Post on 07-Feb-2023
ISOLASI DAN DETEKSI GEN toxR, tdh, dan trh BAKTERI Vibrioparahaemolyticus PADA IKAN BALEDANG(Trichiurus lepturus, Linn)
DENGAN METODA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)*
Nama : ASRI DIAN
No. BP : 05 931 051
I. PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang Masalah
Sebagian besar wilayah di bumi dikelilingi oleh
lautan, sehingga sumber bahan makanan banyak yang berasal
dari laut. Ikan, kerang-kerangan, cumi dan udang
merupakan beberapa seafood yang cukup digemari karena
rasanya yang lezat dan bergizi tinggi. Hasil laut yang
paling banyak dikonsumsi oleh masyarakat adalah ikan
karena ikan paling mudah diperoleh dan memiliki jenis
yang beragam, seperti ikan baledang (Trichiurus lepturus. Linn)
yang menjadi salah satu komuditas ekspor Indonesia
(Ambarwati, 2008). Ikan baledang sangat mudah dikenali
dari bentuknya yang panjang dan pipih. Ikan ini dikenal
dengan berbagai macam nama lokal yaitu ikan layur (Jawa),
melei (Palabuhanratu), baledang (Padang), lajuru
(sulawesi selatan), romu (Ambon), dan lajur (Madura).
1
Baledang merupakan tipe ikan predator, yang memakan ikan
kecil, udang kecil dan cumi-cumi kecil.
*Sari penelitian ini akan diseminarkan di Fakultas Farmasi
Universitas Andalas, pada :
Hari/Tanggal : Rabu/1 Desember 2010 Jam : 11.00 WIBTempat : Ruang Seminar Fakultas FarmasiPembimbing : 1. Dr. Hj. Marlina, MS, Apt
2. Fithriani Armin, S.Si, M.Si, Apt
Keamanan mengkonsumsi seafood mulai menjadi
perhatian setelah terjadinya wabah foodborne diasease yang
diduga karena infeksi Vibrio parahaemolyticus pada awal tahun
1950 di Jepang, dan semenjak tahun 1996 mulai pandemik di
negara-negara Asia dan Amerika (Wong, 2003; Hara-Kudo,
2003). Menurut Nair et al. (2007), Indonesia termasuk salah
satu wilayah penyebaran kasus pandemik yang disebabkan
oleh bakteri V. parahaemolyticus.
Bakteri V. parahaemolyticus adalah bakteri Gram negatif
berbentuk batang bengkok, anaerob fakultatif dan bersifat
halofilik, yang patogen pada manusia (Wong et al., 1999;
Wong, 2003; Nair, et al., 2007; Sujeewa et al., 2009).
Infeksi dapat terjadi karena mengkonsumsi makanan yang
terkontaminasi oleh bakteri patogen, makanan yang dimasak
2
setengah matang, atau makanan yang dikonsumsi tanpa
dimasak (Lida, et al., 1998; Wong, 2003; Okuda et al.,
1997;), dengan gejala yang ditimbulkan adalah
gastroenteritis yang sifatnya akut.
Bakteri V. parahaemolyticus mempunyai gen spesifik yaitu
toxR. Keberadaan gen ini tidak bersifat patogen terhadap
manusia. Namun V. parahaemolyticus menghasilkankan gen-gen
virulen yang sifatnya patogen yaitu gen tdh yang
bertanggungjawab terhadap produksi toksin berupa
Thermostable Direct Hemolysin (TDH) dan gen trh yang memproduksi
toksin TDH–Related Hemolysin (TRH). Tingkat virulen V.
parahaemolyticus tidak dipengaruhi oleh jumlah V.
parahaemolyticus tersebut, tapi sangat tergantung pada
toksin yang dihasilkan gennya (Wong, 2003; Sujeewa et al.,
2009). Mekanisme patogen V. parahaemolyticus sangat
berhubungan dengan adanya produksi gen tdh dan trh, yang
memberikan respon terhadap β-hemolisis (Marlina, 2008).
Penelitian mengenai adanya gen virulen pada bakteri
V. parahaemolyticus telah dideteksi pada beberapa jenis
seafood diantaranya udang putih (Penaeus mergensis), udang
kelong (Penaeus indicus), pensi (Corbicula moltkiana. Prime) dan
langkitang (Faunus ater) (Marlina, et al., 2007; Mudaris,
3
2009; Azyenela, 2009). Pada penelitian ini dilakukan
deteksi gen toxR dan gen virulen pada ikan baledang dengan
menggunakan metoda PCR. Dengan adanya penelitian ini
diharapkan dapat diperoleh data mengenai keberadaan gen
toxR dan gen virulen bakteri V. parahaemolyticus yang terdapat
pada sampel ikan baledang.
