MAKALAH BIOTEKNOLOGIINSULIN LISPRO

Disusun oleh :Kelompok 5

Mia rahmania ( 132210101016 )Risti Rostiani ( 132210101042 )Nur Marlina ( 132210101078 )Dhea Chitarizka( 132210101102 )

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS JEMBER2015

PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangRekayasa genetika telah memproduksi vaksin subunit yang berasal dari protein permukaan virus. Vaksin sub unit pertama diproduksi adalah vaksin hepatitis. Dengan menggunakan vaksin sub unit, tidak ada resiko terjadi infeksi, dibandingkan dengan penggunaan vaksin yang berasal dari virus utuh (Dewi Pertiwi, 2013).Sejak vaksin diperkenalkan Edward Jenner 1796, vaksinasi sering dilakukan untuk melindungi manusia dan hewan terhadap infeksi virus. Keberhasilan vaksinasi tercermin dari berkurangnya penyakit-penyakit infeksi pada manusia dan hewan ternak. Vaksinasi sekarang menjadi istilah umum untuk pemaparan antigen terhadap manusia atau binatang dalam membangkitkan respon kekebalan. Kebanyakan vaksin virus yang digunakan saat ini merupakan sel utuh yang telah dilemahkan atau dimatikan. Keuntungan vaksin ini pada umumnya mampu menghasilkan imunitas cukup lama dan merangsang seluruh reaksi kekebalan pada host yaitu humoral antibody dan cell-mediated (Wija, 2013).Insulin merupakan protein manusia pertama yang disintesis secara kimia. Secara tradisional, insulin untuk pengobatan pada manusia diisolasi dari pankreas sapi atau babi. Pada tahun 1981 telah terjadi perbaikan secara berarti cara produksi insulin melalui rekayasa genetika. Insulin yang diperoleh dengan cara ini mempunyai struktur mirip dengan insulin manusia. Melalui teknologi DNA rekombinan, insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak patogen. Karena kedua hal tersebut di atas, insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek samping yang relatif sangat rendah dibandingkan dengan insulin yang diperoleh dari ekstrak pankreas hewan, tidak menimbulkan efek alergi serta tidak mengandung kontaminan berbahaya. Insulin manusia yang bekerja singkat (short-acting/regular human insulin) yang bekerja sebagai prandial insulin masih memiliki berbagai kelemahan, antara lain mula kerja yang lambat (perlu di berikan 30-45 menit sebelum makan), risiko keamanan bila batal makan, masa kerja yang panjang, hipoglikemia post-prandial 4-6 jam setelah makan, risiko hiperinsulinemia.Dikembakangkannya insulin analog yang bekerja cepat(rapid acting).Seperti insulin lispro, insulin aspart serta insulin glusine menghasilkan insulin yang memiliki penyerapan di subkutan yang lebih cepat, puncak kerja yang lebih singkat dan tinggi serta masa kerja yang juga lebih singkat. Akibatnya waktu pemberian menjadi lebih dekat dengan waktu makan, bahkan dapat diberikan saat makan, serta risiko hipoglikemia pots-prandial menjadi lebih kecil.

1.2RUMUSAN MASALAH1.2.1Apa insulin lispro itu ?1.2.2Bagaimana kondisi kloning insulin lispro ?1.2.3Bagaimana formulasi sediaan insulin lispro ?

1.3TUJUAN1.3.1Mahasiswa dapat mengetahui insulin lispro.1.3.2Mahasiswa mengetahui kondisi dan cara kloning insulin lispro.1.3.3Mahasiswa mengetahui bentuk sediaan dan formulasi dari insulin lispro.

