IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Hasil Evaluasi Data Kematian Ayam

Tanaman obat Sirih Merah (Piper crocatum) secara umum memiliki

potensi sebagai bahan pendukung (prekursor) untuk menangkal infeksi virus AI

H5N1 ke sel target pada ayam. Berdasarkan data kematian ayam yang diberi

ekstrak sirih merah kemudian diuji tantang dengan virus H5N1 ekstrak sirih

merah dalam komposisi tunggal mampu menghambat kematian ayam sebesar

62.5% setelah uji tantang virus H5N1 hingga hari ke 7 yakni dari 8 ayam yang

diinfeksi 3 ayam mati pada hari ke- 7 post infeksi. Walaupun demikian

kemampuan ekstrak sirih merah dalam menahan infeksi virus H5N1 masih harus

dilakukan kajian lebih lanjut lagi. Oleh karena itu ketika ekstrak sirih merah ini

terbukti dapat menghambat kematian ayam hingga hari ke-7 post infeksi, maka

sejauh mana esktrak sirih merah tersebut dapat dimetabolisme dengan baik di

dalam tubuh ayam, dan efek samping terhadap perubahan-perubahan patologis

secara mikroskopik. Oleh karena itu kajian lebih lanjut dilakukan dengan melihat

gambaran histopatologi pada organ hati dan ginjal baik diakibatkan secara

langsung ataupun tidak langsung oleh virus H5N1 dan ekstrak sirih merah.

Tabel 1 Jumlah Kematian Pada Ayam yang Ditantang Virus AI H5N1

Ekstrak

Tanaman

Obat

Jumlah

Ayam

Jumlah ayam mati pada hari ke-

setelah tantangan Virus AI

Persentase

Kematian

(%)

1 2 3 4 5 6 7

Kelompok P1 8 - - - - - - 3 37,5

Kelompok K1 8 - - - - - - 8 100

Dalam penelitian ini sebelumnya telah dilakukan analisa kandungan bahan

kimia sirih merah menggunakan metode Gas kromatografi spektrometri massa

(GC-MS) menunjukkan kadar komponen kimia yang terdapat di dalam kandungan

tanaman obat sirih merah dirangkum dalam Tabel 2.

Tabel 2 Analisa Kandungan Bahan Kimia Tanaman Obat Dengan Metode Gas

Kromatografi Spektrometri Massa (GC-MS)

No. Tanaman Obat Komponen Kimia Konsentrasi

( ≥ 0,5 % )

1. Sirih Merah 1. Chavikol

2. Chavibetol

3. 5-amino-1,2,4-triazole

0,78

1,39

5,75

Sumber : (Setiyono et al. 2008)

Carvacrol, eugenol dan chavibetol merupakan isomer dari eugenol, sebagai

komponen antibakteria paling aktif. Mekanisme kerja komponen tersebut yakni

dengan merusak membran sitoplasma dan mengkoagulasi isi sel. Selain itu

chavibetol dan chavicol pun merupakan salah satu komponen yang mempunyai

peranan penting sebagai antioksidan. Antioksidan adalah substansi yang

diperlukan tubuh menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang

ditimbulkan oleh radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektrolit yang

dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari

pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif. Radikal

bebas merupakan jenis oksigen yang memiliki tingkat reaktif yang tinggi dan

secara alami ada di dalam tubuh sebagai hasil dari reaksi biokimia tubuh, radikal

bebas juga terdapat di lingkungan sekitar kita yang berasal dari polusi udara, asap

tembakau, penguapan alkohol yg berlebihan, bahan pengawet dan pupuk, sinar

ultr violet, x-rays dan ozon (Rachmawati 2010). Sedangkan menurut Han et al.

(2006) antioksidan merupakan molekul yang mempunyai fungsi sebagai pengikat

radikal bebas yang ada di dalam tubuh maupun sel, selain itu antioksidan pun

mempunyai peranan dalam meningkatkan sistim imun tubuh.

