IMPLEMENTASI TEKNIK NUKLIR UNTUK ANALISIS TUBERCULOSIS...

Mukll Syaifudill, dkk. ISSN 0216 - 3128 27

IMPLEMENTASI TEKNIK NUKLIRRESISTENSI MYCOBACTERIUMTERHADAP RIFAMPISIN

Mukh SyaifudinPI/sal Teknologi Keselamalan dan Metrologi Radias-BATAN

Devita Tetriana Marialina Rosilawati

Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radias BATAN

Budiman BelaDeparlemen Mikrobiologi, Fakullas Kedoktera-Universitas Indonesia

ABSTRAK

UNTUK ANALISISTUBERCULOSIS

IMPLEMENTASI TEKNIK NUKLIR UNTUK ANALISIS RESISTENSI Mycobacterium tuberculosisTERHADAP RIFAMPISIN. lnfeksi Mycobacterium tuberculosis merupakan penyebab tingginya kematianakibat tl/berkulosis (TB) terutama negara-negara di Asia dimana Indonesia menempati peringkat ketiga dari22 negara dengan kasus TB tinggi. Permasalahan menJadi lebih serius oleh merebakllya bakteri yangresislen lerhadap obat anti-TB. Teknik molekuler dengan menggunakan DNA berlabel radioisotop dapatdiandalkan untuk mengetahui mekanisme molekuler penyebab resistensi terhadap rifampisin. Dalampenelitian ini, karakteristik molekuler bagian gen rpol3 telah dianalisis dengan teknik nested polymerasechain reaction (PCR) untuk melabel deoxyribonucleic acid (DNA) dengan {a-HI' dCTP] pada 70 sputum

basillahan asam (BTA) positif Perubahan mobilitas pita produk hol-PCR 157-base pairs (bp) dianalisis

dengan leknik single strand conformational polymorphism (SSCP) pada gel poliakrilamid. Hasil deteksimenunjl/kkan bahwa 60 (85,71%) dari 70 sampel sputum adalah posilif PCR. Analisis mulnsi dengan SSCP

berhasil mengungkapkan bahwa 5 (7,1%) isolat diduga mengandung mutasi pada daerah 81 bp gen rpoBpaua kouon 526 yakni mutasi tilik (CAC-+litC) yang menyebabkan perl/ballan asam amino histidin (!lis)menJadi tirosin (fyr). Unluk kelompok sampellain sebanyak 104, hanya II (10,6%) dianlaranya positifyang ml/ngkin disebabkan karena perbedaan kondisi reaksi PCR. {Iasil studi ini mengindikasikan bahwamekanisme molekuler resistensi rifampin isolat M. tuberculosis melibatkan perubahan gen rpoB dandiagnosa molekuler dengan DNA berlabel radioisotop 121' sangat berguna untuk melldetek..~i resislensidengan lebih sensitif

Kata kUllci : infeksi, M. tuberculosis, rifampisin, rpoB, resistensi, PCR, SSCP, 121'

ABSTRACT

THE IMPLEMENTATION OF NUCLEAR TECHNIQUE FOR RESISTANCE ANALYSIS OF

Mycobacterium tuberculosis TO RIFAMPISIN. Mycobacterium tuberculosis infection is still regarded as acausative agenl of high mortality mainly in the Asian countries where Indonesia ranks third on the list of 22high-burden tuberculosis countries in the world. This problem is become more serious due to the emergenceof resistant bacteria to anti-TB drugs. Molecular technique with radioisotope-labeled DNA could beimplemented to assess the molecular mechanism of rifampicin resistance in M. tuberculosis. In this research,the molecular nature of a part of the rpoB gene was analyzed using nested polymerase chain reaction (PCR)technique for labeling deoxyribonucleic acid (DNA) with (a_12p dCTpJ in 70 sputa of positive acid fastbacilli (AFB) results. The alteration of the mobility movement of 157-base pairs (bp) hot-pCR product was

analyzed with single strand conformational polymorphism (SSCp) technique on polyacrylamide gel. Sixty(85.71%) samples of the 70 sputa were pCR positive. The analysis of mutation with SSCP revealed that 5(7.1%) isolates were suggested to contain mutation in the 81 bp region of the rpoB gene at codon 526 i.e.point mutation (~AC-+ [A C) which resulted in amino acid alteration from histidine (His) to tyrosine (Tyr).For other group of 104 samples, only II (10.6%) of them were positive with MF-MR which may be due tothe difference in pCR reaction condition. The results from our study clearly indicate that the molecularmechanism of rifampicin resistance in M. tuberculosis isolates involves alterations in the rpoB gene andmolecular diagnosis by using 121' labeled DNA is useful for detection of resistance with more sensitive.