TINJAUAN PUSTAKA

Proinsulin adalah prekursor insulin dan C-peptida. Setelah sintesis, proinsulin dikemas menjadi butiran sekresi, diproses untuk C-peptida dan insulin oleh prohormone convertases (PC1/3 dan PC2) dan karboksipeptidase E. Hanya 1% hingga 3% dari proinsulin disekresi utuh. Namun, karena proinsulin memiliki umur paruh waktu lebih lama daripada insulin, beredar proinsulin konsentrasi berada di kisaran 5% untuk 30% konsentrasi insulin secara molar, yang beredar dengan proporsi relatif lebih tinggi terlihat setelah makan dan pada pasien dengan resistensi insulin atau awal diabetes tipe 2. Proinsulin dapat mengikat reseptor insulin dan pameran 5% sampai 10% dari aktivitas metabolisme insulin.Proinsulin tingkat mungkin meningkat pada pasien dengan memproduksi insulin tumor islet sel (insulinomas). Pasien ini menderita serangan hipoglikemik karena tidak pantas sekresi insulin oleh tumor. Diagnosis biokimia insulinoma terletak terutama pada menunjukkan tingkat insulin ditekan bebas hadapan hipoglikemia (glukosa darah < 45 mg/dL). Diagnosis dapat menjadi sulit, karena tumor mungkin kecil atau mengeluarkan insulin hanya episodik. Penggunaan obat-obatan hipoglikemik (misalnya, sulfonilurea) atau suntikan insulin juga dapat meniru insulinoma. Evaluasi diagnostik sering memerlukan cepat berkepanjangan (72 jam), serta tes tambahan (selain insulin dan glukosa pengukuran) termasuk sebuah layar sulfonilurea dan pengukuran C-peptida, proinsulin dan beta-hydroxybutyrate. Tidak pantas over sekresi insulin oleh insulinomas menyebabkan pelepasan peningkatan jumlah butiran sekresi dewasa dengan proinsulin ia diproses, mengakibatkan konsentrasi tinggi serum/plasma proinsulin. Ini relatif sekresi berlebihan proinsulin insulinomas cenderung paling ditandai dalam keadaan puasa, ketika proinsulin biasanya tidak memperhitungkan lebih dari 5% konsentrasi insulin secara molar.Proinsulin mencolok ditinggikan di PC1 3 kekurangan. Pasien ini memiliki cacat dalam pengolahan beberapa hormon peptida dan menderita diabetes, insufisiensi adrenal, infertilitas, dan obesitas. Individu yang terkena biasanya memiliki rambut merah terlepas dari latar belakang ras. Mutasi pada molekul proinsulin telah dilaporkan yang mempengaruhi efisiensi pembelahan PC atau metabolisme proinsulin berikutnya. Mutasi-mutasi ini juga dapat mengakibatkan tingkat proinsulin sangat tinggi, tetapi biasanya tidak disertai dengan diabetes, atau ada kelainan hormon lain. Individu normal akan memiliki proinsulin konsentrasi di bawah batas atas kisaran referensi puasa normal (20 pmol/L) ketika hipoglikemik (glukosa darah < 45-60 mg/dL). sebaliknya, sebagian (mengatakan 80%) insulinoma pasien akan memiliki proinsulin kepekatan di atas batas atas kisaran referensi. Sensitivitas dan spesifisitas untuk diagnosis insulinoma selama hipoglikemia adalah kira-kira 75% dan di dekat 100%, masing-masing, di 20 pmol/L cutoff. Sensitivitas tinggi (mengatakan 95%) dapat dicapai dengan menggunakan cutoff 5 pmol/L, dan ini adalah cutoff dianjurkan oleh tim berpengalaman hipoglikemia Mayo Clinic untuk menghindari kasus hilang. Namun, cutoff rendah hasil dalam kekhususan berkurang (sekitar 40%), yang menekankan perlunya kombinasi tes yang berbeda untuk memastikan diagnosis biokimia yang akurat.Pasien dengan defisiensi PC1 3 memiliki rendah, atau kadang-kadang tidak terdeteksi, tingkat insulin dan kadar proinsulin secara substansial meningkat, melebihi batas atas referensi berkisar substansial dalam kondisi puasa dan naik lebih tinggi setelah asupan makanan. Banyak kelainan hormon lain juga hadir, termasuk kortisol kekurangan (karena kurangnya pengolahan pro-opiomelanocortin adrenokortikotropik hormon dan peptida lainnya), infertilitas dan, seringkali, obesitas morbid.Untuk menghindari misdiagnoses, Semua