Metode Klasik dan Molekuler Untuk Evaluasi Chlamydia trachomatis Infeksi pada Wanita dengan Faktor Infertilitas Tuba

Abstrak

Latar Belakang: Chlamydia trachomatis adalah penyakit bakteri seksual menular, terutama di kalangan wanita muda di seluruh dunia. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan prevalensi infeksi Chlamydia trachomatis pada wanita infertilitas tuba dengan cara PCR dan teknik kultur sel.

Metode: Lima puluh satu wanita dengan konfirmasi TFI diikutsertakan dalam penelitian ini (Klinik infertilitas Avicenna) antara Januari 2010 dan Januari 2011. Cervical Swab dan Cytobrush spesimen dikumpulkan dari setiap pasien oleh dokter ahli kandungan dan dikirim ke laboratorium dalam media transportasi. Deteksi Chlamydia trachomatis dalam sampel dilakukan dengan menggunakan PCR dan kultur bakteri pada MacCoy cell line. Data dianalisis dengan uji Fisher dan t-test independent. Signifikans bila nilai p <0,05.

Hasil: Sebuah hubungan yang signifikan ditemukan antara peningkatan usia hubungan seksual pertama dan infeksi klamidia. Enam (11,7%) sampel memiliki hasil PCR positif, sedangkan hasil kultur sel yang positif hanya 2 (3,9%) sampel. Sebuah hubungan yang signifikan juga diidentifikasi antara durasi infertilitas dan infeksi (p <0,05) PCR dibandingkan dengan metode kultur sel.

Kesimpulan: Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa PCR adalah metode cepat, dibandingkan dengan kultur sel untuk mendeteksi organisme klamidia. Menjadi jelas pula bahwa usia saat berhubungan seksual pertama penting untuk memprediksi kemungkinan Chlamydia trachomatis.

Kata kunci: kultur sel, Chlamydia trachomatis, Cytobrush, PCR, Swab.

Pengantar

Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) adalah patogen manusia intraseluler obligat yang bertanggung jawab untuk bakteri penyakit menular seksual yang paling banyak dilaporkan di seluruh dunia. Infeksi klamidia genital telah diidentifikasi sebagai kesehatan masyarakat yang utama dan ada kejadian tahunan diperkirakan sekitar 92 juta kasus infeksi klamidia di dunia (1). Meskipun, infeksi dengan organisme ini dapat asimtomatik pada hingga 80% dari wanita (2), hal itu dapat menimbulkan sindrom uretra, salpingitis, penyakit radang panggul (PID), infertilitas faktor tuba dan nyeri panggul kronis (3).

Infeksi pada saluran reproduksi wanita dengan C. trachomatis adalah salah satu penyebab global yang terkemuka infertilitas faktor tuba (4), dan penyebab utama infertilitas perempuan.

Dalam rangka untuk mengurangi tingkat PID dan mencegah perkembangan gejala sisa reproduksi, diagnosis dini dan pengobatan infeksi klamidia dapat menjadi sangat penting (5). Karena prevalensi penyakit klamidia terus meningkat, pengembangan metode yang sensitif, spesifik, dan cepat untuk mendiagnosa infeksi ini sangat disukai.

Kultur sel, tes sitologi untuk mendeteksi badan inklusi sitoplasma, imunofluoresensi langsung (DFA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), teknik hibridisasi DNA dan reaksi berantai polimerase (PCR) beberapa metode laboratorium yang digunakan untuk diagnosis C . trachomatis (6).

Studi menunjukkan bahwa PCR memiliki sensitivitas 97% sampai 100% dan spesifisitas 98% untuk mendeteksi C. trachomatis. Sensitivitas dan spesifisitas kultur sel adalah, 85% dan 100% masing-masing (7, 8). Oleh karena itu, kultur sel adalah standar emas untuk diagnosis C. trachomatis.

Dalam studi ini, kami menggunakan metode amplifikasi asam nukleat (PCR) untuk mendeteksi dan mengevaluasi prevalensi infeksi trachomatis C. pada wanita dengan infertilitas tuba menggunakan Cytobrush dan sampel swab serviks.

Metode

Pasien dan sampel: Kami merekrut 51 wanita dengan infertilitas faktor tuba, dikonfirmasi dengan laparoskopi dan hysterosalpingography, menghadiri klinik Avicenna Infertilitas di Teheran, Iran antara Januari 2010 dan Januari 2011. Pasien berusia 19-48 tahun (rata-rata 33,3 ± SD tahun) dan usia mereka saat hubungan seksual pertama adalah 23,5 ± 7.2 mulai dari (10-43 tahun).