I.2. Perumusan Masalah
Apakah ditemukan kontaminasi bakteri V. parahaemolyticus
pada ikan baledang (T. lepturus)
Apakah ditemukan gen toxR, tdh, trh pada bakteri V.
parahaemolyticus yang terdapat pada ikan baledang (T.
lepturus)
I.3. Tujuan dan Manfaat Penelitian
Tujuan
Mengisolasi dan mendeteksi gen toxR, tdh, dan trh
bakteri V. parahaemolyticus dengan metoda PCR
Manfaat
4
Mengetahui keamanan pangan, khususnya pada ikan
baledang (T. lepturus)
Melengkapi data base untuk penelitian V. parahaemolyticus
Memanfaatkan penggunaan teknik PCR untuk identifikasi
gen bakteri
II. PELAKSANAAN PENELITIAN
2.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang
dan di Laboratorium Mikrobiologi Rumah Sakit M. Djamil
selama enam bulan dari bulan mei sampai bulan oktober
tahun 2010.
2.2 Metoda Penelitian
Penyiapan media
Pembuatan media
Pengambilan sampel ikan baledang
5
Isolasi V. parahaemolyticus dalam media selektif
SPB (Salt Polymixin Broth) dan CHROMAgarTM Vibrio
Peremajaan V. parahaemolyticus dalam media LB Broth
Identifikasi bakteri menggunakan metoda
Polymerase Chain Reaction (PCR).
2.3 Alat dan Bahan
2.3.1 Alat
Mesin PCR (Eppendorf Mastercyclergradient®), tabung
eppendorf, cawan petri, Erlenmeyer, gelas piala, gelas
ukur, batang pengaduk, jarum Ose, kapas, lidi steril,
pipet mikro (Eppendorf®), lampu spritus, hot plate, vortex
(Mixer® VM-1000), timbangan digital, sentrifugator
(Eppendorf Minispin®), incubator (Gallenkamp®), lemari
pendingin, rotary shaker incubator (Bigger Bill Digital®),
laminar air flow (ESCO®), autoklaf (All American®), perangkat
elektroforesa, alumunium foil, dan gel documentation (Bio-
Rad®).
2.3.2 Bahan
6
Sampel ikan baledang (T. lepturus), media Salt Polymixin
Broth (SPB) (”Nissui”®), media CHROMAgarTM Vibrio, media
Luria Burtani Broth, aquadest steril, buffer TBE, agarose
powder, primer (Invitrogen®), Taq polimerase (Promega®), 5x
buffer PCR (Promega®), 2,5 mM dNTP’s (Takara®), ethidium
bromida. Kontol positif tdh (strain no. AQ3815/stock
no.8069 dan strain no. VP81/stock no.8072, Kontrol positif
trh (strain no. AQ4037/stock no.8070, dan kontrol negatif
(strain no. 219/stock no.8073).
2.4 Cara Kerja
2.4.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat gelas dibungkus dengan aluminium foil.
Tips mikropipet ukuran kecil, menengah dan besar ditaruh
dalam wadahnya masing-masing sesuai ukurannya, ditutup
rapat dan diberi selotip. Tabung mikrosentrifuge
dimasukkan dalam gelas piala ditutup rapat dengan
alumunium foil. Lidi dimasukkan dalam gelas piala dan
ditutup dengan alumunium foil, lalu semua disterilkan
menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC dengan tekanan 15
lbs selama 15 menit. Sedangkan jarum Ose dan spatel
7
disterilkan dengan cara dibakar pada lampu spritus selama
20 detik setiap kali akan digunakan.
2.4.2 Pengambilan Sampel
Sampel diperoleh dari pedagang ikan baledang (T.
lepturus) di Muaro Padang, kemudian diidentifikasi di
Laboratorium Taksonomi Hewan Jurusan Biologi Fakultas
MIPA. Sampel yang diambil adalah sebanyak 10 gram yang
terdiri dari bagian kepala, perut dan daging ikan, yang
dihancurkan dalam kantung plastik yang bersih.
2.4.3 Penyiapan dan Pembuatan Media
1. Pembuatan media CHROMagarTM vibrio
Serbuk CHROMagarTM vibrio ditimbang sebanyak 74,7 g
dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest steril di
dalam Erlenmeyer yang steril, kemudian dipanaskan
hingga terbentuk massa yang homogen dan dididihkan 2
menit, dituang pada cawan petri steril.
2. Pembuatan media modified Salt Polymixin Broth (SPB) .
8
Serbuk SPB ditimbang sebanyak 33 g dan dilarutkan
dalam 1 liter aquadest steril di dalam Erlenmeyer,
kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121º C
dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit.