2. Hasil Evaluasi Histopatologi Hati

Berdasarkan hasil evaluasi histopatologi perubahan terjadi pada seluruh

kelompok baik kelompok kontrol positif maupun kelompok perlakuan. Berikut

persentase hasil skoring histopatologi organ hati dirangkum dalam Tabel 3.

Tabel 3 Persentase lesio histopatologi organ hati pada setiap perlakuan setelah

pemberian ekstrak ethanol sirih merah dan di uji tantang dengan virus AI

H5N1

Kode SKOR

Perlakuan Perlakuan

Lesio Histopatologi (%)

0 1 2 3 4 5 6

K 1a Virus AI H5N1

0 45 38 7 0 4 6

K2b Kontrol Negatif

0 38 38 0 0 21 3

P1b Sirih Merah + Virus AI H5N1 0 48 1 47 0 4 0

P2b Sirih Merah 0 37 4.6 41 0 0.4 17

Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan hasil yang berbeda

nyata (p<0.05).

Keterangan :

Skor 0= normal Skor 2= degenerasi Skor 3= degenerasi difuse Skor 6= nekrosa

Skor 1= kongesti Skor 4= pendarahan Skor 5 = infiltrasi sel radang

Berdasarkan hasil persentase lesio histopatologi pada masing-masing

perlakuan, lesio didominasi oleh kongesti, degenerasi dan nekrosa. Pada

kelompok K1 perubahan didominasi oleh kongesti sebesar 45%, kelompok K2

perubahan didominasi oleh kongesti dan degenerasi sebesar 38%, selanjutnya

pada kelompok P1 perubahan didominasi oleh kongesti dan degenerasi difuse

sebesar 48%, dan sama halnya pada kelompok P2 perubahan didominasi oleh

degenerasi difuse sebesar 41%. Kemudian, didapat hasil analisa statistik antara

kelompok kontrol positif (K1) dengan kelompok perlakuan (P2), kelompok

kontrol positif (K1) dengan kelompok kontrol negatif (K2), kelompok kontrol

negatif (K1) dengan kelompok perlakuan (P1), adalah berbeda nyata. Namun lain

halnya dengan kelompok kontrol positif (K2) dibandingkan kelompok perlakuan

(P1) dan kelompok perlakuan (P1) dengan kelompok perlakuan (P2) adalah tidak

berbeda nyata.

Perubahan patologi pada kelompok kontrol (K1) adalah kongesti,

degenerasi dan nekrosis. Menurut Tabbu (2000), unggas yang terinfeksi virus AI

H5N1 menimbulkan perubahan mikroskopik pada organ hati berupa degenerasi

dan nekrosis. Hal ini senada dengan penelitian yang dilakukan oleh Budiantono

(2003) bahwa, perubahan organ hati yang dilihat secara mikroskopis akibat

terinfeksi HPAI adalah kongesti, hemorhagi, degenerasi dan nekrosa. Hal ini

dapat disebabkan adanya gangguan sirkulasi dan metabolisme baik pada organ

hati maupun pada organ lain. Selain itu, hal ini sesuai dengan pendapat Winekler

et al. (1971) bahwa oksigen sangat penting bagi reaksi seluler sehingga

terganggunya suplai oksigen berakibat reaksi seluler tidak berjalan dengan

semestinya. Selain itu suplai oksigen dapat disebabkan oleh terganggunya

sirkulasi darah, misalnya pada keadaan kongesti sehingga mengakibatkan sel hati

mengalami degenerasi hingga nekrosis karena kekurangan natrium dan oksigen.

Sementara itu menurut Kwon et al. (2005) dalam kajian histologi unggas yang

terkena HPAI ditemukan beberapa fokus nekrosis dengan sel inflamatoris pada

multipel organ seperti jantung, otak, pankreas dan hati. Pada hati terlihat

peningkatan aktivitas seluler pada sinusoidal dengan timbulnya hiperplasia dari

sel Kuppfer, dan peningkatan jumlah sel mononuklear pada sistim portal hati.