Cytobrush dan sampel swab serviks diperoleh dari masing-masing peserta oleh ginekolog. Swab dan Cytobrush sampel ditempatkan di PBS dan 2SP (sukrosa-fosfat) Media transportasi, masing-masing, dan dikirim ke laboratorium di bawah cocok pelindung (4 ° C) kondisi. Data demografi dan sejarah medis dikumpulkan melalui wawancara langsung dengan pasien.

Ekstraksi DNA dan PCR: DNA diekstraksi dari penyeka serviks menggunakan kit ekstraksi DNA (QIAGEN, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. Semua DNA diekstraksi disimpan pada suhu -20 ° C sampai analisis dengan PCR. Primer untuk amplifikasi gen orf8 adalah:

Teruskan 5'-CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3 'dan reverse 5' TCCTCAGGAGTTTATGCACT-3 '. Setelah mengatur, PCR dilakukan. Program amplifikasi terdiri dari siklus pertama dari 5 menit denaturasi pada 94 ° C, diikuti oleh 37 siklus, masing-masing berlangsung 40 s pada 94 ° C, 45 s pada 61,6 ° C, dan 89 s, pada 72 ° C, dengan ekstensi akhir selama 5 menit pada 72 ° C.

Volume masing-masing tabung PCR adalah 50 ml mengandung 5 ml DNA, 25 mmol MgCl2, 25 mmol dN TP, 1 mmol maju dan reverse primer dan 1,5 Unit Taq polimerase. Produk PCR diperkuat (5 ml) dianalisis dengan elektroforesis pada 1,5% b / v gel agarosa yang mengandung 0,5 mg / ml ethidium bromida.

Kultur on line sel McCoy: sampel Cytobrush digunakan untuk isolasi C. trachomatis di cycloheximide diperlakukan monolayer McCoy sel, yang tumbuh di sampul tergelincir budaya di piring 12-baik menggunakan RPMI suplemen dengan 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine dan antibiotik. Pelat diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 2-3 hari sampai pertumbuhan yang memadai bakteri muncul.

Setelah vortexing kuat, 200 ml dari setiap spesimen Cytobrush diinokulasi pada sel. Lempeng disentrifugasi selama 1 jam (1500 g, 30 ° C) dan setelah penggantian media, mereka diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 48-72 jam dengan monolyers difiksasi dalam metanol dan inklusi mayat terdeteksi oleh pewarnaan Giemsa.

Analisis data: Data dianalisis dengan SPSS versi 16 software. Chi square (χ2), uji eksak Fisher, dan t-test independent, yang digunakan untuk analisis signifikansi. Sebuah p-value lebih kecil dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Lima puluh satu wanita infertil yang telah gagal untuk memiliki anak setelah satu tahun hubungan seksual tanpa kontrasepsi yang terdaftar dalam penelitian ini. Sebagian besar peserta berasal dari kelompok usia 30-35 tahun. Tentang 67,4% dari aptients memiliki riwayat infeksi vagina, 86,0% memiliki infertilitas primer, dan 64,7% yang subur selama lebih dari lima tahun.

Kami diperkuat fragmen dengan panjang 200 bp selama PCR dan divisualisasikan pada 1,5% gel agarosa (Gambar 1). Kultur sel dilakukan pada lini sel Mac Coy (Gambar 2).

Menurut hasil yang disajikan dalam tabel 1, dari 51 sampel, 6 (11,7%) yang positif dengan PCR dan 2 (3,9%) dengan kultur sel (Tabel 1).

Usia rata-rata saat hubungan seksual pertama adalah 30,67 ± 9,89 dan 22,72 ± 6,45 di PCR positif dan negatif, masing-masing, (p <0,05). Selain itu, hubungan yang signifikan terlihat antara usia saat hubungan seksual pertama dan risiko infeksi (p <0,05). Tentang 18,8% pasien dengan durasi infertilitas kurang dari 5 tahun dibandingkan 9,1% dari mereka dengan durasi infertilitas lebih dari 5 tahun memiliki hasil PCR positif (p <0,05), sedangkan hubungan tersebut tidak diamati untuk kultur sel.

T-test menunjukkan tidak ada hubungan yang signifikan antara usia pasien dan infeksi trachomatis C, tapi kemungkinan infeksi meningkat secara signifikan dengan peningkatan usia perkawinan (p <0,05).

Durasi infertilitas memiliki korelasi tertentu dengan hasil PCR tapi itu tidak signifikan (p = 0,056) dan tidak menunjukkan hubungan dengan hasil yang diperoleh dari kultur sel.

Chi-squarea dan uji Fisher digunakan untuk mengevaluasi hubungan antara gejala infeksi genital dengan PCR dan hasil budaya. Tak satu pun dari gejala seperti keputihan, disuria, gatal genital atau panggul menunjukkan hubungan yang signifikan dengan infeksi (Tabel 2).

