ISOLASI DAN DETEKSI GEN toxR, tdh, dan trh BAKTERI Vibrioparahaemolyticus PADA IKAN BALEDANG(Trichiurus lepturus, Linn)

DENGAN METODA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)*

Nama : ASRI DIAN

No. BP : 05 931 051

I. PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang Masalah

Sebagian besar wilayah di bumi dikelilingi oleh

lautan, sehingga sumber bahan makanan banyak yang berasal

dari laut. Ikan, kerang-kerangan, cumi dan udang

merupakan beberapa seafood yang cukup digemari karena

rasanya yang lezat dan bergizi tinggi. Hasil laut yang

paling banyak dikonsumsi oleh masyarakat adalah ikan

karena ikan paling mudah diperoleh dan memiliki jenis

yang beragam, seperti ikan baledang (Trichiurus lepturus. Linn)

yang menjadi salah satu komuditas ekspor Indonesia

(Ambarwati, 2008). Ikan baledang sangat mudah dikenali

dari bentuknya yang panjang dan pipih. Ikan ini dikenal

dengan berbagai macam nama lokal yaitu ikan layur (Jawa),

melei (Palabuhanratu), baledang (Padang), lajuru

(sulawesi selatan), romu (Ambon), dan lajur (Madura).

1

Baledang merupakan tipe ikan predator, yang memakan ikan

kecil, udang kecil dan cumi-cumi kecil.

*Sari penelitian ini akan diseminarkan di Fakultas Farmasi

Universitas Andalas, pada :

Hari/Tanggal : Rabu/1 Desember 2010 Jam : 11.00 WIBTempat : Ruang Seminar Fakultas FarmasiPembimbing : 1. Dr. Hj. Marlina, MS, Apt

2. Fithriani Armin, S.Si, M.Si, Apt

Keamanan mengkonsumsi seafood mulai menjadi

perhatian setelah terjadinya wabah foodborne diasease yang

diduga karena infeksi Vibrio parahaemolyticus pada awal tahun

1950 di Jepang, dan semenjak tahun 1996 mulai pandemik di

negara-negara Asia dan Amerika (Wong, 2003; Hara-Kudo,

2003). Menurut Nair et al. (2007), Indonesia termasuk salah

satu wilayah penyebaran kasus pandemik yang disebabkan

oleh bakteri V. parahaemolyticus.

Bakteri V. parahaemolyticus adalah bakteri Gram negatif

berbentuk batang bengkok, anaerob fakultatif dan bersifat

halofilik, yang patogen pada manusia (Wong et al., 1999;

Wong, 2003; Nair, et al., 2007; Sujeewa et al., 2009).

Infeksi dapat terjadi karena mengkonsumsi makanan yang

terkontaminasi oleh bakteri patogen, makanan yang dimasak

2

setengah matang, atau makanan yang dikonsumsi tanpa

dimasak (Lida, et al., 1998; Wong, 2003; Okuda et al.,

1997;), dengan gejala yang ditimbulkan adalah

gastroenteritis yang sifatnya akut.

Bakteri V. parahaemolyticus mempunyai gen spesifik yaitu

toxR. Keberadaan gen ini tidak bersifat patogen terhadap

manusia. Namun V. parahaemolyticus menghasilkankan gen-gen

virulen yang sifatnya patogen yaitu gen tdh yang

bertanggungjawab terhadap produksi toksin berupa

Thermostable Direct Hemolysin (TDH) dan gen trh yang memproduksi

toksin TDH–Related Hemolysin (TRH). Tingkat virulen V.

parahaemolyticus tidak dipengaruhi oleh jumlah V.

parahaemolyticus tersebut, tapi sangat tergantung pada

toksin yang dihasilkan gennya (Wong, 2003; Sujeewa et al.,

2009). Mekanisme patogen V. parahaemolyticus sangat

berhubungan dengan adanya produksi gen tdh dan trh, yang

memberikan respon terhadap β-hemolisis (Marlina, 2008).