3. Pembuatan media Luria Burtani (LB) Broth
Serbuk LB broth ditimbang sebanyak 25 g dan
dilarutkan dalam 1 liter aquadest steril di dalam
Erlenmeyer dengan konsentrasi NaCL 3 %, kemudian
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121ºC dengan
tekanan 15 lbs selama 15 menit.
4. Pembuatan media Nutrient Agar (NA)
Serbuk NA ditimbang sebanyak 20 g dan dilarutkan
dalam 1 liter aquadest steril di dalam Erlenmeyer
dengan konsentrasi NaCL 3 %, kemudian dipanaskan
sampai homogen dan disterilkan dengan autoklaf pada
suhu 121ºC dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit.
2.4.4 Isolasi V. parahaemolyticus
Diambil sebanyak 10 gram sampel yang terdiri dari
bagian kepala, perut dan daging ikan baledang yang telah
di hancurkan dalam plastik bersih, kemudian dimasukkan
dalam Erlenmeyer berisi 100 ml SPB yang telah
9
disterilkan, lalu diaduk homogen. Selanjutnya diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian
dilakukan pengenceran mulai dari 10-1 sampai 10-3 dengan
cara memipet 0,1 ml sampel induk dimasukkan kedalam 0,9
ml media SPB di dalam tabung eppendorf untuk pengenceran
10-1, selanjutnya 0,1 ml dari pengenceran10-1 dimasukkan
kedalam 0,9 ml media SPB di dalam tabung eppendorf untuk
pengenceran 10-2, demikian seterusnya sampai pengenceran
10-3. Setelah itu masing – masing pengenceran bakteri
tersebut dipipet sebanyak 100 µl lalu ditanam pada media
CHROMagarTM vibrio dalam cawan petri, kemudian diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 24 jam. Biakan dalam cawan petri
akan memberikan koloni berwarna ungu yang positif
mengandung bakteri V. parahaemolyticus. Diambil 1 Ose koloni
ungu pada cawan petri, lalu dimasukkan pada tabung
mikrosentrifuge yang telah berisi 1 ml LB Broth kemudian
dimasukkan dalam inkubator shaker pada suhu 37 oC
kecepatan 160 rpm selama 24 jam. Biakan ini yang akan
digunakan untuk ekstraksi DNA.
2.4.5 Peremajaan kultur bakteri V. parahaemolyticus
10
Biakan murni V. parahaemolyticus yang disimpan didalam
CHROMagarTM vibrio diambil 1 atau 2 Ose kemudian
diinokulasikan dalam LB Broth, kemudian diinkubasi pada
inkubator shaker pada suhu 37 oC kecepatan 160 rpm selama 24
jam. Untuk penyimpanan jangka panjang sebagai stok,
kultur bakteri ditanam pada agar miring yang berisi
Nutrien Agar (NA).
2.4.6. Deteksi gen V. parahaemolyticus
2.4.6.1 Ekstraksi genom DNA
Ekstraksi genom DNA dilakukan dengan metode Boil Cell
Extraction (BCE). Kultur media LB Broth yang terdapat dalam
tabung eppendorf sebanyak 1 ml disentrifuge pada 10.000
rpm selama 5 menit, lalu supernatan dibuang dan endapan
disuspensikan dalam 1 ml NaCl 0,85 % steril lalu
divortex. Suspensi bakteri tersebut dipanaskan dalam air
mendidih selama 10 menit. Selanjutnya diamkan 10 menit
dalam es dan disentrifuge lagi pada 14.000 rpm selama 3
menit, supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu
11
-20º C (stock solution). Setelah itu ekstraksi DNA dapat
dideteksi dengan menggunakan mesin PCR.
2.4.6.2 Pengaturan Program Mesin PCR
Komponen-komponen dan campuran yang digunakan :
a. Untuk gen toxR (Kim, Y.B., et al. 1999) :
Pereaksi Jumlah
Pereaksi (μl)Aquadest steril 14,95 x PCR Taq Buffer 5,0Primer 1 1.0Primer 2 1.02,5 mM dNTP’s 2,0Taq Polymerase 0,1DNA Template (Genom DNA) 1.0Volume Total 25 µl
b. Untuk gen tdh dan trh (Tada, J., et al. 1992) :
Pereaksi Jumlah
Pereaksi (μl)Aquadest steril 14,95 x PCR Buffer 5,0Primer 1 1.0Primer 2 1.0
12
2,5 mM dNTP’s 2.0Taq Polymerase 0,1DNA Template (Genom DNA) 1.0Volume Total 25 µl
Keterangan :
Primer Untuk gen toxR :
Primer 1 (toxR 4) : 5’ - GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’
Primer 2 (toxR 7) : 5’ -
ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’
Primer Untuk gen tdh :
Primer 1 (tdh-D3= VPD2) : 5’-
CCACTACCACTCTCATATGC-3’
Primer 2 (tdh-D5= VPD1) : 5’-
GGCATCAAATGGCTGATACT-3’
Primer Untuk gen trh :
Primer 1 (trh 2) : 5’- GGCTCAAAATGGTTAAGCG-3’
Primer 2 (trh 6) : 5’- CATTTCCGCTCTCATATGC-3’
13
Masukkan tiap-tiap komponen ke dalam tabung eppendorf
yang berisi genom DNA, homogenkan dan masukkan ke mesin
PCR yang telah dibuat program kerjanya.