Keywords: infection, M. tuberculosis, rifampicin, rpoB, resistance, PCR, SSCP, 121'

Prosiding PPI - PDIPTN 2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta, 10 Juli 2006

28- ISSN 0216-3128 Mukh Syaifudin, dkk.PENDAHULUAN

1~cobacterium tuberculosis telah menginfeksilVlsejumlah besar penduduk di dunia yaknisekitar 8,8 juta kasus tuberkulosis (TB) baru

dengan kematian 3 juta per tahun dan menjadimasalah kesehatan masyarakat paling pentingterutama di negara-negara berkembang [1]. DiIndonesia, masalah TB masih menjadi ancaman yangserius karena ditemukan sekitar 557.000 kasus TB

setiap tahun dan selama tahun 2002 ditemukan 115kasus dengan smear positif per 100.000 populasi[2.3]. Merebaknya kembali TB disertai bertambahnyajumlah strain M. tuberculosis yang resisten terhadapobat TB seperti rifampisin (RIF) telah terjadi sejaktahun 1980 [41. Hal ini mengancam keberhasilanprogram pengendalian TB nasional yangmengandalkan terapi tuberkulostatika jangka pendekdan merupakan tulang punggung terapi anti-TB [5,61.Resistensi disebabkan oleh pengobatan yang tidaktepat, ketidakpatuhan pasien dalam meminum obat,adanya infeksi human immunodeficiency virus(HIV) [7] dan secara genetika disebabkan karenamutasi gen atau akusisi dari gen lain [8].

Rifampisin (RIF) adalah obat antibakteriyang handal dan kombinasi komponen regimenstandard yang merupakan obat Iini pertama untukpengobatan TB dengan aktivitas tinggi terhadap M.tuberculosis. Analisis pada kurang lebih 500 strainM. tuberculosis dari berbagai penjuru duniamenunjukkan bahwa 96% isolat klinis M.tuberculosis yang rcsisten RIF mcmiliki mutasi didaerah 8 I-bp gen rpoB, suatu house-keeping geneyang mengkode sub-un it-beta dari polimerase RNA18.9] dan mampu memblok masuknya nukleotidapertama yang diperlukan untuk mengaktifkanpolimerase karena menghalangi sintesis mRNA.Sebagian besar mutasi missense penyebab resistensiRIF ditemukan pada kodon 513, 514, 526, atau 531dan 533 dari rpoB [8} sehingga menjadi marker RIF.Diperkirakan 90% isolat resisten RIF juga resistenterhadap isoniazid, sehingga resistensi terhadap RIFmenjadi indikator penting untuk resistensi ganda(multi-drug resistance, MDR), dengan demikianobat Iini kedua atau ketiga sangat diperlukan denganwaktu pengobatan lebih lama dan risiko lebih toksik[10,11]

Pengungkapan mekanisme molekulerpenyebab resistensi terhadap obat antimikrobamemerlukan pengembangan dan aplikasi denganbeberapa strategi PCR yang didesain untukmendeteksi mutasi penyebab resistensi secara cepatseperti PCR nested, duplex, multiplex atau real-time[12,13]. Ada kalanya dalam PCR diperoleh amplifikasiDNA non spesifik yang mungkin disebabkan olehsekuens yang sangat beragam dari DNA rpoB

diantara bakteri yang kaya akan deret basa G-C yang

masih menyelinap di dalam saluran pemafasanpasien yang menyebabkan kesulitan dalammenginterpretasikan basil. Untuk mendekatikebenaran, telah diperkenalkan metode heminestedPCR yang didasarkan pada signature nukleotida dariM. tuberculosis dan diketahui lebih spesifik dalammengamplifikasi suatu segmen gen.

Teknik deteksi konvensional temyatamemiliki beberapa kelemahan seperti lambat,prosedumya panjang dan kurang sensitif sehinggadapat memberikan diagnosa yang salah. Sedangkanteknik molekuler hanya membutuhkan I atau 2parasit dalam sampel, kemudian DNA-nyadigandakan sampai I juta kalinya dengan PCRmenggunakan asam nukleat berlabel radioisotopseperti P-32 dan hasilnya dapat diperoleh hanyadalam waktu kurang lebih I jam [14.151. Teknik nuklirdapat digunakan untuk melengkapi teknikkonvensional dan pada beberapa aplikasi, tekniknuklir dapat dikatakan spesifik dan menawarkanbeberapa kelebihan an tara lain lebih sensitif danlebih murah untuk mengidentifikasi organisme yangresisten, untuk mengetahui kerja suatu obat danmendeteksi organisme yang sangat virulent.Makalah ini menyajikan hasil analisis molekuleryang cepat dan sensitif untuk deteksi resistensidengan teknik PCR dan SSCP menggunakan DNAyang dilabel dengan radioisotop 32p pad a sam pelklin is.

TAT A KERJA

Sam pel klinis

Sebanyak 70 sampel sputum diperoleh daripasien rawat jalan (55 wan ita dan 15 pria; umur rata-rata 67 15,2 tahun) di Pusat PerkumpulanPemberantasan Tuberkulosis Indonesia (PPTI)Kebayoran Baru Jakarta (50 sampel) dan BalaiPengobatan Penyakit Paru-pru (BP4) Surakarta JawaTengah (20 sampel). Kelompok sampel sputum lainberjumlah 104 buah dari PPTI JI. Baladewa JakartaPusat dan Puskesmas Serpong Tangerang dianalisispula dalam penelitian ini. Seluruh pasien didugamenderita TB berdasarkan hasil diagnosis basiltahan asam (BT A) posit if dengan pewamaan Ziehl-Neelsen. Sampel dari Puskesmas tidak duj i BTA.