Penelitian mengenai adanya gen virulen pada bakteri

V. parahaemolyticus telah dideteksi pada beberapa jenis

seafood diantaranya udang putih (Penaeus mergensis), udang

kelong (Penaeus indicus), pensi (Corbicula moltkiana. Prime) dan

langkitang (Faunus ater) (Marlina, et al., 2007; Mudaris,

3

2009; Azyenela, 2009). Pada penelitian ini dilakukan

deteksi gen toxR dan gen virulen pada ikan baledang dengan

menggunakan metoda PCR. Dengan adanya penelitian ini

diharapkan dapat diperoleh data mengenai keberadaan gen

toxR dan gen virulen bakteri V. parahaemolyticus yang terdapat

pada sampel ikan baledang.

I.2. Perumusan Masalah

Apakah ditemukan kontaminasi bakteri V. parahaemolyticus

pada ikan baledang (T. lepturus)

Apakah ditemukan gen toxR, tdh, trh pada bakteri V.

parahaemolyticus yang terdapat pada ikan baledang (T.

lepturus)

I.3. Tujuan dan Manfaat Penelitian

Tujuan

Mengisolasi dan mendeteksi gen toxR, tdh, dan trh

bakteri V. parahaemolyticus dengan metoda PCR

Manfaat

4

Mengetahui keamanan pangan, khususnya pada ikan

baledang (T. lepturus)

Melengkapi data base untuk penelitian V. parahaemolyticus

Memanfaatkan penggunaan teknik PCR untuk identifikasi

gen bakteri

II. PELAKSANAAN PENELITIAN

2.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang

dan di Laboratorium Mikrobiologi Rumah Sakit M. Djamil

selama enam bulan dari bulan mei sampai bulan oktober

tahun 2010.

2.2 Metoda Penelitian

Penyiapan media

Pembuatan media

Pengambilan sampel ikan baledang

5

Isolasi V. parahaemolyticus dalam media selektif

SPB (Salt Polymixin Broth) dan CHROMAgarTM Vibrio

Peremajaan V. parahaemolyticus dalam media LB Broth

Identifikasi bakteri menggunakan metoda

Polymerase Chain Reaction (PCR).

2.3 Alat dan Bahan

2.3.1 Alat

Mesin PCR (Eppendorf Mastercyclergradient®), tabung

eppendorf, cawan petri, Erlenmeyer, gelas piala, gelas

ukur, batang pengaduk, jarum Ose, kapas, lidi steril,

pipet mikro (Eppendorf®), lampu spritus, hot plate, vortex

(Mixer® VM-1000), timbangan digital, sentrifugator

(Eppendorf Minispin®), incubator (Gallenkamp®), lemari

pendingin, rotary shaker incubator (Bigger Bill Digital®),

laminar air flow (ESCO®), autoklaf (All American®), perangkat

elektroforesa, alumunium foil, dan gel documentation (Bio-

Rad®).

2.3.2 Bahan

6

Sampel ikan baledang (T. lepturus), media Salt Polymixin

Broth (SPB) (”Nissui”®), media CHROMAgarTM Vibrio, media

Luria Burtani Broth, aquadest steril, buffer TBE, agarose

powder, primer (Invitrogen®), Taq polimerase (Promega®), 5x

buffer PCR (Promega®), 2,5 mM dNTP’s (Takara®), ethidium

bromida. Kontol positif tdh (strain no. AQ3815/stock

no.8069 dan strain no. VP81/stock no.8072, Kontrol positif

trh (strain no. AQ4037/stock no.8070, dan kontrol negatif

(strain no. 219/stock no.8073).

2.4 Cara Kerja

2.4.1 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat gelas dibungkus dengan aluminium foil.

Tips mikropipet ukuran kecil, menengah dan besar ditaruh

dalam wadahnya masing-masing sesuai ukurannya, ditutup

rapat dan diberi selotip. Tabung mikrosentrifuge

dimasukkan dalam gelas piala ditutup rapat dengan

alumunium foil. Lidi dimasukkan dalam gelas piala dan

ditutup dengan alumunium foil, lalu semua disterilkan

menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC dengan tekanan 15

lbs selama 15 menit. Sedangkan jarum Ose dan spatel

7

disterilkan dengan cara dibakar pada lampu spritus selama

20 detik setiap kali akan digunakan.