Namun menurut Setiyono et al. (2008), dalam penelitian kali ini belum

dapat diterangkan sejauh mana infeksi telah terjadi dan seberapa jauh agen

patogen berhasil masuk ke dalam jaringan atau organ ayam yang diinfeksi virus

AI H5N1. Kongesti terjadi pada semua kelompok perlakuan terutama pada vena

sentralis dan sinusoid-sinusoid hati. Kongesti adalah suatu keadaan yang disertai

meningkatnya volume darah dalam pembuluh darah yang melebar pada suatu alat

atau bagian tubuh. Sementara itu Harada et al. (1999) menjelaskan bahwa zat

toksik dapat mengganggu sistem sirkulasi sehingga sel-sel kekurangan oksigen

dan zat-zat makanan.

Kongesti dapat terjadi melalui dua mekanisme yaitu (1) kenaikan jumlah

darah yang mengalir ke suatu lokasi atau (2) penurunan jumlah darah yang

mengalir dari suatu lokasi. Jika aliran darah ke dalam lokasi bertambah dan

menimbulkan kongesti, maka disebut kongesti aktif. Sementara kongesti pasif

tidak menyangkut kenaikan jumlah darah yang mengalir ke suatu lokasi, tetapi

lebih merupakan gangguan aliran dari lokasi itu. Apapun yang dapat menekan

venula-venula dan vena-vena yang mengalirkan darah dari jaringan dapat

menimbulkan kongesti pasif (Price dan Lorraine 2006).

Gambar 6 Hati : Kongesti sinusoid (a), kelompok K1 (Pewarnaan

HE, pembesaran objektif 20 kali).

Selanjutnya perubahan yang terlihat dari kelompok perlakuan (P2)

didominasi oleh sel hepatosit yang mengalami degenerasi hidropik baik lokal

maupun menyebar (difuse). Degenerasi hidropis adalah terjadinya peningkatan

jumlah air di dalam sel yang menyebabkan sitoplasma dan organel sel tampak

membengkak dan bervakuola. Ada faktor yang mengganggu kemampuan

membran sel untuk melakukan transport aktif ion natrium keluar sel yang

berakibat masuknya air dalam jumlah yang berlebihan ke dalam sel (Jones et al.

1997).

Ada beberapa literatur terkait dengan degenerasi hidropik diantaranya

menurut Spector dan Spector (1993) degenerasi dalam patologi dapat

didefinisikan secara luas sebagai kehilangan struktur fungsi normal, biasanya

progresif, dan tidak ditimbulkan oleh induksi radang dan neoplasia. Degenerasi

sel sering diartikan sebagai kehilangan struktur normal sel sebelum kematian sel.

Degenerasi yang terjadi umumnya adalah degenerasi hidropis. Menurut

Underwood (1992) degenerasi hidropis umumnya disebabkan oleh gangguan

metabolisme seperti hipoksia atau keracunan bahan kimia. Gangguan metabolisme

a

a

a

a

sel biasanya di dahului oleh berkurangnya oksigen karena pengaruh senyawa

toksik ke dalam tubuh (Rusmiati dan Lestari 2004).

Selain itu, perubahan yang terjadi pada kelompok perlakuan (P2) dapat

juga diakibatkan belum menemukan dosis maksimal ekstrak sirih merah.

Ketepatan dosis pemberian ekstrak sirih merah pun diduga dapat mempengaruhi,

karena apabila ketepatan dosis yang diberikan tidak diperhitungkan secara baik,

maka akan menjadi toksik bagi tubuh sehingga secara langsung akan

menimbulkan kerusakan pada sel hati sebagai organ detoksikasi. Hati adalah

organ pertama yang dicapai oleh obat atau zat sesudah diabsorpsi oleh intestinum.