Ekstraksi DNA mikobakterium dari sam pelsputum

Isolasi DNA dari spesimen klinis dilakukandengan prosedur Boom seperti telah ditinjausebelumnya [16]. Lima ratus mikroliter sputum

Proslding PPI - PDIPTN 2005Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN


Mukh Syaifudin, dkk. ISSN 0216-3128 29

dicampur dengan volume sarna larutan N-acetyl L-cysteine NaOH-Na-sitrat dalam tabungmikrosentrifus strcril, dikocok dengan horizontalgyrotary shaker selama 20 men it pada 420 rpm,kcmudian discntrifus selama 10 men it pada 12.000rpm. Setelah dicuci dengan akuadest steril dua kali,pelet ditambahkan 100 III larutan TE, 900 Ililarutanpelisis dan 20 III Diatom kemudian dikocok kembalidengan shaker selama 10 men it pada 100 rpm dandisentrifus selama 2 menit pada 12.000 rpm. Setelahdicuci 2 kali dengan buffer pencuci dan etanol 70%dingin dan satu kali dengan aseton, pelet dikeringkanpad a 56C. Ke dalam pelet, ditambahkan 50 IIIlarutan TE kemudian diinkubasi pad a 56C selama10 menit. Setelah disentrifus, supernatannyadigunakan untuk template PCR. Seluruh prosedurinokulasi dan ekstraksi DNA dilakukan dalambiological safety cabinet class /I.

Amplifikasi DNA bakteri dengan primerMF -MR

Sepasang primer oligonukleotida yangmengamplifikasi fragmen DNA berukuran 342 bpdan spesifik untuk kompleks M. tuberculosis yakniMF: 5'-CGA CCA CTT CGG CAA CCG-3'; danMR: 5'-TCG ATC GGG CAC ATC CGG-3'

(Genotech Corporation Korea). Amplifikasi dilaku-kan dengan mencampur 3-5 III template DNAdengan 20 pmol masing-masing primer ke dalamtabung PCR-Premix (AccuPower PCR; Bioneer,Chungbuk, Korea) yang mengandung I U Taq DNApolymerase, 250 11M masing-masing deoksinukleo-sida trifosfat (dNTP), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3),40 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, dan gel loading dye.Kontrol positif adalah DNA dari strain standard M.tuberculosis (H37Rv) dan kontrol negatif adalahakuadest. Siklus amplifikasi dilakukan padaautomated thermal cycler (Bio Rad). Profil siklusmeliputi denaturasi awal 95C selama 5 menit diikuti30 siklus yang terdiri dari denaturasi pad a 95Cselama 30 detik, annealing pada 60C selama 30detik, dan ekstensi primer pada noc selama 45detik dan ekstensi akhir pada noc selama 5 men it.Pendeteksian dilakukan dengan elektroforesis pad a1,5% agarose (Sigma) yang dilarutkan dalam I,OXTAE (Tris-Acetate-EDT A) mengandung etidiumbromida (0,5 Ilglml) dan divisualisasi pada panjanggelombang 260 nm UV transilluminator. Kelompoksampel sputum lain dari PPTI JI. Baladewa yangberjumlah 104 buah juga dianalisis denganpencampuran komponen PCR biasa dengan kondisiPCR dan visualisasi sarna seperti di atas.

Amplifikasi DNA M. tuberculosis denganPCR nested radioaktif

PCR nested dilakukan dengan outer primersTB I (5'-ACG TGG AGG CGA TCACAC CGCAGA CGT-3') dan TB2 (5'-TGC ACG TCG CGGACC TCC AGC CCG GCA-3') dan inner primersTB3 (5'-TCG CCG CGA TCA AGG AGT TCT TC-

3') dan TR8 (TGC ACG TCG CGG ACC TCC-3')seperti ditinjau sebelumnya [15,17,18]. PCRdilakukan dalam tabung premix komersial(AccuPower PCR PreMix; Bioneer) yangmengandung Taq polymerase 2U, Tris-HCI to mM(pH 8,3), dan MgCh 1,5 mM dan primer TB I danTB2 masing-masing 20 pmol dan primer TB3 andTB8 masing-masing 1,25 pmol dan kemudianvolume dibuat menjadi 20 Ill. Satu mikroliter(0, I IlCi) [:t.-32P]dCTP (Amersham International)ditambahkan ke dalarn campuran reaksi sertadilakukan PCR dengan kondisi preheating pada94C selama 5 menit, diikuti 15 siklus untukamplifikasi tahap awal (30 detik pada 94C, I menitpada 82C) diikuti amplifikasi kedua sebanyak30 siklus (30 detik pada 94C, I menit pada nC)dan ekstensi selama 5 menit pada noc yangdilakukan pada mesin BioRad Thermal cycler Japan.Pencampuran dan proses PCR dilakukan denganperalatan proteksi yang memadai.