2.4.2 Pengambilan Sampel

Sampel diperoleh dari pedagang ikan baledang (T.

lepturus) di Muaro Padang, kemudian diidentifikasi di

Laboratorium Taksonomi Hewan Jurusan Biologi Fakultas

MIPA. Sampel yang diambil adalah sebanyak 10 gram yang

terdiri dari bagian kepala, perut dan daging ikan, yang

dihancurkan dalam kantung plastik yang bersih.

2.4.3 Penyiapan dan Pembuatan Media

1. Pembuatan media CHROMagarTM vibrio

Serbuk CHROMagarTM vibrio ditimbang sebanyak 74,7 g

dan dilarutkan dalam 1 liter aquadest steril di

dalam Erlenmeyer yang steril, kemudian dipanaskan

hingga terbentuk massa yang homogen dan dididihkan 2

menit, dituang pada cawan petri steril.

2. Pembuatan media modified Salt Polymixin Broth (SPB) .

8

Serbuk SPB ditimbang sebanyak 33 g dan dilarutkan

dalam 1 liter aquadest steril di dalam Erlenmeyer,

kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121º C

dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

3. Pembuatan media Luria Burtani (LB) Broth

Serbuk LB broth ditimbang sebanyak 25 g dan

dilarutkan dalam 1 liter aquadest steril di dalam

Erlenmeyer dengan konsentrasi NaCL 3 %, kemudian

disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121ºC dengan

tekanan 15 lbs selama 15 menit.

4. Pembuatan media Nutrient Agar (NA)

Serbuk NA ditimbang sebanyak 20 g dan dilarutkan

dalam 1 liter aquadest steril di dalam Erlenmeyer

dengan konsentrasi NaCL 3 %, kemudian dipanaskan

sampai homogen dan disterilkan dengan autoklaf pada

suhu 121ºC dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

2.4.4 Isolasi V. parahaemolyticus

Diambil sebanyak 10 gram sampel yang terdiri dari

bagian kepala, perut dan daging ikan baledang yang telah

di hancurkan dalam plastik bersih, kemudian dimasukkan

dalam Erlenmeyer berisi 100 ml SPB yang telah

9

disterilkan, lalu diaduk homogen. Selanjutnya diinkubasi

pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian

dilakukan pengenceran mulai dari 10-1 sampai 10-3 dengan

cara memipet 0,1 ml sampel induk dimasukkan kedalam 0,9

ml media SPB di dalam tabung eppendorf untuk pengenceran

10-1, selanjutnya 0,1 ml dari pengenceran10-1 dimasukkan

kedalam 0,9 ml media SPB di dalam tabung eppendorf untuk

pengenceran 10-2, demikian seterusnya sampai pengenceran

10-3. Setelah itu masing – masing pengenceran bakteri

tersebut dipipet sebanyak 100 µl lalu ditanam pada media

CHROMagarTM vibrio dalam cawan petri, kemudian diinkubasi

pada suhu 37ºC selama 24 jam. Biakan dalam cawan petri

akan memberikan koloni berwarna ungu yang positif

mengandung bakteri V. parahaemolyticus. Diambil 1 Ose koloni

ungu pada cawan petri, lalu dimasukkan pada tabung

mikrosentrifuge yang telah berisi 1 ml LB Broth kemudian

dimasukkan dalam inkubator shaker pada suhu 37 oC

kecepatan 160 rpm selama 24 jam. Biakan ini yang akan

digunakan untuk ekstraksi DNA.

2.4.5 Peremajaan kultur bakteri V. parahaemolyticus

10

Biakan murni V. parahaemolyticus yang disimpan didalam

CHROMagarTM vibrio diambil 1 atau 2 Ose kemudian

diinokulasikan dalam LB Broth, kemudian diinkubasi pada

inkubator shaker pada suhu 37 oC kecepatan 160 rpm selama 24

jam. Untuk penyimpanan jangka panjang sebagai stok,

kultur bakteri ditanam pada agar miring yang berisi

Nutrien Agar (NA).