Sehingga di dalam hati, obat atau ekstrak sirih merah tersebut akan mengalami

proses metabolisme dan detoksifikasi yang meliputi reaksi oksidasi, reduksi,

hidrolisis dan konjugasi menjadi bentuk terlarut atau bentuk terionisasi sehingga

dapat dieksresikan oleh ginjal. Hati merupakan organ yang paling mudah

mengalami kerusakan sesudah terpapar oleh zat kimia, terutama dengan

pemberian secara peroral. Pemberian obat atau zat yang bersifat toksik, setelah

diabsorpsi dan mengalami seluruh proses yang terjadi dalam hati akan

mempengaruhi hati dengan timbulnya perubahan patologis (Dewi 2005).

Kerusakan dan perubahan patologi pada organ hati dapat disebabkan oleh ekstrak

sirih merah yang masuk ke dalam tubuh secara peroral, kemudian akan

mengalami absorbsi di dalam usus halus. Ketika ekstrak ethanol sirih merah

tersebut yang mengandung saponin, tannin, flavonoid, minyak atsiri, dan alkaloid

mengalami detoksifikasi dan biotransformasi di dalam hati tidak sempurna,

tentunya akan menimbulkan kerusakan hati, sehingga fungsi hati pun akan

terganggu dan akan menyebabkan perubahan-perubahan patologis seperti

kongesti, degenerasi dan nekrosis. Menurut Spector dan Spector (1993), bahwa

tiga penyebab utama kematian dan disfungsi sel hati adalah virus, kekurangan

oksigen dan keracunan sel, yaitu termasuk zat-zat toksik bakteri, yang berasal dari

tumbuhan dan hewan atau sintetis.

Sementara itu menurut Henryk dan Peter (2010), degenerasi hidropik

(ballooning degeneration, toxic swelling, vacuolar degeneration, hidropic

change) merupakan perubahan hepatoseluler yang bersifat reversibel, namun

perubahan ini akan bersifat letal apabila degenerasi hidropik ini berlangsung

dalam jangka waktu yang lama. Degenerasi hidropik dapat terjadi akibat virus,

toksik (alkohol), dan kerusakan akibat iskemik hati, terutama pada lokasi

sentrolobular (zona 3) hepatosit. Oleh karena itu dosis optimum untuk

penggunaan ekstrak sirih merah ini perlu diteliti lebih lanjut, supaya ekstrak sirih

merah tidak menjadi toksik dalam tubuh terutama pada organ hati .

Gambar 7 Hati : Degenerasi hidropis sel hepatosit (a), kongesti pada

sinusoid hati (b) pada kelompok P2, (pewarnaan HE,

pembesaran objektif 40 kali).

Perubahan – perubahan yang terjadi pada kelompok kontrol K2 maupun

kelompok perlakuan P1 dan P2 tidak terlepas dari faktor lingkungan dan faktor

stress, tepatnya pada penangan ayam selama perlakuan pemberian ekstrak sirih

merah, walaupun faktor stress ini hanya memberikan sedikit kontribusi terhadap

perubahan patologis. Faktor stress dalam jangka panjang akan mempengaruhi

peningkatan kortisol di dalam tubuh. Hal tersebut sesuai dengan Arifah dan

Purwanti (2008) bahwa, peningkatan epinefrin dan kortisol secara terus menerus

dapat terjadi pada stres kronis, sehingga dapat menyebabkan penurunan sistem

imun secara keseluruhan yang ditandai dengan mudahnya individu terserang

penyakit. Hal ini dapat disebabkan karena menurunnya produksi sel plasma akibat

b

a a

b

menurunnya jumlah germinal center. Tekanan jangka panjang akan menekan

kemampuan sistem imun dalam melawan virus, bakteri dan parasit, dimana stres

kronis menurunkan kekebalan tubuh. Kemudian penurunan jumlah limfosit dapat

disebabkan oleh penurunan proliferasi limfosit pada jaringan limfoid. Keadaan

kortisol yang tinggi menimbulkan mobilisasi cadangan energi (glikogen) di hati

dan otot. Peningkatan kortisol dan epinefrin terjadi pada keadaan semua jenis stres

baik fisik, psikologis, lingkungan, kimiawi maupun trauma. Selain kortisol yang

tinggi di dalam darah dapat menyebabkan ketidakseimbangan gula darah,

penurunan densitas tulang, dan jaringan otot (Scott 2000).