Analisis mutasi gen rpoB dengan SSCPradioaktif

Dalam penelitian ini telah digunakan metodeSSCP seperti dilakukan oleh Kim dkk [13] untukmelokalisir mutasi. Enam mikroliter prod uk PCRberlabel 32p radioaktif dicampur dengan 2 III SSCPloading dye dan 4 III formam ide 95% (Biorad) yangmengandung denaturant urea (Biorad). Sampeldidenaturasi pada 95C selama 4-5 men it, kemudiandiletakkan diatas es serta di-Ioad pad a gel 0.5XMutation Detection Enhancement (MDE) (BMA,Rockland, ME, USA). Electroforesis dilakukandengan sistem proteksi radiasi pada 50-5 I V suhukamar selama 5-7 jam. Gel MDE diambil denganmenempelkan kertas penyaring Whatman, ditutupdengan plastik saran wrap dan selanjutnyadikeringkan dengan vakum-panas (Rapid Dry, Atto,Japan) selamal jam. Gel diletakkan dalam kaset,diatasnya diletakkan film sinar-X (Kodak) kemudian

disimpan pada suhu -80C selama 24 jam - 2 hari.Film dicetak dengan Fuji Medical Processor.

HASIL PENELITIAN

Amplifikasi DNA M. tuberculosis denganPCR

Dari 70 spesimen yang diduga mengandungM. tuberculosis dengan hasil uji BTA 100% positif,



30 ISSN 0216-3128 Mukh Syaifudin, dkk.

Gambar 2. Hasil amplifikasi DNA dengan PCRnested untuk gen rpoB yangmenunjuklmn pita-pita produk DNAberukuran 157 base-pair (bp) untuksetiap sam pel. M adalah markerbertingkat 100, 200 dan 300 bp, K+dan K- masing-masing adalah kontrolpositif dan kontrol negatif.Pewarnaan dengan EtBr

60 (85,71%) spesimen diantaranya menunjukkanpositif mengandung M tuberculosis berdasarkanhasil PCR dengan primer spesifik MF-MR dari genrpoB (Gambar I). Hasil ini menunjukkan keandalanteknik PCR yang dapat diterapkan langsung padaspesimen sputum untuk mendeteksi M tuberculosis.Namun untuk kelompok sam pel lain (sebanyak 104sam pel dari PPTI Baladewa, Pasar Senen), hanya II(10,6%) diantaranya positif. Hal ini disebabkankarena perbedaan kondisi reaksi yang dilakukanpada kedua kelompok. Untuk kelompok pertama (70sampel dari PPTI Kebayoran Baru dan BP4), PCRdilakukan dengan menggunakan premix-PCRkomersial dengan konsentrasi komponen tertentuyang berbeda dengan reaksi PCR untuk kelompokkedua (\ 04 sampel) yang menggunakan reaksi PCRkonvensional (pencampuran biasa). Dalam GambarI terlihat pita-pita yang muncullebih dari satu untuksetiap sampel sehingga perlu dilakukan teknikamplifikasi DNA menggunakan PCR-nested.

M 35 40 43 45 47 4S 49 51 52 K+ K-

31H) "-a.200 -+100-+

~1 9 10 28 30 36 43 Kt K K

IS7bp

Gambar 1. HasH amplifikasi dengan PCRkonvensional menggunakan primerMF-MR gen rpoB yang menunjukkanpita-pita produk DNA berukuran 342base-pair lebih dari satu untuk setiapsam pel

M adalah marker bertingkat 100, 200 dan300 bp. K+ dan K- masing-masing adalah kontrolpositif dan kontrol negatif. Pewamaan dengan EtBr.PCR nested menghasilkan produk berukuran 157 bpdimana pita-pita tunggalnya terlihat jauh lebih baikdaripada PCR konvensional. Hal ini disebabkankarena produk yang diamplifikasi oleh fase PCRpertama (sepasang primer TBI-TB2) adalah DNArpoB berukuran 205 base pair (bp) yang kemudianmengamplifikasi fragmen 157-bp yang merupakanhasil amplifikasi fase PCR kedua sehingga lebihspesifik (Gambar 2). Oleh karena itu adanya mutasidalam DNA yang teramplifikasi dari semuaspesimen dapat ditentukan dengan mudahmenggunakan analisis SSCP. Satu sampelmenunjukkan pita yang memoles sepanjang sumurgel yang dapat disebabkan karena kontaminasi.

