leukomethylene blue

kemudian dapat bereaksi dengan methemoglobin yang mengakibatkan

terjadinya proses reduksi pada hemoglobin dan perbaikan kapasitas

pembawa oksigen normal.

Terdapat sejumlah obat-obatan dan agen toksik yang dapat

mengkonversi hemoglobin menjadi methemoglobin, seperti nitrat, klorat,

quinines, phenacetin, sulfonamide, pewarna anilin, dan anestesi lokal seperti

prokain, benzocaines, danlidokain.Mekanisme yang tepat dari toksisitas

bervariasi antara tiap agen. Beberapa agen memiliki efek mengoksidasi

langsung pada hemoglobin sementara agen lainnya menyebabkan

pembentukan radikal oksigen dan radikal bebas peroksida, yang mampu

mengoksidasi hemoglobin.

Perkembangan methemoglobinemia diikuti oleh paparan pada

substansi oksidatif yang tidak terbatas pada rute oral. Secara klinis, level

methemoglobin yang signifikan telah diamati pada pasien yang telah

mengalami paparan melaui kulit pada nitrit yang mudah menguap, metode

umum dari penyalahgunaan substansi, juga menghasilkan methemoglobin.

Presentasi Klinis

Tanda dan gejala methemoglobinemia adalah sama terlepas dari

etiologi, namun onset waktu mereka dan durasi adalah agen yang

spesifik. Bagi banyak agen, awal methemoglobinemia ini dalam waktu 1-2

jam, tetapi ditunda untuk agen lain seperti dapson dan nitroethane. Ketika

kadar methemoglobine di bawah 10% biasanya tidak ada gejala. Perubahan

warna kulit sianotik adalah tipically diamati pada tingkat yang lebih besar

dari 15% dan sering salah satu fitur yang terbukti secara klinis awal

methemoglobinemia. Sebagai tingkat naikmethemoglobinemia, keparahan

meningkat (Tabel 1). Toksisitas yang serius diharapkan dengan tingkat yang

lebih besar dari 50%, dan tingkat di atas 70% berhubungan dengan

kematian.

Tabel 1. Konsentrasi methemoglobin dan gejala

Konsentrasi Gejala

15 - 20 % cyanosis, chocolate brown arterial blood

20 - 50 % kelelahan, kelemahan, pusing, gelisah, kebingungan,

sakit kepala, dispnea, takikardia

50 - 70 % lesu, stupor, asidosis, koma, kejang, arrhytmias

Prinsip

Spektrum absorbansi dari methemoglobin nampak sedikit, puncak

karakteristiknya pada gelombang 630-635 nm. Penambahan sianamida

menghilangkan puncak ini dengan mengkonversi methemoglobin menjadi

cyanmethemoglobin. Penurunan absorbansi sebanding dengan konsentrasi

methemoglobin.

Spektrum absorbansi yang normal pada oksihemoglobin menunjukkan

absorbansi yang sangat sedikit di atas 600 nm. Namun, jika sulfhemoglobin

terdapatdi dalam hemolisat, terdapat peningkatan besar dalam kurva

absorpsi pada kisaran 600-620nm.Nilai stabil Sulfhemoglobin tidak

terpengaruh terhadap sianida.

Spesimen

Darah segar dari atau yang diberi antikoagulasi dengan heparin, EDTA

atau larutan ACD (asam-sitrat-dekstrosa). Tidak dibutuhkan pembatasan

atau tidak perlu puasa makanan dan minuman.

Reagen

1. Hemoglobin standar 13%

2. Potassium ferricyanide [K3Fe(CN)6]. Pelarut 2,0 g [K3Fe(CN)6] yang

disuling dan dilarutkan pada 10,0 mL H2O. Jika disimpan dalam botol

coklat pada suhu 4°C, larutan ini stabil setidaknya selama satu tahun

3. Larutan potassium sianida. (PERHATIAN: racun mematikan). Pelarut 500

mg KCN yang disuling dan dilarutkan pada 10,0 mL H2O. Label

"RACUN" stabil pada suhu 20°C selama minimal 4 bulan.

4. Buffer potassium fosfat 0,15 mol / L, pH 6,6 (200C). Pelarut 17,1 g

K2HPO4 yang disuling pada air. Transfer larutan KH2P04 ke dalam gelas

kimia 2L dan menambahkan volume larutan K2HPO4. Tempatkan

elektroda pH dalam gelas kimia. Kemudian perlahan-lahan

menambahkan lebih banyak larutan K2HPO4, dengan pengadukan yang

konstan, sampai tercampur dan menunjukkan pH 6,6. Simpan pada

40C. Buang larutanketika larutan terlihat keruh.Buffer yang baru harus

disiapkan setidaknya sekali setiap tiga bulan

Prosedur

1. Siapkan cuvet blanko yang berisi 1,5 ml buffer fosfat dan 1,5 mL

H2O. Tandai kuvet ini dengan label C1

2. Masukkan 0,1 mL darah menggunakan pipet ke dalam tabung reaksi

berisi 3,0 ml pelarut H2O, dikocok melingkar agar tercampur dengan

baik

3. Tambahkan 0,4 mL buffer potassium fosfat dan aduk rata

4. Memindahkan 3 mL hemolisat ke dalam 2 cuvet. Beri label C2 dan C3

5. Pada cuvet C3, tambahkan 0,1 mL larutan [K3Fe(CN)6]. Tutup dengan

parafilm, campur dengan membolak-balikkan kuvet sebanyak3x, dan

menghitung absorbansi pada menit ke-2

6. Menghitung absorbansi pada 630 nm untuk cuvet C2 dan C3,

menggunakan C1 sebagai blanko. Catat sebagai A2A dan A3a

7. Tambahkan 0,1 mL KCN pada semua cuvet. (tambahkan 2 tetes

denganmenggunakan pipet transfer yang dilengkapi dengan bohlam

karet). Campur dengan membolak-balikkan kuvet sebanyak3xdan

diamkan selama 5 menit

8. Hitung absorbansi pada 630 nm untuk cuvet C2 dan C3 dengan C1

sebagai blanko. Catat sebagai A2b dan A3b

 

Perhitungan

                                                                        A2A - A2b

Methemoglobin (persen dari pigmen total) = 100 --------------------

                                                                        A3a - A3b

Referensi Range: 0 - 1%

Komentar dan Kewaspadaan

Solusi hemoglobin sedikit keruh, namun, karena kekeruhan tidak

berubah dengan penambahan [K3Fe(CN)6] atau KCN, absorbansi

menyebabkan sama untuk kedua pembacaan dengan masing-masing cuvet

dan karena itu kompensasi dalam perhitungan ini. Metode sederhana ini

memuaskan untuk pengujian methemoglobin jika uji sulfhemoglobin tidak

diperlukan.