pengukuran proinsulin yang digunakan dalam diagnostik pemeriksaan pasien dengan hipoglikemia harus ditafsirkan dalam konteks bersamaan penyakit, konsentrasi glukosa darah pada saat pengambilan sampel, dan hasil tes lainnya (yaitu, insulin, C-peptida, beta-hydroxybutyrate, dan sulfonilurea obat layar). Sebagai contoh, pasien dengan gagal ginjal kronis atau diabetes mellitus tipe 2 dapat memiliki peningkatan nilai-nilai proinsulin, C-peptida dan insulin, tetapi biasanya tanpa ditekan (< 45 g/dL) glukosa darahKarya terbaru pada proinsulin dan C-peptida telah diulas dengan penekanan utama pada temuan yang paling signifikan sejak 1972. Proinsulin kini telah ditetapkan sebagai pendahulu biosynthetic insulin pada semua spesies yang diteliti, termasuk manusia, dengan preproinsulin sebagai prekursor mungkin prohormone. Konversi proinsulin yang tampaknya terjadi secara eksklusif di pankreas menyebabkan equimolar produksi insulin dan C-peptida. Meskipun proinsulin memiliki efek biologis langsung yang sepersepuluh sebanyak sebagai insulin, C-peptida yang tidak ada kegiatan biologis pada jaringan homolog atau heterologous dan tidak ada kemampuan untuk memodifikasi aksi insulin dan/atau proinsulin. Sebelumnya bekerja pada proinsulin immunoassay menyarankan bahwa ini prohormone, tapi tidak C-peptida, cross-reacts dengan insulin antiserum. Di sisi lain, di immunoassay C-peptida, proinsulin, tetapi tidak insulin cross-reacts dengan antiserum. Sampai saat ini, oleh karena itu, itu belum mungkin untuk immunoassay manusia proinsulin atau C-peptida khusus. Karya baru dari laboratorium Heding, bagaimanapun, telah membawa tentang kemajuan besar di daerah ini di mana manusia C-peptida dan proinsulin dapat dipisahkan dalam plasma dengan menggunakan partikel Sepharose. Dengan kemajuan besar hari ini, sekarang mungkin untuk mengukur C-peptida manusia khusus. Pengukuran ini telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk menilai fungsi sel-beta dalam pasien diabetes diperlakukan dengan insulin dan insulinoma pasien yang endogen C-peptida sekresi tidak ditekan dengan eksogen insulin-induced hipoglikemia. Dengan menggunakan enzim tertentu yang mendegradasi insulin tetapi tidak proinsulin, nilai-nilai proinsulin postprandial plasma yang telah diukur di sejumlah mata pelajaran di bawah berbagai kondisi fisiologis dan patologis. Hasil ini, yang sebanding dengan yang diperoleh oleh Kromatografi kolom lebih melelahkan, dapat diringkas sebagai berikut: (1) proinsulin nilai-nilai di lean, subyek normal muda tidak bervariasi dalam menanggapi insulin secretagogues; (2) proinsulin sekresi dalam menanggapi glukosa hasil persentase yang lebih besar dari proinsulin pada kelompok usia remaja daripada kelompok muda; (3) dalam ramping dewasa dan remaja pasien diabetes, persentase proinsulin tidak berlebihan, sedangkan penderita diabetes obesitas dan diabetes hamil muncul untuk mengeluarkan proinsulin yang relatif lebih besar daripada mereka kontrol diabetes; dan (4) sedangkan kebanyakan negara hyperinsulinemic (Cusing's sindrom, dewasa-onset diabetes, acromegaly, dan terapi glukokortikoid) tidak dikaitkan dengan peningkatan persentase proinsulin, hyperinsulinemia insulinoma, dipilih dari hipoglikemia fungsional, dan genetik hyperproinsulinemia dikaitkan dengan persentase lebih besar dari proinsulin.Injeksi Insulin Lispro (rDNA origin) atau Humalog insulin Lispro rekombinan. Sebuah mutan atau modifikasi insulin manusia dengan sekuens sedikit berbeda pada asam amino, ekspresi dengan transformasi bakteria Escherichia colo (E.coli), dan purifikasi sebagai kristal kompleks insulin lispro dengan seng (seng-insulin lispro). Insulin lispro atau Lys (B28), Pro (B29) insulin manusia adalah insulin manusia dengan lisin dan protein asam amino pada posisi 29 dan 28.