300 ""200_IIJO-

342bp

Analisis mutasi dengan SSCP radioaktif

Bukti genotipik yang diduga menjadipenyebab resistensi M. tuberculosis terhadaprifampin dapat diperoleh dengan mengamati adanyaperubahan mobilitas pita untai tunggal DNAmenggunakan teknik SSCP dibanding kontrol.Dalam penelitian ini 5 (7, I%) dari 70 sampel yangdiuji diduga mengandung mutasi gen rpoB penyebabresistensi RIF. Hasil analisis mutasi dengan SSCPradioaktif yang menunjukkan kesamaan mobilitaspita DNA dengan pita DNA kontrol positifditunjukkan dalam Gambar 3. Dalam penelitian inidigunakan kontrol positif strain M. tuberculosis yangresisten (R) terhadap rifampisin yang memilikimutasi gen rpoB pada posisi kodon 526(~AC-+IAC) yang menyebabkan perubahan asamamino histidin (His) menjadi tirosin (Tyr).Sedangkan kontrol rentan (susceptible) (S) adalahstrain M tuberculosis yang sensitif terhadap obatkarena tidak memiliki mutasi pada gen rpoB. Dariseluruh sampel yang dianalisis, sampel nomor 28,42, 63, 64 dan 67 diduga mengandung mikobakteriresisten terhadap rifampisin. Namun hal ini perludianalisis lebih lanjut dengan sekuensing untukmemastikan jenis mutasinya. Di samping itu perludikemukakan bahwa sampel yang positif tersebutbelum tentu tidak memiliki mutasi gen rpaB padakodon lain, karena kontrol positif yang digunakanhanya menunjukkan mutasi pada kodon 526 yangmungkin ukuran produk PCR-nya sarna denganprod uk ini.

Prosldlng PPI - PDIPTN 2005Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN


/lllIkll SYllijiu/iIl, tlkk. ISSN H2 \(, - 31211 3/

Cambar 3. HasH analisis mutasi dengan SSCPradioaktif untuk gen rpoB yangmenunjukkan resistensi terhadapRtF pada sampel nomor 28, 42, 63,64 dan 67. S adalah sam pel standarduntuk rentan (susceptible) dan Radalah resisten. Waktu

elektroforesis 8 jam pada suhukamar dan pemajanan 40,5 jam

PEMBAHASAN

Resistensi strain Mycobacterium tuberculosissangat mempengaruhi penyebaran tuberkulosis(TB). Penanganan kasus yang kurang baik mungkinmenjadi faktor paling penting dalam penyebaranresistensi TB dimana prosedur standard diagnosisdan pengobatan seringkali tidak diikuti dengan baik.Permasalahan logistik, waktu dan tempat yangmemadai juga menjadi kendala keberhasilan ujiresistensi dalam skala besar dengan mengandalkanmetode konvensional di beberapa laboratorium.Implementasi metode yang handal untuk ujiresistensi ini dapat membantu survei dan mendeteksiresistensi obat, serta mengidentifikasi pasien resistenobat ganda (multi-drug resistance TB) dengan lebihcepat dan sensitif/spesifik [I]. Oleh karena itulahPustek Keselamatan dan Metrologi Radiasi tergugahuntuk menyumbangkan pemikirannya dalammenangani perrnasalahan besar ini denganmenawarkan metode berbasis teknik nuklir yangternyata lebih sensitif yakni menggunakan pelabelanDNA menggunakan isotop radioaktif.

Deteksi resistensi yang cepat terhadap RIFsebagai obat lini pertama adalah sangat dibutuhkanuntuk pengendalian secara efisien strain yangresisten terhadap obat ganda [17.18J. Metode biologimolekuler yang mengeksploitasi perubahan materigenetik penyebab resistensi obat dapat digunakanuntuk diagnosa TB. Resistensi ini sangatberhubungan dengan mutasi titik di daerah gen rpoS[151, yakni mutasi yang juga menyebabkan resistensiterhadap RIF pada Escherichia coli [191. Berbagaimacam metode moJekuler telah digunakan untukmendeteksi mutasi yang unik ini seperti PCR-SSCP,

single-tube heminested PCR-SSCP, metode dideoxyfingerprinting, line probe assay, dan analisis DNAsequence [131. Diantara metode tersebut, PCR-SSCPmerupakan metode yang paling praktis, tetapideteksi langsung M. tuberculosis resisten RIF dalamsputum dengan PCR-SSCP konvensional memilikikelemahan dalam sensitivitasnya. Oleh karena ituperlu dikembangkan metode deteksi didasarkan padateknologi nuklir.

Dalam penelitian ini digunakan isotop 32pdengan waktu paro 14 hari yang memungkinkanuntuk melabel DNA dengan aktivitas spesifik sangattinggi. Ini berarti bahwa sejumlah kecil produkberlabel akan menghasilkan sejumlah besardisintegrasi radioaktif per menit. Satu keunggulandari 32p adalah isotop ini akan menghasilkan berkaspenetrasi partikel beta (elektron) yang memunculkansinyal/pita yang lebih lebar pada lembaran film.(sotop 32p dapat diganti dengan 33pyang memilikiwaktu paruh dua kali lebih lama sehingga akanmenghasilkan gambaran pita yang lebih tajam.Substrat dNTP yang dilabel dengan isotop ini akanmemiliki umur lebih lama, tetapi dengan waktuparuh lebih panjang sehingga aktivitas spesifiknyamenjadi lebih rendah. Isotop 32p dapat juga digantidengan isotop 35S dimana unsur sulfur akanmengganti unsur oksigen dalam gugus pospatmenghasi:kan tio-pospat. Dengan waktu paro lebihlama (85 hari), maka substrat yang dilabel dengan35S memiliki waktu paro lebih lama denganpeluruhan energetik lebih kecil yang berarti hasilpita pada filmnya lebih tajam [201.