2.4.6. Deteksi gen V. parahaemolyticus

2.4.6.1 Ekstraksi genom DNA

Ekstraksi genom DNA dilakukan dengan metode Boil Cell

Extraction (BCE). Kultur media LB Broth yang terdapat dalam

tabung eppendorf sebanyak 1 ml disentrifuge pada 10.000

rpm selama 5 menit, lalu supernatan dibuang dan endapan

disuspensikan dalam 1 ml NaCl 0,85 % steril lalu

divortex. Suspensi bakteri tersebut dipanaskan dalam air

mendidih selama 10 menit. Selanjutnya diamkan 10 menit

dalam es dan disentrifuge lagi pada 14.000 rpm selama 3

menit, supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung

eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu

11

-20º C (stock solution). Setelah itu ekstraksi DNA dapat

dideteksi dengan menggunakan mesin PCR.

2.4.6.2 Pengaturan Program Mesin PCR

Komponen-komponen dan campuran yang digunakan :

a. Untuk gen toxR (Kim, Y.B., et al. 1999) :

Pereaksi Jumlah

Pereaksi (μl)Aquadest steril 14,95 x PCR Taq Buffer 5,0Primer 1 1.0Primer 2 1.02,5 mM dNTP’s 2,0Taq Polymerase 0,1DNA Template (Genom DNA) 1.0Volume Total 25 µl

b. Untuk gen tdh dan trh (Tada, J., et al. 1992) :

Pereaksi Jumlah

Pereaksi (μl)Aquadest steril 14,95 x PCR Buffer 5,0Primer 1 1.0Primer 2 1.0

12

2,5 mM dNTP’s 2.0Taq Polymerase 0,1DNA Template (Genom DNA) 1.0Volume Total 25 µl

Keterangan :

Primer Untuk gen toxR :

Primer 1 (toxR 4) : 5’ - GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3’

Primer 2 (toxR 7) : 5’ -

ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3’

Primer Untuk gen tdh :

Primer 1 (tdh-D3= VPD2) : 5’-

CCACTACCACTCTCATATGC-3’

Primer 2 (tdh-D5= VPD1) : 5’-

GGCATCAAATGGCTGATACT-3’

Primer Untuk gen trh :

Primer 1 (trh 2) : 5’- GGCTCAAAATGGTTAAGCG-3’

Primer 2 (trh 6) : 5’- CATTTCCGCTCTCATATGC-3’

13

Masukkan tiap-tiap komponen ke dalam tabung eppendorf

yang berisi genom DNA, homogenkan dan masukkan ke mesin

PCR yang telah dibuat program kerjanya.

Tahapan Kerja Mesin PCR :

a. Untuk deteksi gen toxR ( 23 siklus ) sbb:Tahapan Dalam Siklus Temperatur/

WaktuPradenaturasi 94o C ( 5 menit

)Denaturasi 94o C ( 1 menit

)Annealing (Pengikatan) 63o C ( 1,5

menit )Extension

(Pemanjangan)

72o C ( 1,5

menit )Elongation

(PemanjanganAkhir)

72o C ( 7 menit

)

b. Untuk deteksi gen tdh dan trh ( 33 siklus ) sbb:Tahapan Dalam Siklus Temperatur/

WaktuPradenaturasi 94o C (1

menit )Denaturasi 94o C ( 1 menit

)

14

Annealing (Pengikatan) 55o C ( 1 menit

)Extension

(Pemanjangan)

72o C ( 1 menit

)Elongation

(PemanjanganAkhir)

72o C ( 7 menit

)

2.4.7. Elektroforesa untuk gen toxR, tdh, dan trh

Elektroforesa dilakukan dengan menggunakan gel

agarose 1,5 %. Elektroforesa menggunakan TBE 1 x pada

tegangan 100 Volt selama 30 menit. Kemudian gel direndam

dengan 1 μL larutan ethidium bromida selama 15 menit.

Selanjutnya dilihat gambarnya dengan alat gel documentation.

Pada hasil foto dari alat gel documentation dapat dilihat

pola pemisahan pita-pita DNA yang ukurannya diketahui

melalui perbandingan dengan ukuran pita-pita standar 100

bp DNA ladder, dimana ukuran pita-pita DNA V. parahaemolyticus

untuk gen toxR adalah 368-bp, untuk gen tdh adalah 251-bp,

dan untuk gen trh adalah 250-bp (Kim, Y.B., et al. 1999;

Marlina, 2008; Sujewa, 2008; Tada, J., et al. 1992).