Tahapan Kerja Mesin PCR :
a. Untuk deteksi gen toxR ( 23 siklus ) sbb:Tahapan Dalam Siklus Temperatur/
WaktuPradenaturasi 94o C ( 5 menit
)Denaturasi 94o C ( 1 menit
)Annealing (Pengikatan) 63o C ( 1,5
menit )Extension
(Pemanjangan)
72o C ( 1,5
menit )Elongation
(PemanjanganAkhir)
72o C ( 7 menit
)
b. Untuk deteksi gen tdh dan trh ( 33 siklus ) sbb:Tahapan Dalam Siklus Temperatur/
WaktuPradenaturasi 94o C (1
menit )Denaturasi 94o C ( 1 menit
)
14
Annealing (Pengikatan) 55o C ( 1 menit
)Extension
(Pemanjangan)
72o C ( 1 menit
)Elongation
(PemanjanganAkhir)
72o C ( 7 menit
)
2.4.7. Elektroforesa untuk gen toxR, tdh, dan trh
Elektroforesa dilakukan dengan menggunakan gel
agarose 1,5 %. Elektroforesa menggunakan TBE 1 x pada
tegangan 100 Volt selama 30 menit. Kemudian gel direndam
dengan 1 μL larutan ethidium bromida selama 15 menit.
Selanjutnya dilihat gambarnya dengan alat gel documentation.
Pada hasil foto dari alat gel documentation dapat dilihat
pola pemisahan pita-pita DNA yang ukurannya diketahui
melalui perbandingan dengan ukuran pita-pita standar 100
bp DNA ladder, dimana ukuran pita-pita DNA V. parahaemolyticus
untuk gen toxR adalah 368-bp, untuk gen tdh adalah 251-bp,
dan untuk gen trh adalah 250-bp (Kim, Y.B., et al. 1999;
Marlina, 2008; Sujewa, 2008; Tada, J., et al. 1992).
2.5. Analisa Data
15
4.1. Hasil
Setelah dilakukan penelitian diperoleh hasil sebagai
berikut :
1. Dari isolasi terhadap sampel ikan baledang (T.
lepturus) yang diperoleh dari Muaro Padang,
menunjukkan adanya bakteri Vibrio parahaemolyticus yang
ditandai dengan adannya koloni bakteri berwarna ungu
pada media selektif CHROMAgarTM Vibrio (Gambar 6,
Lampiran 6). Jumlah koloni ungu bakteri yang
diperoleh dari 4 kali sampling adalah sebanyak 38
koloni. Pada sampling pertama diperoleh sebanyak 30
koloni, pada sampling kedua tidak diperoleh satu pun
koloni bakteri yang berwarna ungu, sampling ketiga
diperoleh 1 koloni, dan sampling keempat 7 koloni
(Tabel 1, Lampiran 5)
2. Hasil deteksi gen terhadap 38 kultur bakteri
menggunakan elektroforesa dengan metoda PCR
(Polimerase Chain Reaction) diperoleh 27 kultur bakteri
yang positif memiliki gen toxR, dan tidak satupun
yang terdeteksi gen tdh dan trh (Tabel 1, Lampiran
5).
17
2.2. Pembahasan
Keberadaan mikroorganisme dalam makanan memegang
peranan penting dalam pembentukan toksin atau senyawa
yang menyebabkan makanan menjadi tidak layak
dikonsumsi dan menimbulkan bahaya bagi yang
mengkonsumsinya. Kondisi ini dinamakan dengan
keracunan makanan. WHO mendefinisikannya sebagai
foodborne diasease, yaitu penyakit yang umumnya bersifat
infeksi atau racun yang masuk ke dalam tubuh melalui
makanan yang dicerna. Salah satu bakteri yang
mengkontaminasi makanan yang berasal dari laut dan
18
menyebabkan keracunan makanan adalah bakteri V.
parahaemolyticus.
Pada penelitian ini isolasi dan deteksi bakteri V.
parahaemolyticus dari sampel ikan baledang (T. lepturus)
dilakukan di Muaro Padang sebanyak empat kali
sampling. Isolasi dilakukan dengan menginokulasi
sampel sebanyak 10 gram dalam 100 ml media pengaya.