Gambar 8 Hati : Fokus Nekrosis sel hepatosit (a) pada kelompok K1,

(pewarnaan HE, pembesaran objektif 20 kali).

Perubahan yang terjadi pada organ hati kelompok perlakuan (P1) dapat

diakibatkan oleh pemberian ekstrak sirih merah maupun infeksi virus H5N1, juga

dapat diduga bahwa ekstrak sirih merah belum mampu mengurangi perubahan

patologis yang disebabkan oleh infeksi virus H5N1 pada organ hati tersebut.

a

3. Hasil Evaluasi Histopatologi Ginjal

Berdasarkan hasil evaluasi histopatologi organ ginjal perubahan patologi

terjadi pada seluruh kelompok, baik kelompok kontrol maupun kelompok

perlakuan. Kongesti, degenerasi maupun nekrosa terjadi pada kelompok kontrol.

Hal ini diduga bahwa organ ginjal merupakan salah satu tempat virus H5N1 untuk

melakukan replikasi, hal tersebut sesuai dengan Swayne dan Slemons (1992),

bahwa ginjal yang terisolasi virus H5N1 mempunyai perubahan seperti nefrosis

dan akut nefritis serta nukleoprotein dari virus influenza terlihat di nukleus dan

sitoplasma dari epitel tubuli ginjal yang nekrosis, serta ditemukan fokus nekrosis

dan sel inflamatoris pada multipel organ seperti jantung, otak, pankreas dan hati.

Pada hati terlihat peningkatan aktivitas seluler pada sinusoidal dengan timbulnya

hiperplasia dari sel Kuppfer, dan peningkatan jumlah sel mononuklear pada

sistim portal hati. Sementara itu Kwon et al. (2005) bahwa, pada kajian histologi

organ ginjal yang terkena HPAI mempunyai ciri ditemukannya fokus nekrosis

dari epitel tubuli ginjal.

Selain itu perubahan patologi seperti kematian sel dapat disebabkan oleh

berbagai faktor, salah satunya adalah hipoksia akibat terganggunya sistem

sirkulasi oleh zat toksik yang masuk. Bagian korteks ginjal merupakan bagian

yang sangat sensitif terhadap terjadinya hipoksia. Khususnya pada tubulus

proksimal. Cedera hipoksia bergantung pada kecepatan transport ion di dalam

tubulus proksimal dan jerat Henle. Hipoksia dipengaruhi oleh permintaan energi

dan penggunaan oksigen. Jerat Henle asenden (menaik) secara selektif sangat

mudah mengalami defisiensi oksigen karena aktifitas transportnya yang tinggi dan

kurang mendapat suplai oksigen (Cheville 1999). Selain hipoksia, kematian sel

juga dapat disebabkan karena iskemia. Menurut Price dan Lorraine (2006),

kerusakan tubulus yang disebabkan oleh iskemia sangat bervariasi bergantung

pada luas dan durasi penurunan aliran darah ginjal.

Berdasarkan hasil evaluasi histopatologi perubahan terjadi pada seluruh

kelompok baik kelompok kontrol positif maupun kelompok perlakuan. Berikut

rataan hasil skoring histopatologi organ ginjal dirangkum dalam Tabel 4.

Tabel 4 Persentase lesio histopatologi organ ginjal pada setiap perlakuan setelah

pemberian ekstrak ethanol sirih merah dan di uji tantang dengan virus

H5N1

Kode

SKOR

Perlakuan Perlakuan

Lesio Histopatologi (%)

0 1 2 3 4 5 6

K 1b Virus AI H5N1

0 22 0 41 0 0 37

K2a Kontrol Negatif

0 0 0 73 0 0 27

P1ab

Sirih Merah + Virus AI H5N1 0 33 0 34 0 1 32

P2a Sirih Merah 0 44 0 49 0 2 5

Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan hasil yang berbeda

nyata (p<0.05).