Uji PCR dapat.memberikan identifikasi yangcepat dengan mengamplifikasi secara selektif daerahdi dalam genom bakteri yang spesifik untuk setiapspesies maupun strain [211. Uji ini dapat digunakanterutama untuk bakteri yang tumbuh lambat, tidakdapat dikultur dan pada sejumlah kasus dimanapertumbuhan bakteri dihambat dengan obat. Namunkondisi yang sangat penting adalah bahwa templateDNA hasH ekstraksi dari sputum bebas daripenghambat PCR disamping metode yang haruscepat dan sederhana serta dapat diandalkan. Dalampenelitian ini, dengan menggunakan primer MF-MRuntuk setiap sampel diperoleh pita-pita PCR lebihdari 2 atau 3 (Gambar 2), hal ini mungkindisebabkan karena adanya kontaminasi atau primertidak berikatan secara spesifik pada template DNA.Kemungkinan lain disebabkan oleh sekuens yangsangat beragam dari DNA gen rpoS diantara bakteriyang mengandung banyak deret basa G-C yangmasih menyelinap di dalam saluran pernafasanpasien yang menyulitkan interpretasi hasil.Sedangkan dengan menggunakan PCR nested, pita-pita yang muncul adalah tunggal.

Prosiding PPI PDIPTN Z006Pustek Akselerator dan Proses Bahan BATAN


32 ISSN 0216-3128 Mukh Syaifudin, dkk.

Dalam penelitian ini persentase sampel yangresisten terhadap RIF diketahui rendah (7, I%).Resistensi primer (resistensi yang belum pernahmendapat OAT kurang dari I bulan) terhadap RIF dilaboratorium Mikrobiologi RSUP Persahabatanadalah sebesar 1,6%, jadi lebih rendah. Sedangkanresistensi sekunder (penderita pernah mendapatpengobatan lebih dari I bulan) adalah 6,02%, yangmenunjukkan kemiripan hasil. Sedangkan di BP4Medan pada 1997-1998, resistensi sekunderterhadap RIF adalah 2,77% [221. Rendahnyapersentase (1-2%) perubahan genetik di daerah genrpoB yang diuji secara in vitro resisten terhadap RIFini juga ditemukan oleh beberapa peneliti lain [23.24].Persentase resistensi sebesar 5% ditemukan oleh

Watterson dkk [25] dan persentase sedikit lebih tinggi(11,3%) ditemukan oleh Alrajhi dkk [26].

Dalam studi ini, digunakan PCR diikuti

dengan SSCP yang merupakan metode yang sangatluas untuk deteksi mutasi titik dimana pita abnormal

pad a gel non-denaturing poliakrilamida. Namununtuk memastikan jenis mutasi yang terjadi,diperlukan metode sequencing untuk mengetahuiurutan asam nukleotidanya. Kelebihan lain dariSSCP adalah ban yak produk PCR dapat diketahuijenis-jenis mutasi secara sekaligus dan merupakanmetode yang jauh lebih efisien untuk mengetahuipolymorphism dalam lokus inti. Meskipun berbagaimacam penelitian membuktikan sensitivitas proberadioaktif jauh lebih tinggi, namun memilikiketerbatasan yakni waktu paro isotop yang pendekdan bahaya radiasi yang dimilikinya, sehinggametode chemiluminescence lebih banyak digunakan(27.28J. Keberhasilan SSCP juga dipengaruhi olehsuhu saat elektroforesis yang konstan, kondisi pHdimana DNA biasanya didenaturasi dalam larutan

dengan pH tinggi (aditif gliserol dapat menurunkanpH dan menggunakan buffer Tris-borat) dan ukuranfragmen (ukuran DNA yang paling baik adalahsekitar 150 pasang basa). Dengan kondisi optimal,80-90% perubahan basa yang terjadi dapat dideteksidengan SSCP. Dalam penelitian ini terbukti SSCPradioaktif lebih sensitif dibandingkan SSCPkonvensional atau non radioaktif yakni pewarnaan

EtBr (data tidak disajikan).