2.5. Analisa Data

15

Data yang diperoleh disajikan secara deskriptif.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

16

4.1. Hasil

Setelah dilakukan penelitian diperoleh hasil sebagai

berikut :

1. Dari isolasi terhadap sampel ikan baledang (T.

lepturus) yang diperoleh dari Muaro Padang,

menunjukkan adanya bakteri Vibrio parahaemolyticus yang

ditandai dengan adannya koloni bakteri berwarna ungu

pada media selektif CHROMAgarTM Vibrio (Gambar 6,

Lampiran 6). Jumlah koloni ungu bakteri yang

diperoleh dari 4 kali sampling adalah sebanyak 38

koloni. Pada sampling pertama diperoleh sebanyak 30

koloni, pada sampling kedua tidak diperoleh satu pun

koloni bakteri yang berwarna ungu, sampling ketiga

diperoleh 1 koloni, dan sampling keempat 7 koloni

(Tabel 1, Lampiran 5)

2. Hasil deteksi gen terhadap 38 kultur bakteri

menggunakan elektroforesa dengan metoda PCR

(Polimerase Chain Reaction) diperoleh 27 kultur bakteri

yang positif memiliki gen toxR, dan tidak satupun

yang terdeteksi gen tdh dan trh (Tabel 1, Lampiran

5).

17

2.2. Pembahasan

Keberadaan mikroorganisme dalam makanan memegang

peranan penting dalam pembentukan toksin atau senyawa

yang menyebabkan makanan menjadi tidak layak

dikonsumsi dan menimbulkan bahaya bagi yang

mengkonsumsinya. Kondisi ini dinamakan dengan

keracunan makanan. WHO mendefinisikannya sebagai

foodborne diasease, yaitu penyakit yang umumnya bersifat

infeksi atau racun yang masuk ke dalam tubuh melalui

makanan yang dicerna. Salah satu bakteri yang

mengkontaminasi makanan yang berasal dari laut dan

18

menyebabkan keracunan makanan adalah bakteri V.

parahaemolyticus.

Pada penelitian ini isolasi dan deteksi bakteri V.

parahaemolyticus dari sampel ikan baledang (T. lepturus)

dilakukan di Muaro Padang sebanyak empat kali

sampling. Isolasi dilakukan dengan menginokulasi

sampel sebanyak 10 gram dalam 100 ml media pengaya.

Media yang digunakan untuk inokulasi adalah media

selektif Salt Polymixin Broth (SPB) yang ditambah dengan 3%

NaCl untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri halofilik

Vibrio sp yang optimal. Media SPB mengandung antibiotika

Polymixin B dimana bakteri V. parahaemolyticus telah

resisten terhadap antibiotika ini, sehingga

pertumbuhannya akan tetap berlangsung sedangkan

bakteri gram negatif lain akan mati.

Isolasi dilakukan dalam 3 variasi pengenceran yaitu

10-1, 10-2, dan 10-3, secara direct plating pada media

CHROMAgarTM Vibrio yang selektif terhadap bakteri V.

parahaemolyticus. Media CHROMAgarTM Vibrio mengandung

subsrat untuk aktivasi enzim β-galaktosidase yang

dengan adanya senyawa kromogenik menghasilkan koloni

berwarna biru untuk koloni Vibrio cholerae, warna putih

19

untuk Vibrio alginolyticus dan warna ungu untuk V.

parahaemolyticus (http:/chromagar.com/products Vibrio, 2003).

Bila di dalam satu cawan perti tumbuh koloni bakteri

yang berwarna biru, putih dan juga ungu maka

diperlukan penanaman kembali pada media CHROMAgarTM

Vibrio yang baru dengan tujuan untuk memisahkan koloni

ungu menjadi koloni-koloni tunggal yang selanjutnya

dapat digunakan sebagai kultur murni untuk pengujian

dengan metoda PCR.

Kultur murni dari bakteri V.parahaemolyticus ini

diekstraksi dengan metoda Boil Cell Extraction (BCE). Metoda

ini dipilih karena lebih mudah dan efisien

dibandingkan dengan metoda Phenol Chloroform Isoaminalcohol

(PCI) DNA Extraction. Pada metoda PCI DNA Extraction

diperlukan biaya yang relatif lebih mahal, membutuhkan

waktu yang lama, dan kerja yang lebih teliti. Hasil

BCE nantinya akan di amplifikasi PCR bersamaan dengan

komponen PCR. Untuk kontrol positif juga harus di

amplifikasi bersama dengan sampel. Komponen PCR untuk

deteksi gen toxR, tdh, dan trh pada bakteri V. parahaemolyticus

dalam penelitian ini mengikuti prosedur menurut Kim, et

al.,(1999) dan Tada, et al.,(1992).