Media yang digunakan untuk inokulasi adalah media
selektif Salt Polymixin Broth (SPB) yang ditambah dengan 3%
NaCl untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri halofilik
Vibrio sp yang optimal. Media SPB mengandung antibiotika
Polymixin B dimana bakteri V. parahaemolyticus telah
resisten terhadap antibiotika ini, sehingga
pertumbuhannya akan tetap berlangsung sedangkan
bakteri gram negatif lain akan mati.
Isolasi dilakukan dalam 3 variasi pengenceran yaitu
10-1, 10-2, dan 10-3, secara direct plating pada media
CHROMAgarTM Vibrio yang selektif terhadap bakteri V.
parahaemolyticus. Media CHROMAgarTM Vibrio mengandung
subsrat untuk aktivasi enzim β-galaktosidase yang
dengan adanya senyawa kromogenik menghasilkan koloni
berwarna biru untuk koloni Vibrio cholerae, warna putih
19
untuk Vibrio alginolyticus dan warna ungu untuk V.
parahaemolyticus (http:/chromagar.com/products Vibrio, 2003).
Bila di dalam satu cawan perti tumbuh koloni bakteri
yang berwarna biru, putih dan juga ungu maka
diperlukan penanaman kembali pada media CHROMAgarTM
Vibrio yang baru dengan tujuan untuk memisahkan koloni
ungu menjadi koloni-koloni tunggal yang selanjutnya
dapat digunakan sebagai kultur murni untuk pengujian
dengan metoda PCR.
Kultur murni dari bakteri V.parahaemolyticus ini
diekstraksi dengan metoda Boil Cell Extraction (BCE). Metoda
ini dipilih karena lebih mudah dan efisien
dibandingkan dengan metoda Phenol Chloroform Isoaminalcohol
(PCI) DNA Extraction. Pada metoda PCI DNA Extraction
diperlukan biaya yang relatif lebih mahal, membutuhkan
waktu yang lama, dan kerja yang lebih teliti. Hasil
BCE nantinya akan di amplifikasi PCR bersamaan dengan
komponen PCR. Untuk kontrol positif juga harus di
amplifikasi bersama dengan sampel. Komponen PCR untuk
deteksi gen toxR, tdh, dan trh pada bakteri V. parahaemolyticus
dalam penelitian ini mengikuti prosedur menurut Kim, et
al.,(1999) dan Tada, et al.,(1992).
20
Metoda PCR adalah metoda analisa molekular yang
sangat sensitif untuk mengidentifikasi gen target pada
bakteri. Metoda PCR adalah suatu teknik in vitro untuk
penggandaan DNA secara enzimatis, berdasarkan pada
kesesuaian antara primer dengan template DNA gen target.
Penggandaan gen target berlangsung dalam 5 tahapan
siklus. Tiap siklus terdiri dari proses predenaturasi,
denaturasi, annealing (pengikatan), extension
(pemanjangan), dan elongation (pemanjangan akhir)
( Sambrook & Russel, 2001).
Proses yang terjadi pada mesin PCR adalah denaturasi
DNA dengan suhu yang tinggi (94 oC) sehingga rantai DNA
yang berupa rantai ganda yang berpilin akan berpisah
menjadi helaian tunggal. Gen target terputus menjadi
dua buah helaian tunggal yaitu rantai basa nukleotida
1 yang diikat oleh primer 1 (toxR 4) dari arah 3′ (tiga
aksen) ke 5′ (lima aksen) dan rantai basa nukleotida 2
diikat oleh primer 2 (toxR7) dari arah 3′ ke 5′ juga.
Dengan adanya enzim Taq Polymerase dan dNTP's (d-ATP, d-
CTP, d-GTP, d-TTP) sebagai suplai nukleotida, primer
yang tersusun dari lebih kurang 13 basa nukleotida
akan diperpanjang sehingga jumlahnya sama dengan
21
rantai basa nukleotida 1 dan 2 membentuk dua buah gen
yang sempurna.
Setelah proses amplifikasi menggunakan mesin PCR
selesai, DNA yang telah mengalami penggandaan
dideteksi untuk melihat adanya gen toxR, tdh, dan trh.
Keberadaan gen-gen tersebut dideteksi menggunakan
alat elektroforesa dengan melihat pola pemisahan DNA
yang dibandingkan dengan kontrol positif.
Elektoforesa dilakukan pada gel agarose 1,5 %
menggunakan TBE (Tris Base Acid EDTA) 1x pada tegangan
100 volt selama 30 menit untuk mendorong pergerakan
DNA dalam larutan elektrolit (TBE). Pewarnaan gel
setelah elektroforesa dilakukan dengan cara perendaman
gel didalam 1 µg/ml larutan ethidium bromida selama 10
menit supaya pita DNA terlihat saat difoto dengan alat
gel documentation.