KESIMPULAN

Analisis mutasi dengan SSCP terbuktimerupakan teknik yang sederhana dan efektif untukmendeteksi substitusi bas a tunggal (mutasi). SSCPradioaktif lebih sensitif dibandingkan SSCPkonvensional (non radioaktit). Dari 70 spesimenyang dianalisis, 60 spesimen diantaranyamenunjukkan positif keberadaan M. tuberculosis

berdasarkan hasil PCR dengan primer spesifik MF-

MR. Untuk 104 sampel lain, hanya II (10,6%)diantaranya positif yang disebabkan karenaperbedaan kondisi reaksi PCR yang dilakukan. Lima(7,1%) dari 70 sampel sputum BTA positif didugamengandung mutasi gen rpoB berdasarkan hasilanalisis SSCP radioaktif yakni memiliki mutasi genrpoB pada kodon 526 (~AC-IAC) yangmenyebabkan perubahan asam amino histidin (His)menjadi tirosin (Tyr). Isotop 32p dapat digunakanuntuk melabel DNA dengan aktivitas spesifik tinggisehingga akan lebih kuat dalam menetrasi film dandiperoleh gambaran pita DNA yang lebih tajam danlebih mendekati kebenaran.

DAFT AR PUST AKA

1. WORLD HEALTH ORGANIZATIONS, PPM

DOTS in Indonesia; A Strategy for Action,Geneva, Switzerland, 2003.

2. WORLD HEALTH ORGANIZATION RE-

PORT, WHO's Global Tuberculosis Control,.Geneva, Switzerland, 2004.

3. MOKROUSOV, I., BI-IANU, N.V .. SUFFYS.P.N., KADIVAL, G.V., YAP, S.F., CHO, S.N ..JORDAAN, A.M., NARVSKA YA, 0., SINGH.U.B., GOMES, H.M., LEE, H., KULKARNI,S.P., LlM, K.C., KHAN, B.K., SOOLINGEN.D.V., VICTOR, T.C., and SCHOULS, L.M ..Multicenter evaluation of reverse line blot assayfor detection of drug resistance inMycobacterium tuberculosis clinical isolates.Journal of Microbiological Methodl', 57, 323-335, 2004.

4. RATTAN, A., KALlA, A., and AHMAD, N.,

Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives, Emerging InfectiousDiseases 4, 195-209, 1998.

5. KOCH I, A., VARELDZIS, B., and STYBLO.K., Multi-drug resistant tuberculosis and control,Res. Microbiol. 144, 104-110, 1993.

6. SOMOSKOVI, A., PARSONS, L.M. andSALFINGER, M., The molecular basis ofresistance to isoniazid, rifampin, andpyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis,Respiratory Research 2, 164-0168. 2001.

7. SNYDER, D.E. and ROPER W.L., The newtuberculosis, New England Journal of Medicine326,703-705, 1992.

8. MUSSER, J., Antimicrobial Agent Resistance inmycobacteria: molecular genetic insights, ClinMicrobiol Rev, 8:496-514, 1995.



Mukh Syaifudill. dkk. ISSN 0216 - 3128 33

and figuresPersahabatan

Center for TB,

9. VALlM, A., ROSSETTI, M., RIBERIO, M, andZAHA, A., Mutations in the rpoB Gene ofmulti drug-resistant Mycobacterium tuberculosisisolates ITom Brazil, J. Clin. Microbiology, 38(8): 3119-3122, 2000.

10. YUEN, L., LESLIE, D., and COLOE, P.,Bacteriological and molecular analysis ofrifampin-resistant Mycobacterium tuberculosisstrains isolated in Australia, J. Clin.

Microbiology 37(12): 3844-3850, 1999.

11. WATTERSON, S., WILSON, S., YATES, M.,

and DROBNIEWSKI, F.A., Comparison ofthree molecular assays for rapid detection ofrifampin resistance in Mycobacteriumtuberculosis, J. Clin. Microbiology 36(7): 1969-1973, 1998.

12. RISKA, P., JACOBS, W., and ALLAND, D.,Molecular determinants of drug resistance inTuberculosis, Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4(2 SupplI): S4-1 0, 2000.

13. KIM, BJ., HONG, S.K., LEE, K.H., YUN, YJ.,KIM, E.C., PARK, Y.G., BAI, G.H., andKOOK, Y.H., Differential identification ofMycobacterium tuberculosis complex andnontuberculous Mycobacteria by duplex PCRassay using the RNA polymerase gene (rpoB),Journal of Clinical Microbiology, 42(3): 1308-1312,2004.

14. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY

AGENCY, Combating infection in developingcountries, Vienna Austria, 2000.

15.TELENTI, A., IMBODEN, P., MARCHESI, F.,LOWRIE, D., COLE, S., COLSTON, MJ.,MATTER, L., SCHOPFER, K., and BODMER,T., Detection of rifampin-resistance mutations inMycobacterium tuberculosis, Lancet 341: 647-650, 1993.

16. GARCIA, L., ALONSO-SANZ, M.,

REBOLLO, MJ., TERCERO, J.e., andCHA VES, F. Mutations in the rpoB gene ofrifampin-resistant Mycobacterium tuberculosisisolates in Spain and their rapid detection byPCR-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,Journal of Clinical Microbiology 39 (5): 1813-1818, 2001.