BAB IIPEMBAHASAN

2.1PENGERTIAN INSULINInsulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-sel kelenjar Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi kadar gula darah (kadar gula darah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus tergantung insulin (diabetes tipe 1).Dosis insulin disesuaikan untuk setiap individu,. Ada 3 macam sediaan insulin:1. Insulin kerja singkat (short-acting): mula kerja relatif cepat, yaitu insulinsoluble, insulin lispro dan insulin aspart;2. Insulin kerja sedang (intermediate- acting): misalnya insulin isophane dan suspensi insulin seng,3. Iinsulin kerja panjang dengan mula kerja lebih lambat: misalnya suspensi insulin seng.Pada insulin jangka pendek ini dikenal secara generic sebagai insulin reguler atau insulin lispro atau insulin aspart. Namun dalam merek dagangnya bisa beragam, seperti Humulin R, Sansulin R, Insuman Rapis, Actrapid, Humalog, Novorapid, ApidraPada insulin jangka menengah memang lebih panjang dari yang jangka pendek, dimana onsetnya bisa 4 sampai 12 jam. Maka disini pemberiannya bisa dua kali dalam sehari. Namun untuk menekan lonjakan gula darah pada makanan yang berindek glikemik tinggi kurang efektif..Insulin jangka menengah ini memiliki nama generic Isophan Insulin (NPH), insulin Zinc Suspensi. Dengan merek dagang seperti Humulin N, Sansulin N, Insulatard, Insuman Basal, Insuman combination. Sebenarnya pada insulin jangka menengah merupakan insulin jangka pendek yang diolah menjadi lebih suspensinya, sehingga lebih lambat penyerapannya di jaringan saat disuntikan.Sedang untuk insulin jangka panjang dikenal dengan Extended insulin Zinc, Suspension, insulin glargin. Dengan merek dagang Levenir, Protamin Zinc Insulin, Lantus, namun yang paling terkenal adalah insulin glargin karena sangat efektif dalam menata suplai insulin selama 24 jam. Pemberian pada insulin jangka panjang ini memang lebih fleksibel, namun biasanya lebih baik diberikan sebelum tidur, sehingga keesokan harinya sudah bisa mensuplai insulin sampai malam. Memang onsetnya antara 6 sampai 24 jam, sangat baik bagi yang sudah bisa mengatur diet dan terkontrol gula darahnya, serta suntikannya Cuma sekali dalam 24 jam.

2.2INSULIN LISPROLiprolog (lispro insulin) adalah protein analog insulin manusia diperoleh dari teknologi DNA rekombinan yang memiliki posisi kebalikan dari asam amino manusia yaitu pada posisi 28 dirubah menjadi lisin dan 29 dirubah menjadi prolin.Protein rekombinan ini disintesis dan dimodifikasi secara genetik dan kemudian diubah dan dimurnikan dalam serangkaian langkah-langkah untuk menghasilkan kristal lispro dan dibuat sebuah obat. Memliki rumus molekul C257H383N65O77S6dan berat rata-rata 5.808 kDaBerikut ini merupakan urutan asam amino insulin yang tersusun dari 51 asam amino yang terdiri dari 2 peptida yang terhubung melalui jembatan sulfide. dari 2 rantai peptide yaitu rantai A dan rantai B yang dihubungkan melalui jembatan disulfida S-S. Dikatakan sebagai insulin lispro apabila pada asam amino 28 dan 29 masing-masing diganti menjadi Lys dan pro. Jembatan disulfida berada diantara residu cystein (residu ke 7) pada rantai A dengan residu ke 7 dari rantai B dan residu ke-20 dari rantai A dengan residu ke-19 pada rantai B. Ikatan disulfida intrachain menghubungkan cystein residu ke-6 dengan residu ke-11 pada rantai A. Dikatakan sebagai insulin lispro apabila pada asam amino 28 dan 29 masing-masing diganti menjadi Lys dan pro.