Gen toxR merupakan gen global yang ikut berperan
dalam sintesa toksin pada bakteri dari genus Vibrio. Gen
ini pertama kali ditemukan pada bakteri Vibrio cholerae
tetapi kemudian ditemukan juga pada beberapa spesies
bakteri lainnya dari genus Vibrio, antara lain Vibrio
vulnificus dan Vibrio parahaemolyticus (Provenzano, 2000).
22
Perbedaannya adalah pada susunan basa nukleotida dari
gen toxR yang terdapat pada V. cholerae berbeda dengan gen
toxR yang terdapat pada V. parahaemolyticus. Hemolisin yang
telah diisolasi dari V. parahaemolyticus yaitu TDH
(thermostable direct hemolysine), dan TRH
(thermostable direct hemolysine-related hemolysine).
Hemolisin ini merupakan faktor virulen penting yang
terdapat pada V. parahaemolyticus.
Hasil deteksi gen menunjukkan bahwa pada sampel ikan
baledang (T.lepturus) terdapat bakteri V. parahaemolyticus.
Ini ditunjukkan dari 38 kultur yang dideteksi terdapat
27 kultur positif toxR (71%). Dari 27 kultur yang
positif toxR tersebut tidak ada satu pun yang
terdeteksi gen virulen tdh dan trh. Tidak terdeteksi
adanya gen virulen ini adalah karena keberadaan
bakteri V.parahaemolyticus di lingkungan memang sangat
kecil yaitu 1-2 % (Dileep, 2003). Ini berarti sampel
yang terkontaminasi oleh bakteri V.parahaemolyticus pada
penelitian ini termasuk non-patogen atau bersifat
Kanagawa Negatif (Kim, 1999; Hara-kudo, 2003).
23
Dari hasil juga terlihat perbedaan jumlah gen toxR
yang terdeteksi dari sampel yang diambil pada bulan
Mei dengan sampel yang diambil pada bulan Agustus dan
September. Dimana sampling pertama (bulan Mei) yang
dilakukan saat musim panas dengan curah hujan yang
rendah terdeteksi keberadaan gen toxR sebanyak 71%,
sementara sampling berikutnya (bulan Agustus dan
September) yang dilakukan pada musim panas yang curah
hujannya cukup tinggi tidak terdeteksi adanya gen toxR.
Pada beberapa penelitian, terjadinya outbreaks yang
disebabkan oleh bakteri V. parahaemolyticus memang banyak
terjadi pada musim-musim panas (Cabrera-Garcia, et.al,
2004; Charles-Hernandez, et.al, 2005; Laohaprertthisan,
et.al, 2003). Hasil penelitian ini diharapkan sebagai
informasi pada masyarakat agar selalu mengolah bahan
makanan yang berasal dari laut dengan memasak
sempurna.
24
V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil penelitian dapat diambil kesimpulan bahwa
pada sampel ikan baledang (T. lepturus) yang diperoleh dari
Muaro kota Padang, Sumatera Barat terdapat bakteri V.
parahaemolyticus. Dan dari 38 kultur bakteri V.
parahaemolyticus yang dideteksi memberikan hasil 27 kultur
positif gen toxR, dan tidak satupun kultur yang positif
gen tdh dan gen trh.
5.2 Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk
melakukan identifikasi jenis Vibrio lain seperti Vibrio
alginolyticus, Vibrio fulmyticus, dan Vibrio cholera dengan metode
PCR pada sampel T.lepturus.
25
DAFTAR PUSTAKA
Ambarwati,D.V.S. 2008.Studi Biologi reproduksi Ikan layur(Superfamili trichiuroidea) di perairan Palabuhanratu, Kabupaten Sukabumi,Jawa Barat. Skripsi Fakultas Perikanan dan Ilmu KelautanInstitut pertanian Bogor: Bogor.
Azyenela, L. 2009. Deteksi Gen Virulen Bakteri Vibrioparahaemolyticus Dari sample Pensi (Corbicula moltkiana. Prime) DanLangkitang (Faunus ater) Dengan Metoda Polymerase Chain Reaction (PCR).Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Andalas : padang.
Ansaruzzaman, M. et al. 2005. Pandemic serovars(O3:K6 and O4:K68) of Vibrio parahaemolyticus Associated withDiarrhea in Mozambique:Spread of the Pandemic into theAfrican Continent. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 43.No.6. p2559-2562.
Cabrera-Garcı´a, M.E, Carlos Va´zquez-Salinas, &Elsa Irma Quin˜ones-Ramırez. 2004. Serologic andMolecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus StrainsIsolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of
26
Mexico. Applied And Environmental Microbiology, Vol. 70. No. 11.P. 6401-6406.