20

Metoda PCR adalah metoda analisa molekular yang

sangat sensitif untuk mengidentifikasi gen target pada

bakteri. Metoda PCR adalah suatu teknik in vitro untuk

penggandaan DNA secara enzimatis, berdasarkan pada

kesesuaian antara primer dengan template DNA gen target.

Penggandaan gen target berlangsung dalam 5 tahapan

siklus. Tiap siklus terdiri dari proses predenaturasi,

denaturasi, annealing (pengikatan), extension

(pemanjangan), dan elongation (pemanjangan akhir)

( Sambrook & Russel, 2001).

Proses yang terjadi pada mesin PCR adalah denaturasi

DNA dengan suhu yang tinggi (94 oC) sehingga rantai DNA

yang berupa rantai ganda yang berpilin akan berpisah

menjadi helaian tunggal. Gen target terputus menjadi

dua buah helaian tunggal yaitu rantai basa nukleotida

1 yang diikat oleh primer 1 (toxR 4) dari arah 3′ (tiga

aksen) ke 5′ (lima aksen) dan rantai basa nukleotida 2

diikat oleh primer 2 (toxR7) dari arah 3′ ke 5′ juga.

Dengan adanya enzim Taq Polymerase dan dNTP's (d-ATP, d-

CTP, d-GTP, d-TTP) sebagai suplai nukleotida, primer

yang tersusun dari lebih kurang 13 basa nukleotida

akan diperpanjang sehingga jumlahnya sama dengan

21

rantai basa nukleotida 1 dan 2 membentuk dua buah gen

yang sempurna.

Setelah proses amplifikasi menggunakan mesin PCR

selesai, DNA yang telah mengalami penggandaan

dideteksi untuk melihat adanya gen toxR, tdh, dan trh.

Keberadaan gen-gen tersebut dideteksi menggunakan

alat elektroforesa dengan melihat pola pemisahan DNA

yang dibandingkan dengan kontrol positif.

Elektoforesa dilakukan pada gel agarose 1,5 %

menggunakan TBE (Tris Base Acid EDTA) 1x pada tegangan

100 volt selama 30 menit untuk mendorong pergerakan

DNA dalam larutan elektrolit (TBE). Pewarnaan gel

setelah elektroforesa dilakukan dengan cara perendaman

gel didalam 1 µg/ml larutan ethidium bromida selama 10

menit supaya pita DNA terlihat saat difoto dengan alat

gel documentation.

Gen toxR merupakan gen global yang ikut berperan

dalam sintesa toksin pada bakteri dari genus Vibrio. Gen

ini pertama kali ditemukan pada bakteri Vibrio cholerae

tetapi kemudian ditemukan juga pada beberapa spesies

bakteri lainnya dari genus Vibrio, antara lain Vibrio

vulnificus dan Vibrio parahaemolyticus (Provenzano, 2000).

22

Perbedaannya adalah pada susunan basa nukleotida dari

gen toxR yang terdapat pada V. cholerae berbeda dengan gen

toxR yang terdapat pada V. parahaemolyticus. Hemolisin yang

telah diisolasi dari V. parahaemolyticus yaitu TDH

(thermostable direct hemolysine), dan TRH

(thermostable direct hemolysine-related hemolysine).

Hemolisin ini merupakan faktor virulen penting yang

terdapat pada V. parahaemolyticus.

Hasil deteksi gen menunjukkan bahwa pada sampel ikan

baledang (T.lepturus) terdapat bakteri V. parahaemolyticus.

Ini ditunjukkan dari 38 kultur yang dideteksi terdapat

27 kultur positif toxR (71%). Dari 27 kultur yang

positif toxR tersebut tidak ada satu pun yang

terdeteksi gen virulen tdh dan trh. Tidak terdeteksi

adanya gen virulen ini adalah karena keberadaan

bakteri V.parahaemolyticus di lingkungan memang sangat

kecil yaitu 1-2 % (Dileep, 2003). Ini berarti sampel

yang terkontaminasi oleh bakteri V.parahaemolyticus pada

penelitian ini termasuk non-patogen atau bersifat

Kanagawa Negatif (Kim, 1999; Hara-kudo, 2003).