Seperti jenis insulin lainnya, aktivitas utama insulin lispro adalah untuk mengkontrol metabolisme glukosa. Insulin lispro bekerja pada otot dan jaringan lain (kecuali otak) untuk meningkatkan transport glukosa dan asam amino intrasel, meningkatkan anabolisme dan menghambat katabolisme protein. Insulin lispro juga meningkatkan konversi glukosa menjadi glikogen atau lemak dan menghambat glukogenolisis di hati. Insulin lispro mulai berefek setelah 15 menit pemberian. Jika dibandingkan dengan insulin reguler, lispro memiliki onset yang lebih cepat. Insulin lispro digunakaan 30-45 menit sebelum makan dikarenakan agar insulin lispro mencapai puncak aktivitas pada saat terjadinya puncak absorbsi makanan. Lamanya aktivitas insulin lispro adalah kurang dari lima jam sedangkan insulin biasa mencapai 6 samapi 10 jam. Dengan pemberian di abdomen, puncak konsentrasi insulin lispro lebih tinggi namun waktu berefeknya lebih cepat daripada diberikan di lengan atau paha. Penggunaan insulin lispro secara konsisten diabsorbsi lebih cepat dibandingkan dengan insulin reguler terlepas dari lokasi pemberian. Seperti insulin yang lainnya, perbedaan absorbsi tergantung pada pasien masing-masing.2.3KLONING INSULINInsulin merupakan sejenis hormon jenis polipeptida yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas. Sel yang menghasilkan hormon insulin dalam kelenjar pankreas dikenali sebagai sel beta, yaitu sejenis sel yang terdapat dalam kelompokan sel yang digelar pepulau (islet of) Langerhans dalam pancreas.Secara kimia, insulin merupakan suatu protein yang kecil dan sederhana. Insulin terdiri dari 51 asam amino, 30 diantaranya menyusun 1 rantai polipeptida dan 21 asam amino menyusun rantai kedua. Kedua rantai tersebut dihubungkan dengan ikatan disulfida seperti gambar dibawah. Kode genetik dari insulin ditemukan dalam DNA pada bagian atas short arm dari kromosom ke-11. Kromosom ini mengandung 153 basa nitrogen (63 pada rantai A dan 90 pada rantai B).

Gambar 1. Ikatan disulfida pada rantai insulinHormon insulin diproduksi oleh kalenjar pankreas. Dalam kelenjar pankreasmengandung kurang lebih 100.000 pulau Langerhans dan setiap pulau mengandung 100 sel beta. Oleh sel beta-lahhormon insulin diproduksi, dimana sel beta dapat diibaratkan sebagai anak kunci yang dapat membuka pintu masuknya glukosa ke dalam sel. Kemudian di dalam sel, glukosa tersebut dimetabolisasikan menjadi tenaga energi. Jika hormon insulin tidak ada, maka glukosa tidak dapat masuk ke sel dengan akibat glukosa akan tetap berada di dalam pembuluh darah yang artinya kadar glukosa di dalam darah meningkat.Insulin dikode oleh lengan pendek kromosom 117 dan disintesa oleh sel dari islet pancreas Langerhans sebagai proinsulin. Proinsulin disintesa di ribosom-Retikulum Endoplasma kasar dari mRNA sebagai pre-proinsulin. Pre-proinsulin dibentuk melalui sintesa signal peptide. Pelepasan signa peptida akan membentuk proinsulin di Retikulum Endoplasma. Vesikel sekretori akan mengirim proinsulin dari reticulum endoplasma ke badan golgi. Di badan golgi, proinsulin akan diberikan tambahan zink dan kalsium yang akan menyebabkan bentukan heksamer proinsulin yang tidak larut air. Enzim di luar badan golgi akan merubah proinsulin menjadi insulin dan C-peptide.Meskipun insulin babi dan sapi serupa dengan insulin manusia, komposisinya sedikit berbeda. Sebagai akibatnya, sistem imun dari sejumlah pasien memproduksi antibodi untuk melawan insulin, menetralkan aksinya dan menghasilkan reaksi inflamasi pada daerah suntikan. Selain efek samping di atas, timbul juga ketakutan adanya komplikasi jangka panjang yang terjadi akibat injeksi terus-menerus suatu bahan asing. Selain itu juga diproyeksikan akan terjadi penurunan produksi dari insulin yang dihasilkan oleh hewan.Faktor ini mendorong peneliti untuk mencoba mensintesa Human insulin dengan cara menyisipkan gen insulin pada vektor yang sesuai, yaitu sel bakteri E. coli untuk menghasilkan insulin yang secara kimia identik dengan insulin yang terbentuk secara alami. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan. Metode ini lebih dapat diandalkan daripada metode pembuatan insulin yang diperoleh dengan cara ekstraksi dan pemurnian insulin dari hewan. Selain menggunakan bakteri sebagai host, dapat juga digunakan host berupa ragi (yeast).