Infeksi klamidia genital, disebabkan oleh bakteri C. trachomatis menular seksual, saat ini seksual yang paling umum infeksi menular di seluruh dunia (1). Infeksi ini telah dikaitkan dengan spektrum yang luas dari komplikasi.

C. trachomatis adalah salah satu mikroorganisme yang paling umum mengganggu kesuburan wanita dan dianggap sebagai penyebab paling penting dari obstruksi tuba dan PID (9).

Oleh karena itu, skrining dan pengobatan infeksi klamidia untuk mengurangi penularan dan mencegah PID dan gejala sisa jangka panjang termasuk infertilitas, nyeri kronis, PID dan kehamilan ektopik adalah nilai yang besar.

Sekitar 10% sampai 20% dari infertilitas wanita dikaitkan dengan infertilitas faktor tuba. Meskipun infeksi trachomatis C. akan efektif jelas pada sebagian besar wanita, namun infeksi berlanjut di beberapa dan mungkin naik ke saluran kelamin bagian atas dan meningkatkan risiko tuba faktor subfertility (10). Dalam studi saat ini, kami mengevaluasi wanita dengan infertilitas faktor tuba untuk infeksi C. trachomatis dengan PCR dan kultur sel.

Berdasarkan beberapa investigasi, prevalensi infeksi trachomatis C. bervariasi dengan populasi yang diteliti dan jenis dan sensitivitas metode deteksi yang digunakan. Sebagai contoh, prevalensi DNA klamidia pada spesimen jaringan segar dari 14 wanita dengan infertilitas faktor tuba diselidiki di Inggris. C. trachomatis DNA terdeteksi pada 43% pasien (11). Prevalensi adalah 12% dalam penelitian kami, yang sebanding dengan hasil penelitian lain yang dilakukan di Iran, menunjukkan insiden lebih rendah dari infeksi ini dalam masyarakat kita.

Penilaian infeksi trachomatis C. pada wanita Iran dengan Servisitis dilakukan sebelumnya oleh antibodi fluorescent langsung (DFA) dan teknik PCR. Tentang 15,5% dari 142 sampel yang positif untuk Chlamydia berdasarkan hasil PCR, sedangkan hasil DFA menunjukkan positif 14,1% (12). Data ini sebanding dengan hasil PCR dari penelitian ini, meskipun nilai-nilai sudah tinggi untuk kultur sel. Hal ini menunjukkan bahwa PCR dan metode DFA lebih sensitif dibandingkan kultur sel.

Dari 110 perempuan India dengan infertilitas primer dan sekunder, C. trachomatis terdeteksi pada 25 (22,72%) kasus dengan metode kultur sel (13), sementara kami mendeteksi organisme cara ini hanya 4% dari kasus. Perbedaan ini bisa disebabkan oleh ukuran sampel yang berbeda dan populasi dan teknik kultur sel mungkin lebih baik digunakan dalam studi mereka.

Swab endoserviks dari 109 wanita yang mengunjungi klinik infertilitas dan ginekologi di Gaza dianalisis dengan menggunakan PCR dan teknik enzim immunoassay. Hasil penelitian menunjukkan bahwa angka prevalensi keseluruhan C. trachomatis menjadi 20,2% (14).

Dalam studi lain, tingkat infeksi trachomatis C. dievaluasi oleh PCR adalah 27,2% dan 18,9% pada wanita tanpa gejala dan gejala, masing-masing (15).

Kesimpulan

Dalam penelitian ini kami menggunakan PCR dan teknik kultur sel untuk mendeteksi C. trachomatis di penyeka serviks dan spesimen Cytobrush. Berdasarkan hasil PCR, prevalensi C. trachomatis dalam populasi penelitian adalah 12%, sedangkan kultur sel terdeteksi organisme hanya 4% dari kasus.

Dalam perjanjian dengan beberapa penelitian lain, hasil kami menunjukkan bahwa PCR lebih sensitif dibandingkan kultur sel dalam mendeteksi infeksi klamidia.

Meskipun budaya itu sebelumnya dianggap sebagai standar emas, sensitivitas adalah serendah 75% sampai 85% bahkan di laboratorium ahli dan dibutuhkan 3 sampai 6 hari untuk menyelesaikan (16). Tetapi metode amplifikasi asam nukleat, seperti PCR, memiliki sensitivitas tinggi dan spesifisitas dan hasilnya dapat diperoleh dalam waktu singkat. Selanjutnya dalam metode ini spesimen akan stabil selama transportasi dan dapat dikenakan penundaan antara pengumpulan dan pengolahan tanpa kehilangan sensitivitas (17).

Karena infeksi klamidia tidak terdeteksi dan tidak diobati dapat menyebabkan banyak gejala sisa reproduksi, seperti infertilitas, hasil penelitian ini menunjukkan

bahwa semua wanita infertil harus dirujuk ke klinik infertilitas dan diputar untuk C. trachomatis di komunitas kami.