Keterangan :

Skor 0= normal Skor 2= degenerasi Skor 3= degenerasi difuse Skor 6= nekrosa

Skor 1= kongesti Skor 4= pendarahan Skor 5 = infiltrasi sel radang

Berdasarkan hasil persentase lesio histopatologi pada masing-masing

perlakuan, lesio didominasi oleh kongesti, degenerasi dan nekrosa. Pada

kelompok K1 perubahan didominasi oleh degenerasi difuse sebesar 41%,

kelompok K2 perubahan didominasi oleh degenerasi sebesar 73%, selanjutnya

pada kelompok P1 perubahan didominasi oleh degenerasi difuse sebesar 34%,

sedangkan pada klompok P2 perubahan didominasi oleh degenerasi difuse sebesar

49%. Selanjutnya, didapat hasil analisa statistik antara kelompok kontrol positif

(K1) dengan kelompok perlakuan (P1), kelompok perlakuan (P1) dengan

kelompok perlakuan (P2) adalah tidak berbeda nyata. Sedangkan pada kelompok

kontrol positif (K1) dengan kelompok kontrol negatif (K2), dan antara kelompok

kontrol positif (K1) dengan kelompok perlakuan (P2) adalah berbeda nyata

Dari hasil pengamatan histopatologi organ ginjal pada kelompok

perlakuan P2 yakni kelompok perlakuan yang hanya diberi ekstrak sirih merah

terdapat beberapa perubahan patologis diantaranya adalah kongesti, degenerasi,

nekrosis. Dengan adanya perubahan patologis terutama nekrosis pada sel tubular

ginjal, maka diduga bahwa pemberian ekstrak sirih merah sebanyak 1 ml/ hari

selama 3-4 minggu berturut-turut sebagai faktor timbulnya perubahan tersebut.

Gambar 9 Ginjal : Degenerasi hidropis pada sel tubuli ginjal (a) dan

kongesti pada interstisial tubuli (b), (pewarnaan HE,

pembesaran objektif 40 kali).

Perubahan yang terjadi pada kelompok perlakuan (P2) diduga dapat

disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya adalah pengaruh zat yang terkandung

di dalam ekstrak sirih merah terhadap organ ginjal sebagai organ eksretori. Seperti

yang kita ketahui ginjal merupakan salah satu jalur eksretori dari berbagai obat,

sehingga apabila terdapat zat toksik maka ginjal merupakan organ sasaran utama

dari efek toksik tersebut, karena nefrotoksikan dapat menyebabkan efek buruk

terhadap berbagai bagian ginjal. Selain itu karena dalam sirih merah mengandung

senyawa flavonoid, hal ini pun diduga sebagai salah satu faktor pemicu perubahan

patologis pada organ ginjal tersebut, karena menurut Jiang et al. (2008) bahwa

mengkonsumsi tanaman herbal yang mengandung flavonoid dengan kadar tinggi

setelah dilakukan pemeriksaan biopsi pada organ ginjal, ditemukan kerusakan –

kerusakan seperti tubular nekrosis, nefritis interstitial, dan kerusakan hemoglobin.

Oleh karena itu untuk mendapatkan dosis optimal agar ekstrak sirih merah ini

dapat dijadikan sebagai imunomodulator terhadap pencegahan infeksi virus H5N1

serta tidak menimbulkan kerusakan pada organ ginjal, maka harus dilakukan

penelitian lebih lanjut.

a b

b

a

Gambar 10 Ginjal : Nekrosa (a) dan degenerasi hidropis pada sel tubuli

ginjal (b) pada kelompok K1, (pewarnaan HE, pembesaran

objektif 40 kali).

Namun, terdapat perbedaan yang tidak nyata antara kelompok kontrol K1

dengan kelompok perlakuan P1, hal tersebut dapat disebabkan bahwa ekstrak sirih

merah yang diberikan pada kelompok perlakuan P1 belum mampu memberikan

efek yang signifikan terhadap mengurangi perubahan sel akibat infeksi virus

H5N1, terutama efek terhadap organ ginjal.

a

a

b