Kebanyakan protein dalam sitoplasma E. coli, namun, tidak semua protein yang terbentuk larut dalam sitoplasma. Salah dilipat protein terbentuk dalam sitoplasma dapat membentuk badan inklusi yang akan memerlukan pelipatan kembali. Promotor digunakan untuk vektor ini biasanya didasarkan pada promotor lac operon atau promotor T7, dan mereka biasanya diatur oleh operator lac. Promotor ini juga memungkin hibrida dari promotor yang berbeda, misalnya, promotor tac adalah hibrida dari trp dan lac promotor. Catatan yang paling umum digunakan lac atau promotor lac yang diturunkan didasarkan pada mutan lacUV5 yang sensitif terhadap katabolit represi. Mutan ini memungkinkan untuk ekspresi protein di bawah kendali promotor lac ketika media pertumbuhan mengandung glukosa karena glukosa akan menghambat ekspresi protein jika promotor tipe liar lac digunakan. glukosa digunakan untuk mengurangi ekspresi latar belakang melalui penghambatan sisa dalam beberapa sistem. Contoh E. coli vektor ekspresi adalah seri pGEX vektor di mana glutathione-S-transferase digunakan sebagai mitra fusi dan ekspresi protein di bawah kontrol promotor tac, dan seri pET vektor yang menggunakan promotor T7.

2.4MEKANISME INSULIN LISPROInsulin lispro adalah bentuk hormon insulin tipe fast-acting. Insulin ini bekerja dengan cara mengurangi kadar gula dalam darah. Insulin lispro digunakan untuk mengobati diabetes tipe 1 (insulin-dependent) pada orang dewasa. Insulin lispro biasanya diberikan bersamaan dengan long-acting insulin lainnya. Insulin lispro juga digunakan bersamaan dengan pengobatan oral (melalui mulut) untuk mengobati diabetes tipe 2 (non insulin-dependent) pada orang dewasa. Pemberian injeksi insulin secara teratur dalam meningkatkan kadar insulin dalam darah penderita dapat meminimumkan komplikasi. Pengobatan ini hanya mungkin dilaksanakan bila insulin tersedia dalam jumlah besar dengan kemurnian dan mutu yang baik. Pemberian insulin kepada penderita diabetes hanya bisa dilakukan dengan cara suntikan, jika diberikan melalui oral insulin akan rusak didalam lambung. Setelah disuntikan, insulin akan diserap kedalam aliran darah dan dibawa ke seluruh tubuh. Disini insulin akan bekerja menormalkan kadar gula darah (blood glucose) dan merubah glucose menjadi energi. Perlu diperhatikan daerah mana saja yang dapat dijadikan tempat menyuntikkan insulin. Bila kadar glukosa darah tinggi, sebaiknya disuntikkan di daerah perut dimana penyerapan akan lebih cepat. Namun bila kondisi kadar glukosa pada darah rendah, hindarilah penyuntikkan padadaerah perut. Secara urutan, area proses penyerapan paling cepat adalah dari perut, lengan atas dan paha. Insulin akan lebih cepat diserap apabila daerah suntikkan digerak-gerakkan. Penyuntikkan insulin pada satu daerah yang sama dapat mengurangi variasi penyerapan. Penyuntikkan insulin selalu di daerah yang sama dapat merangsang terjadinya perlemakan dan menyebabkan gangguan penyerapan insulin. Daerah suntikkan sebaiknya berjarak 1inchi (+ 2,5cm)dari daerah sebelumnya. Lakukanlah rotasi di dalam satu daerah selama satu minggu, lalu baru pindah ke daerah yang lain.

