BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDaun merupakan salah satu bagian tumbuhan yang keberadaannya sangat vital bagi kehidupan tumbuhan tersebut. Daun adalah tempat sintesis sari-sari makanan bagi tumbuhan atau disebut fotosintesis, selain itu pada daun juga terdapat stomata yang merupakan alat pernapasan. Tumbuhan memiliki warna daun yang beranekaragam. Kebanyakan daun berwarna hijau, namun ada beberapa tumbuhan yang memiliki daun yang berwarna selain hijau, seperti daun Puring (Codiaeum variegatum) yang daunnya berwarna dominan kuning, daun sirih hijau (Piper Crocatum) yang memiliki daun berwarna hijau, sedangkan untuk tumbuhan yang daunnya berwarna hijau contohnya adalah daun kemangi (Ocimum sanctum), daun katuk (Sauropus androgynus), daun singkong (Manihot utilisima L), daun kangkung (Ipomoea aquatica), daun bayam (Amaranthus spp), daun seledri dan daun pandan (pandanus amaryllifolius Roxb).Beranekaragamnya warna daun ini disebabkan karena perbedaan komposisi kandungan pigmen pada daun tumbuhan tersebut. Pigmen adalah senyawa berwarna alami pada makhluk hidup, termasuk tumbuhan. Warna hijau pada daun disebabkan adanya klorofil, sedangkan warna kuning disebabkan oleh karoten dan xantofil. Bukan berarti daun yang berwarna hijau tidak mengandung karoten maupun xantofil, hanya saja jumlah klorofilnya lebih dominan, begitu pula sebaliknya. Kita tidak dapat begitu saja menebak begitu saja kandungan pigmen daun suatu tanaman dari warnanya. Untuk memastikan senyawa berwarna (pigmen) apa yang terkandung dalam suatu sampel daun maka dapat dilakukan pemisahan pigmen tanaman dengan metode kromatografi kolom, kemudian menguji jenis pigmen yang telah dipisahkan dengan metode kromatografi lapis tipis. Sebelum dilakukan kromatografi kolom, sampel daun terlebih dahulu diekstrak dalam suatu pelarut. Setelah itu dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom menggunakan beberapa pelarut dengan urutan kepolaran tertentu. Setelah masing-masing pigmen diperoleh baru kemudian dilakukan uji KLT untuk mengetahui jenis pigmen hasil pemisahan dengan kromatografi kolom. Dengan cara ini dapat diketahui jenis pigmen yang terkandung dalam suatu sampel daun. Guna lebih memahami bagaimana cara pemisahan pigmen dari tanaman maka dalam makalah ini akan dibahas semua hal-hal yang berhubungan dengan pemisahan pigmen dari tanaman beserta contoh pemisahan pigmen tanaman dari daun sirih hijau, daun kemangi, daun katuk, daun singkong, daun kangkung, daun bayam, daun seledri, daun puring dan daun pandan.

1.2 Rumusan MasalahBerdasarkan latar belakang tersebut, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut :1) Bagaimana cara pemisahan pigmen dari tanaman (daunnya) ?2) Bagaimana cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan (kromatografi kolom dan KLT) ?3) Pigmen apa yang terkandung dalam daun sirih hijau, daun kemangi, daun katuk, daun singkong, daun kangkung, daun bayam, daun seledri, daun puring dan daun pandan?

1.3 Tujuan PenulisanSesuai dengan perumusan masalah, tujuan dari penyusunan makalah ini diantaranya sebagai berikut :1) Mengetahui cara pemisahan pigmen dari tanaman (daunnya).2) Mengetahui cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan (kromatografi kolom dan KLT).3) Mengetahui jenis pigmen yang terkandung dalam daun sirih hijau, daun kemangi, daun katuk, daun singkong, daun kangkung, daun bayam, daun seledri, daun puring dan daun pandan?

1.4 Manfaat PenulisanManfaat yang dapat diperoleh dari makalah ini sebagai berikut :(1) Memberikan kontribusi pengetahuan dalam pemisahan pigmen dari tanaman.(2) Memberikan keterampilan dalam melakukan pemisahan pigmen dari tanaman.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2. 1 Daun dan Pigmen TanamanDaun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun.Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan -karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

Gambar 3. Struktur -karoten

Gambar 4. Struktur -karotenXantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

Gambar 6. Struktur umum antosianin

2. 2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase, yakni fase diam dan fase gerak. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi).Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi kolom, kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi, sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan, dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer).Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar, maka pada saat campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat.Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua, yaitu :1) Kromatografi fase normalKromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.2) Kromatografi fase terbalikKromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas, plastik atau nilon. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang, magnesium silikat, alumina, silika gel, kalsium sulfat dan serbuk selulosa. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana, alkena, aromatis, eter, ester, keton, aldehid dan alkohol.

Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom :

Gambar 7. Bagan kolom kromatografi

Gambar 8. Kolom berisi sampel

Gambar 9. Proses pemisahan pigmen tanaman

Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatome, selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0,063 0,125 mm dilapiskan pada kaca, lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending).Pada prakteknya, sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya, plat diangkat dan dikeringkan. Setelah daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasiyangpaling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapistipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogramdanpada kondisi yang konstan merupakan besaran yang karakteristikdanreprodusibel.Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT).

Gambar 10. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT)

Gambar 11. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT

Gambar 12. Perbandingan untuk perhitungan Rf

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah : Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

2. 3 Beberapa Jenis Tumbuhana) Daun Puring (Codiaeum variegatum)Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi. Beragam kultival telah dikembangkan dengan variasi warna hijau, kuning, jingga, merah, ungu, serta campurannya. Bentuk daunnya bermacam-macam, memanjang, oval, tapi bergelombang helainya terputus-putus dan sebagainya.Secara botani, puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket, yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae.b) Daun sirih hijau (Piper crocatum)Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae, yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid, saponin, tannin dan flavonoid. Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar, maupun ekstrak kapsul. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit, seperti diabetes, hepatitis, batu ginjal dan sebagainya. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir, namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan, namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten, xantofil dan antosianin.

c) Daun seledri (Apium graveolens)Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan. Beberapa negara termasuk Jepang, Cina dan Korea mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan makanan. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun, tangkai daun, buah, dan umbinya semua dimanfaatkan. Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0,1 - 0,7%), serta senyawa golongan fenol. Komponen lainnya apiin, isokuersitrin, furanokumarin, serta isoimperatorin. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol.d) Daun kemangi (Ocimum sanctum)Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim, daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis. Selain itu, daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade, mesofil. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. Umur daun, morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil.e) Daun katuk (Sauropus androgynus)Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron, estradiol, terstosteron, glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin, prostasiklin, tromboksan, lipoksin dan leukotrien).Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan, kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Daun ini kaya akan vitamin K, selain itu pro-vitamin A ( -karoten), B dan C. Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2,8 %), besi, kalium, fosfor dan magnesium.f) Daun singkong (Manihot utilisima L)Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien, sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis.g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica)Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar, tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.h) Daun bayam (Amaranthus spp)Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom, protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi, sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi.

i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb)Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.

BAB IIIMETODE PERCOBAAN

3.1 Metode PercobaanMetode yang digunakan dalam percobaan ini adalah metode eksperimen dan hasilnya dianalisis menggunakan metode deskriptif kuantitatif.3.2 Tempat PercobaanPercobaan Pemisahan Pigmen dari Tanaman dilaksanakan di Laboratorium Kimia FKIP Unlam Banjarmasin.3.3 Waktu Pelaksanaan PercobaanPercobaan Pemisahan Pigmen dari Tanaman dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 5 April 2011. 3.4 Alat dan Bahan3.4.1 Alat yang digunakan 1. Kolom kaca: 9 buah2. Gelas ukur 10 ml: 9 buah3. Corong biasa: 9 buah4. Batang pengaduk: 9 buah5. Gelas kimia 250 ml: 9 buah6. Tabung reaksi: 36 buah7. Rak tabung reaksi: 9 buah8. Pipet tetes: 9 buah9. Lumpang dan alu: 9 buah10. Statif dan klem: 9 buah11. Cawan porselin: 9 buah12. Bunsen + kaki tiga + kain kasa: 9 buah

3.4.2 Bahan yang digunakan1. Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan pandan.2. Etanol3. Glass wool4. Sebuk Al2O3 ( alumina )5. Kertas saring6. Petroleum eter7. Kloroform8. Metanol3.5 Prosedur Kerja3 3.3 3.4 3.5 3.5.1 Ekstraksi Sampel1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.2. Menambahkan 20 mL etanol, mengaduk sampai merata.3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong.4. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL.

3.5.2 Pembuatan Kromatografi Kolom1. Menyiapkan kolom gelas 50 mL, tinggi 20 cm dan diameternya 1,5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran.2. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.3. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.4. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol.5. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka, serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara).6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll.

3.5.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan1. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3).2. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap. 3. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih.4. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

1. 2. 3. 4. 4.1 Hasil PengamatanNo.PerlakuanHasil Pengamatan

1.

2.

3.

4. 5.

6.

7.

8.

Menggerus sampel daun + 20 ml etanolMenyaring campuran

Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanolAl2O3 + 25 ml etanolMemasukkan adonan alumina + glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampelMendiamkan sampai larutan sampel menetesMenambahkan petroleum eter

Sampel yang digunakan:A. Daun singkong: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

B. Daun Pandan: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

C. Daun Bayam: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

D. Daun Kemangi: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

E. Daun Puring: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

F. Daun Kangkung: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

G. Daun Sirih: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

H. Daun Katuk: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

I. Daun Seledri: Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanolCampuran

Filtrat: larutan hijau tuaResidu: ampas daunTinggi glass wool 1 cm

Glass wool dan etanol dalam kolomAdonan alumina, campuran

Larutan sampel menyebar dan menetes

larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning

larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan hijau muda

larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua

larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning

larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda

larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening

larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning

larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua

larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua

4.2. Pembahasan Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun, yaitu daun Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter, kloroform, metanol, dan etanol. Setelah itu menguji masing-masing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut.