Charles-Hernández, G.L., MSc, Enrique Cifuentes,Stephen J. Rothenberg. 2005. Environmental factorsassociated with the presence of Vibrio parahaemolyticus in seaproducts and the risk of food poisoning in communitiesbordering the Gulf of Mexico . Journal of Environmental HealthResearch. Vol. 5 issue 2: 75-80.
CHROMAgarTM, “CHROMAgarTM Vibrio”,http:/chromagar.com/products Vibrio, 2003.
Dileep V, Kumar, H.S., Kumar, Y., Nishibuchi, M.,Karunasagar, I., & Karunasagar, I. 2003. Application ofpolymerase chain reaction for detection of Vibrioparahaemolyticus associated with tropical seafoods andcoastal environment. Letters in Applied Microbiology. 36; 423-427.
Hara-Kudo,Y et al. 2003. Prevalence of PandemicThermostable Direct Hemolysin-Producing Vibrioparahaemolyticus O3:K6 in Seafood and the CoastalEnvironment in Japan. Applied and Environmental Microbiology.Vol. 69, No. 7. p3883–3891.
Kim, Y.B., Okuda, J., Matsumoto, C., Takahashi, N.,Hashimoto, S & Nishibuchi, M. 1999. Identification ofVibrio parahaemolyticus Strains at the Species Level by PCRTargeted to the toxR Gene. Journal Of Clinical Microbiology. 37 (4)1173-1177.
Laohaprertthisan, V., A. Chowdhury., U. Kongmuang.,S. Kalnauwakuli., M. Ishibashi., C. Matsumoto., & M.Nishibuchi. 2003. Prevalence and serodiversity of thepandemic clone among the clinical strains of Vibrioparahaemolyticus isolated in southern Thailand.Epidemiol.Infect. 130.395–406.
Lida,T., Kwon-Sam,P., Orasa,S., Junji,K.,Yoshiharu,Y., Koichiro,Y and Takeshi,H. 1998. Close
27
proximity of the tdh, trh and use genes on the chromosome ofVibrio parahaemolyticus. Department of Bacterial Infections, ResearchInstitute for Microbial Diseases, Osaka University, 3-1 Yamadaoka,Suita, Osaka 565, Japan.
Marlina. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrioparahaemolitycus Dengan Metoda Biolog dan Deteksi Gen ToxRnya Secara PCR. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, Vol. 13, No.1.
Marlina., Son Radu., C. Yoke Kqueen., Suhaimi,N.,Zunita,Z., Sahilah Abd Mutalib and Mitsuaki,N. 2007.Detection of tdh And trh Genes In Vibrio parahaemolyticusIsolated From Corbicula moltkiana Prime In West Sumatra,Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health, Vol 3, No. 2,Hal 349-355.
Mudaris, F. 2009. Isolasi dan Deteksi Vibrio parahaemolyticusPada Udang Putih (Penaeus merguensis) dan Udang Kelong (Penaeusindicus) Dengan Metoda PCR. Skripsi Fakultas farmasiUniversitas Andalas : Padang.
Nair, G. Balakrish., Thandavarayan,R., Sujit K,Bhattacharya., Basabjit,D., Yoshifumi,T., and David A,Sack. 2007. Global Dissemination of Vibrio parahaemolyticusSerotype O3:K6 and Its Serovariants. Clinical MicrobiologyReviews, Vol. 20, No. 1.
Okuda, J., Masanori,I., S. L. Abbott., M. Janda.,and M. Nishibuchi. 1997. Analysis of the ThermostableDirect Hemolysin (tdh) Gene and the tdh-Related Hemolysin(trh) Genes in Urease-Positive Strains of Vibrioparahaemolyticus Isolated on the West Coast of the UnitedStates. Journal of Clinical Microbiology, p. 1965–1971, Vol. 35, No.8.
Provenzano,D., Darren .A, Schuhmacher., Justin. L,Barker and Karl. E, Klose. 2000. The Virulence RegulatoryProtein ToxR Mediates Enhanced Bile Resistance in Vibrio
28
cholerae and Other Pathogenic Vibrio Species. Infection andImmunity, p. 1491–1497,Vol 68, No. 3.
Sambrook J. & Russel D.W. 2001. Molecular Cloning ALaboratory Manual. Volume 1. Third edition. CSHL Press. NewYork.
Sujeewa.A.K.W, Norrakiah, A. S. and Laina, M. 2009.Prevalence of toxic genes of Vibrio parahaemolyticus inshrimps (Penaeus monodon) and culture environment.International Food Research Journal 16: 89-95.
Tada , J. et al. 1992. Detection of the thermostabledirect hemolysin gene (tdh) and the thermostable directhemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrioparahaemolyticus by polymerase chain reaction. Molecular andCellular probes. 6.477-487.
Wong, Hin-Chung. 2003. Detecting and MolecularTyping of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Food and Drug Analysis,Vol. 11, No. 2, Pages.