2.5PURIFIKASISecara umum purifikasi insulin dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu:1. Gel filtration chromatographic system (menggunakan kolom sephadex G-50)2. Ion exchange step3. Reverse Phase-HPLCPertama-tama, sel diambil dari fermentor lalu dihancurkan untuk mendapatkan proinsulin dalam bentuk kasar (crude proinsulin). Selanjutnya dilakukan purifikasi tahap 1 dengan kristalisasi menghasilkan proinsulin yang telah terpurifikasi sebagian. Lalu dengan proses enzimatik mengggunakan protrolisis dihasilkan crude insulin. Kemudian dimurnikan dengan ion exchange dan gel filtration. Terakhir menggunakan RP-HPLC maka akan didapatkan insulin dengan tingkat kemurnian yang tinggi.Pada proses pemisahan insulin: pH dibuat < 5,3 (di bawah pH insulin) supaya insulin tetap berada dalam larutan dengan eluen gradien menggunakan asetonitril dengan starting material yang kemurniannya hampir 92% maka akan didapatkankemurnian hingga 99%.Gel filtration chromatography dapat memisahkan fraksi dengan BM tinggi seperti proinsulin, insulin bentuk dimer, dan terutama enzim proteolitik dari produk insulin. Beberapa polipeptida pankreas yang memiliki BM mirip insulin juga dapat dipisahkan