17. KIM, B. J., LEE, K. H., PARK, B. N., KIM, S.J., PARK, E. M., PARK, Y. G., BAI, G. H.,KIM, S. J., and KOOK, Y. H., Detection ofrifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis insputa by nested PCR-Iinked single-strandconformation polymorphism and DNA

sequencing, J. C/in. Microbiol. 39: 2610-2617,2001.

18. TELENTI, A., IMBODEN, P.,

MARCHESI, F., SCHMIDHEINI, T., andBODMER, T., Direct, automated detection ofrifampin-resistant Mycobacterium tuberculosisby polymerase chain reaction and single-strandconformation polymorphism analysis,Antimicrob. Agents Chemother., 37:2054-2058,1993.

19. JlN, D. and GROSS, C.A., Mapping andsequencing of mutations in the Escherichia colirpoB gene that lead to rifampicin resistance, J.Mol. Bioi., 202: 45-58, 1988.

20. DAVIS, L.G., KUEHL, W.M., and BATTEY,JF., Basic Methods in Molecular Biology, Edisikedua, Appleton and Lange, USA, 1994.

21. JENKINS, FJ., Basic methods for the detection

of PCR products. PCR Methods andApplications, 3:S77-82, 1994.

22. ADITAMA, C.Y., FactsMycobacterial LaboratoryHospital, WHO Collaborating2000.

23. BODMER, T., ZURCHER, G., IMBODEN, P.and TELENTI, A., Mutation position and type ofsubstitution in the p-subunit of the RNApolymerase influence in-vitro activity ofrifamycins in rifampicin-resistantMycobacterium tuberculosis, Journal ofAntimicrobial Chemotherapy, 35: 345-348,1995.

24.0HNO, H., KOGA, H., KOHNO, S., TASHIRO,T. and HARA, K., Relationship betweenrifampin MIC for rpoB mutations ofMycobacterium tuberculosis strains isolated inJapan, Antimicrobial Agents and Chemotherapy,40, 1053-1056, 1996.

25. WATTERSON, A.S., WILSON, S.M., YATES,M.D., and DROBNEIEWSKI, F.A., Comparisonof three molecular assays for rapid detection ofrifampin resistance in Mycobacteriumtuberculosis, J. Clin. Microbiol.36, 1969-1973,1998.

26. ALRAJHI, A.A., ABDUL WAHAB, S.,ALMODOVAR, E., and AL-ABDELY, H.M.,

Risk factors for drug-resistant Mycobacteriumtuberculosis in Saudi Arabia, Saudi Med. J., 23,305-310, 2002.

27. KASY AP, V.K., SITALAKSMI, T.,CHATTOPADDHYAY, P. and TRIVEDI, R.

Prosiding PPI - PDIPTN2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta. 10 Juli 2006

34 ISSN 0216 - 3128 Mukh Syaifudin, dkk.

DNA profiling technologies in forensic analysis,

Int. 1. Human Genet 4(3), 11-30,2004.

28. LOVLIE, R. and EIKEN, H.G., Increased P-32SSCP sensitivity by combining RE digestion andextended X-ray film exposures, Biotechniques22(4): 598-600, 1997.

TANYAJAWAB

M. Yazid

- Apakah sudah diperhitungkan efek radiasi P-32terhadap kejadian mutasi DNA?

- Perlu dibuatldirancang metode untukmembedakan an tara mutasi yang asli dan akibatradiasi.

M. Syaifudin

- Efek radiasi P-32 tidak diperhitungkan karenamutasinya akan terjadi dengan memerlukanwaktu lama. Disamping itu dalam pene/itian inidigunakan kontrol positip yang susceptible(tidak ada mutasi) sebagai pembanding

- Terima-kasih atas sarannya, tetapi tidak ada

manfaatnya dibandingkan dengan urgensiperlunya informasi resistensi yang akandigunakan untuk pertimbangan pengobatan TBsecara tepat.

Sucipta

- Jelaskan singkat indikasi adanya resistensiMicobacteri Tuberculosis dengan teknik nuklir.

- Bagaimana keadaannya bila resistensi tersebuttidak hanya oleh Rifampisin, misal terhadap obatyang lain.

M. Syaifudin

Dalam pene/itiain ini, resistensi M, tuberculosisditelusuri melalui perubahan pada DNA yaknimutasi pada gen rpoB. Perubahan mobi/itas pitaDNA berlabel P32 pada sel po/ioksilamid didugakarena terjadi pada gen lain yang menjadi obatlain seper/i isomiazid (gen kat G), a/aupirazinamid dan streptomisin.



IMPLEMENTASI TEKNIK NUKLIR UNTUK ANALISIS RESISTENSI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TERHADAP RIFAMPISISABSTRAKPENDAHULUANTATA KERJAHASIL PENELITIANPEMBAHASANKESIMPULAN DAFTAR PUSTAKATANYA JAWAB

1: KE DAFTAR ISI

IMPLEMENTASI TEKNIK NUKLIR UNTUK ANALISIS TUBERCULOSIS...

Documents

Transcript of IMPLEMENTASI TEKNIK NUKLIR UNTUK ANALISIS TUBERCULOSIS...