Benturan Kepentingan

Tidak ada konflik kepentingan bagi penulis.

Daftar Pustaka1. Beagley KW, Timms P. Chlamydia trachomatis infection: incidence, health

costs and prospects for vaccine development. J Reprod Immunol. 2000;48 (1):47-68.

2. Patel AL, Sachdev D, Nagpal P, Chaudhry U, Sonkar SC, Mendiratta SL, et al. Prevalence of Chlamydia infection among women visiting a gynaecology outpatient department: evaluation of an inhouse PCR assay for detection of Chlamydia trachomatis. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2010; 9:24.

3. Morré SA, Rozendaal L, van Valkengoed IG, Boeke AJ, van Voorst Vader PC, Schirm J, et al. Urogenital Chlamydia trachomatis serovars in men and women with a symptomatic or asymptomatic infection: an association with clinical manifestations? J Clin Microbiol. 2000;38(6): 2292-6.

4. Cetin MT, Vardar MA, Aridogan N, Köksal F, Kiliç B, Burgut R. Role of Chlamydia trachomatis infections in infertility due to tubal factor. Indian J Med Res. 1992;95:139-43.

5. Murawski M, Matusiak M, Gryboś M. [Chlamydia trachomatis as an etiological factor of marital infertility-- is a routine diagnostics worth to perform?]. Wiad Lek. 2007;60(9-10):445-8. Polish.

6. Watson EJ, Templeton A, Russell I, Paavonen J, Mardh PA, Stary A, et al. The accuracy and efficacy of screening tests for Chlamydia trachomatis: a systematic review. J Med Microbiol. 2002;51(12): 1021-31.

7. Olafsson JH, Davídsson S, Karlsson SM, Pálsdóttir R, Steingrímsson O. Diagnosis of Chlamydia trachomatis infection in high-risk females with PCR on first void urine. Acta Derm Venereol. 1996;76 (3):226-7.

8. Wilcox MH, Reynolds MT, Hoy CM, Brayson J. Combined cervical swab and urine specimens for PCR diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infection. Sex Transm Infect. 2000;76(3):177-8.

9. Wilkowska-Trojniel M, Zdrodowska-Stefanow B, Ostaszewska-Puchalska I, Zbucka M, Wołczyński S, Grygoruk C, et al. Chlamydia trachomatis urogenital infection in women with infertility. Adv Med Sci. 2009;54(1):82-5.

10. den Hartog JE, Morré SA, Land JA. Chlamydia trachomatis-associated tubal factor subfertility: Immunogenetic aspects and serological screening. Hum Reprod Update. 2006;12(6):719-30.

11. Barlow RE, Cooke ID, Odukoya O, Heatley MK, Jenkins J, Narayansingh G, et al. The prevalence of Chlamydia trachomatis in fresh tissue specimens from patients with ectopic pregnancy or tubal fac tor infertility as determined by PCR and in-situ hybridization. J Med Microbiol. 2001;50(10):902-8.

12. Zaeimi Yazdi J, Khorramizadeh MR, Badami N, Kazemi B, Aminharati F, Eftekhar Z, et al. Comparative assessment of Chlamydia trachomatis infection in Iranian women with cervicitis: A crosssectional study. Iran J Public Health. 2006;35(2): 69-75.

13. Malik A, Jain S, Hakim S, Shukla I, Rizvi M. Chlamydia trachomatis infection & female infertility. Indian J Med Res. 2006;123(6):770-5.

14. El Qouqa IA, Shubair ME, Al Jarousha AM, Sharif FA. Prevalence of Chlamydia trachomatis among women attending gynecology and infertility clinics in Gaza, Palestine. Int J Infect Dis. 2009;13(3):334- 41.

15. Jenab Anahita, Golbang N, Golbang P, Chamani- Tabriz L, Roghanian R. Diagnostic Value of PCR and ELISA for Chlamydia trachomatis in a Group of Asymptomatic and Symptomatic Women in Isfahan, Iran. Inter J Fertil Steril. 2009;2(4):193-8.

16. Jaschek G, Gaydos CA, Welsh LE, Quinn TC. Direct detection of Chlamydia trachomatis in urine specimens from symptomatic and asymptomatic men by using a rapid polymerase chain reaction assay. J Clin Microbiol. 1993;31(5):1209-12.

17. Puolakkainen M, Hiltunen-Back E, Reunala T, Suhonen S, Lähteenmäki P, Lehtinen M, et al. Comparison of performances of two commercially available tests, a PCR assay and a ligase chain reaction test, in detection of urogenital Chlamydia trachomatis infection. J Clin Microbiol. 1998;36(6): 1489-93.