2.6FORMULASI DAN BENTUK SEDIAANSecara garis besar formulasi dari insulin dalam bentuk injeksi subkutan, infus subkutan, atau injeksi intravena, atau infus intravena. adalah sebagai berikut :Bentuk monomer insulin merupakan bentuk yang paling aktif tapi tidak stabil dalam penyimpanan. Oleh karena itu dilakukan modifkasi supaya produk sediaan insulin tetap stabil dalam penyimpanan sebelum digunakan.Insulin dapat membentuk dimer karena ada beberapa asam amino yang bertanggung jawab dalam pembentukan tersebut. Dimer dapat membentuk polimer tak beraturan yang dapat memicu terjadinya agregasi. Untuk itu dalam penyimpanan ditambah Zn2+ yang akan menyebabkan keteraturan bentuk molekul insulin menjadi heksamer (Hexamer T6) yang stabil. Selanjutnya ditambahkan eksipien fenolik seperti fenol dan m-kresol yang dapat berfungi sebagai preservatif dan stabilizer. Dengan penamabahan fenol tersebut maaka bentuk heksamer T6 akan menjadi bentuk heksamer R6 yang lebih stabil. Perlu diingat bahwa fenol bersifat karrsinogenik yang poten karena dapat mengakibatkan perubahan basa AT > GC atau GC menjadi AT. Namun karena kadar fenol yang digunakan kecil maka dapat diabaikan. Untuk meminimalkan kerusakan jaringn dan rasa sakit saat injeksi karena penambahan Zn2+ atau preservatif, maka dalam sediaan insulin sering ditambahkan agen isotonik (seperti gliserol dan NaCl) serta buffer fisiologis (seperti sodium pospat). Insulin heksamer R6 walaupun stabil tapi tidak berefek sebagai insulin karena tidak bisa menembus memberan biologi Oleh sebab itu dalam tubuh, insulin heksamer R6 akan dipecah menjadi bentuk aktif insulin yaitu bentuk monomer-monomer Insulin heksamer akan berkesetimbangan dengan bentuk heksamer T6 yang kurang stabil, dimer, dan monomer. Tapi ternyata walaupun diberikan insulin heksamaer R dosis besar, efek yang ditimbulkan relatif kecil. Ini terjadi karena tidak semua bentuk heksamer lancar terpecah menjadi bentuk monomer sehingga hanya sedikit monomer yang dihasilkan. Bentuk dimer dan monomer dari insulin akan mempu menembus membran biologi dan menimbulkan efek walaupun konsentrasinya kecil (10-8 M).Sedangkan pada lispro sendiri formulasinya ada 2 adalah sebagai berikut :A. Humalog RHumalog R (regular) terdiri dari seng kristal insulin yang dilarutkan dalam cairan bening. Humulin R tidak dimodifikasi atau adanya penambahan eksipien untuk mengubah kecepatan atau panjang aksi insulin. Sehingga insulin bekerja dengan cepat. formulasi insulin yang dapat memberikan aksinya dengan cepat yaitu insulin LISPRO (LysB28ProB29 hormon insulin). Insulin ini akan terpecah langsung dari heksamer menjadi monomer sehingga monomernya bisa didapat dalam konsentrasi yang lebih besar (10-3 M) sehingga cepat berefek. Humalog R memiliki onset 15 menit dan durasi antara 2-5 jam. Durasi Humalog R lebih cepat daripada insulin normal. B. Humalog Mix 75/25Humalog Mix 75/25 memiliki onset cepat. Humalog Mix 75/25 terdiri dari 75 % Humalog R dan 25 % Humalog NPL atau suspensi insulin lispro protamine. Insulin lispro NPL adalah suspensi bentuk Kristal kombinasi dari insulin lispro dan protamine sulfat dibawah kondisi optimal. Humalog mix 75/25 mengandung 100 unit insulin lispro, 0,28 mg protamine sulfat, 16 mg gliserin, 3,78 mg Na2PO4 , 1,76 mg m-cresol, ZnO mengandung 0,025 mg ion Zn, 0,715 mg fenol, dan air untuk injeksi. Dan ditambahkan 10 % HCl dan NaoH 10% sampai pH 7 7,8. Humolog 25/75 ini dibuat sebagai injeksi subkutan disimpan dalam 2 80C dengan self life 2 tahun.

BAB IIIKESIMPULAN

Dari makalah di atas dapat disimpulkan bahwa : Liprolog (lispro insulin) adalah protein analog insulin manusia diperoleh dari teknologi DNA rekombinan yang memiliki posisi kebalikan dari asam amino manusia yaitu pada posisi 28 dirubah menjadi lisin dan 29 dirubah menjadi prolin. Insulin lispro mulai berefek setelah 15 menit pemberian. Jika dibandingkan dengan insulin reguler, lispro memiliki onset yang lebih cepat purifikasi insulin dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu:Gel filtration chromatographic system (menggunakan kolom sephadex G-50)Ion exchange stepReverse Phase-HPLC bentuk sediaan dari insulin lispro berupa injeksi subkutan, injeksi intavena, infus subkutan dan infus intravena. Produk dari insulin adalah Humalog R dan Humalog Mix 75/25

DAFTAR PUSTAKA

Bennet.P.H. 1994.Definision, Diagnosis, and Clasification of Diabetes Mellitus AndImpaired Glucose Tolerence.Tokyo: A Waverly Company Budiyanto, A.K. 2010.Hand Out-7 Genetika Mikroorganisme.UMM Malang Homko C, Deluzio A, et.al. 2003. Comparison of Insulin Aspart and Lisprom.DiabetesCare 26 Molecular Mecanisms of Insulin Resistance in Type 2 Diabetes Melitus.2010.worldJournal of Diabetes