Wong, Hin-Chung., Shu-Hui Liu., Lee-Wen Ku., I-YingLee., Tien-Kuei Wang., Yeong-Sheng Lee., Chih-Lung Lee.,Li-Ping Kuo and D. Yang-Chih Shih. 1999. Characterizationof Vibrio parahaemolyticus isolates obtained from FoodPoisoning Outbreaks during 1992-1995 in Taiwan. Departmentof Microbiology, Soochow University, Taipei, Taiwan 111,Republic of China.
29
Lampiran 1. Skema Isolasi Vibrio parahaemolyticus
Dihomogenkan diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 24 jam
dilakukan pengenceran sbb :
30
10 g sampel ad 100 mlSPB
0,1ml 0,1ml 0,1ml
Larutan induk 0,9 ml SPB 0,9 ml SPB 0,9 ml SPB
(10-1) (10-2) (10-3)
0,1ml 0,1 ml 0,1 ml
CHROMAgar™ Vibrio
Gambar 1. Isolasi Vibrio parahaemolyticus pada Sampel ikan baledang (Trichiurus lepturus)
Lampiran 2. (lanjutan)
31
Semua Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 oC ± 24jam
Koloni ungu
Koloniungu
1 koloni tunggal
diinkubasi pada inkubator
shaker pada suhu 37oC, 24
jam,160 rpm
Gambar 2. Skema Pemurnian Kultur Bakteri V.
Parahaemolyticus yang ditanam pada media NA
32
ditanam pd LB Broth dalam botoluniversal
Kultur
1 ml dalam eppendorfuntuk ekstraksi DNA
ditanam dalamNA
Stok dalam
Lampiran 3. Skema Ekstraksi Template DNA dengan Metoda
Boil Cell Exstraction (BCE) & Pendeteksian Gen toxR, tdh, dan
trh Bakteri
V. parahaemolyticus
33
Kultur murni
diambil 1 ml disentrifuge 10.000 rpm
selama 5 menit
Endapan
dipindahkan ke dalam eppendorf baru
disentrifuge 14.000 rpm selama 3 menit
Suspensi DNA
Supernatan
Di + 1 ml NaCl 0,85 % steril, vortex
dipanaskan di atas air mendidih selama 5- 10 menit
didinginkan dalam lemari
EndapanSupernatan
Gambar 3. Skema Ekstraksi Template DNA dengan Metoda BoilCell Extraction (BCE)
Lampiran 4. (lanjutan)
34
Template DNA
Template DNA + Campuran komponen
PCR
Elektroforesa pada 100 Volt selama 30 menit
Penampakan pita-pita DNA
dimasukkan ke mesin
PCR
dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel
difoto dengan geldocumentation
Amplifikasi
DNA
direndami dengan 0,5 μg/mlEtidium bromida selama 20-30 menit
Gambar 4. Skema pendeteksian Gen toxR, tdh, trh BakteriV.parahaemolyticus pada sampel ikan baledang (T.
Lepturus)
Lampiran 5. Data Isolasi dan Deteksi gen toxR,tdh dan trh bakteri V.parahaemolyticus
Tabel 1. Data Isolasi dan Deteksi gen toxR, tdh dan trh bakteri V. parahaemolyticus bengan metoda PCR
NO SAMPLING KULTUR CHROMAgarTM Vibrio toxR tdh trh
35
Foto penampakan pita-pita DNA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
I
Vp 90
Vp 91
Vp 92
Vp 93
Vp 94
Vp 95
Vp 96
Vp 97
Vp 98
Vp 99
Vp 100
Vp 101
Vp 102
Vp 103
Vp 104
Vp 105
Vp 106
Vp 107
Vp 108
Vp 109
Vp 110
Vp 111
Vp 112
Vp 113
Vp 114
Vp 115
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
36
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
II
III
IV
Vp 116
Vp 117
Vp 118
Vp 119
Vp 1
Vp 2
Vp 3
Vp 4
Vp 5
Vp 6
Vp 7
Vp 8
Vp 5
Vp 6
Vp 7
Vp 8
Vp 9
√
√
√
√
-
-
-
-
-
√
√
√
√
√
√
√
√
-
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Keterangan :
√ : Koloni ungu pada media
ChromAgar™ Vibrio
Vpn : Kultur V. Parahaemolyticus
pada sampel ke –n
37
+ : Deteksi positif dengan metoda PCR
- : Deteksi negatif dengan metoda PCR
Sampling I : sampel diambil pada tanggal 6
Mei 2010
Sampling II : sampel diambil pada tanggal 2
Agustus 2010
Sampling III : sampel diambil pada tanggal 3
September 2010
Sampling IV : sampel diambil pada tanggal 4
September 2010
Lampiran 6. Dokumentasi Penelitian
38