4. 2. 1 Ekstraksi Sampel DaunPertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu, lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil, karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang. Reaksinya adalah sebagai berikut.Etanol + klorofil fitol + etil klorofilidaSetelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman, sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini, selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula.

4. 2. 2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi, dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara, kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT.Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya, karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu, sebelum dimasukkan alumina, bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll, hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina, tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir.Saat mengisi kolom, kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai, kran kolom ditutup.4. 2. 3 Pemisahan Pigmen TanamanSetelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil, ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom, klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama, berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil, akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil.Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah :Gambar struktur klorofil a

Gambar struktur klorofil b

Gambar struktur -karoten

Gambar struktur -karoten

zzz

Gambar struktur antosianin

Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil, karoten, baru kemudian xantofil. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung, apakah dalam petroleum eter, kloroform, etanol atau metanol.a. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun PuringDari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform, etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). b. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun KemangiDari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning.Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. c. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun SeledriDari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). d. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun SingkongDari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. Meskipun karoten bersifat nonpolar, tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil.Untuk uji KLT, harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil, artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar, maka bila harga Rf kecil, larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar, dan sebaliknya apabila harga Rf besar, komponen yang terkandung bersifat lebih polar. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform, dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. e. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun BayamDari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil, dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. f. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun KatukDari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning.Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. g. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun PandanDalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan, untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar.h. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih HijauUntuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada, ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil, xantofil dan karoten. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar, namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter, sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol. i. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun KangkungDari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau. Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. Oleh karena itu, klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol.

Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut :No.Sampel DaunPetroleum eterKloroformEtanolMetanol

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. SingkongPandanBayamKemangiPuringKangkungSirihKatukSeledriKlorofilKlorofilKlorofilKlorofilXantofil KlorofilXantofilKlorofilKlorofilKlorofilKlorofilKlorofilKarotenKlorofilKlorofilXantofilKlorofilKlorofil KarotenKarotenKlorofilKaroten KlorofilKarotenXantofilKlorofilKlorofil XantofilKlorofilKlorofilXantofilKlorofilKlorofilXantofilKlorofilKlorofil

Untuk uji KLT, menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil; Rf = 0,75 Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten; Rf = 0,756 Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767 Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun.2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter, kloroform, metanol dan etanol.3. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.4. Berdasarkan percobaan, daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil, karoten, xantofil. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten. Daun bayam, katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. Daun sirih mengandung pigmen xantofil.5.2 Saran1. Sebelum memulai praktikum, dianjurkan agar setiap praktikan mempelajari dan memahami teori dasar, prosedur kerja, alat dan bahan dalam percobaan destilasi agar tidak ada kesulitan pada saat jalannya praktikum.2. Dalam pembuatan fase diam alumina dalam kromatografi kolom sebaiknya dilakukan homogenisasi serbuk aluminanya.3. Sebaiknya sampel daun yang digunakan harus segar.

DAFTAR PUSTAKAAnwar, Chairil, Bambang Purwono, harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta : Depdikbud.

Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung : Remaja Rosdakarya.

Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB.

Tim Dosen Kimia Organik. 2010. Panduan Praktikum Kimia Organik II. FKIP Banjarmasin : UNLAM. (Tidak dipublikasikan).

LAMPIRAN Pertanyaan dan Jawaban1. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ?2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ?3. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ?Jawaban 1. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap), sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT.2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten, dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil, fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol.3. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten, xantofil dan klorofil. Namun proses pemisahannya kurang sempurna, hal ini mungkin dikarenakan:a. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam.b. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur. Flow Chart A. Ekstraksi Sampel10-15 lembar daun contoh*

- Melumatkan dalam lumpang- Menambahkan beberapa mL etanol

Lumatan daun contoh + etanol

- Mengaduk sampai merata

Campuran

- Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring

Residu

Filtrat

- Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL

Pelarut

Larutan pekat

N/B: * Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan pandan

B. Pembuatan Kromatografi KolomGlass wool

Glass wool + Etanol Campuran I- Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm, hingga setinggi 1 cm

- Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm

Al2O3 + etanol

- Membuat adonan

Adonan alumina

Campuran 1 + adonan

- Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetuk-ngetuk dan keran dalam keadaan terbukaCampuran II

C. Pemisahan Pigmen dari TanamanCampuran II + etanol

- Mengelusi kembali, kemudian menutup keran

Campuran III + glass wool

- Memasukkan- Membuka keran

Campuran IV + etanol

- Membuka keran- Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit, sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3)

Campuran V + larutan contoh

- Memasukkan setinggi 1 cm

Campuran VI + pelarut

- Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen, kloroform, etanol dan metanol), jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap- Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih- Memisahkan berdasarkan warnanya- Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom

Larutan berwarna

NB : Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol)

37