23

Dari hasil juga terlihat perbedaan jumlah gen toxR

yang terdeteksi dari sampel yang diambil pada bulan

Mei dengan sampel yang diambil pada bulan Agustus dan

September. Dimana sampling pertama (bulan Mei) yang

dilakukan saat musim panas dengan curah hujan yang

rendah terdeteksi keberadaan gen toxR sebanyak 71%,

sementara sampling berikutnya (bulan Agustus dan

September) yang dilakukan pada musim panas yang curah

hujannya cukup tinggi tidak terdeteksi adanya gen toxR.

Pada beberapa penelitian, terjadinya outbreaks yang

disebabkan oleh bakteri V. parahaemolyticus memang banyak

terjadi pada musim-musim panas (Cabrera-Garcia, et.al,

2004; Charles-Hernandez, et.al, 2005; Laohaprertthisan,

et.al, 2003). Hasil penelitian ini diharapkan sebagai

informasi pada masyarakat agar selalu mengolah bahan

makanan yang berasal dari laut dengan memasak

sempurna.

24

V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian dapat diambil kesimpulan bahwa

pada sampel ikan baledang (T. lepturus) yang diperoleh dari

Muaro kota Padang, Sumatera Barat terdapat bakteri V.

parahaemolyticus. Dan dari 38 kultur bakteri V.

parahaemolyticus yang dideteksi memberikan hasil 27 kultur

positif gen toxR, dan tidak satupun kultur yang positif

gen tdh dan gen trh.

5.2 Saran

Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk

melakukan identifikasi jenis Vibrio lain seperti Vibrio

alginolyticus, Vibrio fulmyticus, dan Vibrio cholera dengan metode

PCR pada sampel T.lepturus.

25

DAFTAR PUSTAKA

Ambarwati,D.V.S. 2008.Studi Biologi reproduksi Ikan layur(Superfamili trichiuroidea) di perairan Palabuhanratu, Kabupaten Sukabumi,Jawa Barat. Skripsi Fakultas Perikanan dan Ilmu KelautanInstitut pertanian Bogor: Bogor.

Azyenela, L. 2009. Deteksi Gen Virulen Bakteri Vibrioparahaemolyticus Dari sample Pensi (Corbicula moltkiana. Prime) DanLangkitang (Faunus ater) Dengan Metoda Polymerase Chain Reaction (PCR).Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Andalas : padang.

Ansaruzzaman, M. et al. 2005. Pandemic serovars(O3:K6 and O4:K68) of Vibrio parahaemolyticus Associated withDiarrhea in Mozambique:Spread of the Pandemic into theAfrican Continent. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 43.No.6. p2559-2562.

Cabrera-Garcı´a, M.E, Carlos Va´zquez-Salinas, &Elsa Irma Quin˜ones-Ramırez. 2004. Serologic andMolecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus StrainsIsolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of

26

Mexico. Applied And Environmental Microbiology, Vol. 70. No. 11.P. 6401-6406.

Charles-Hernández, G.L., MSc, Enrique Cifuentes,Stephen J. Rothenberg. 2005. Environmental factorsassociated with the presence of Vibrio parahaemolyticus in seaproducts and the risk of food poisoning in communitiesbordering the Gulf of Mexico . Journal of Environmental HealthResearch. Vol. 5 issue 2: 75-80.

CHROMAgarTM, “CHROMAgarTM Vibrio”,http:/chromagar.com/products Vibrio, 2003.

Dileep V, Kumar, H.S., Kumar, Y., Nishibuchi, M.,Karunasagar, I., & Karunasagar, I. 2003. Application ofpolymerase chain reaction for detection of Vibrioparahaemolyticus associated with tropical seafoods andcoastal environment. Letters in Applied Microbiology. 36; 423-427.

Hara-Kudo,Y et al. 2003. Prevalence of PandemicThermostable Direct Hemolysin-Producing Vibrioparahaemolyticus O3:K6 in Seafood and the CoastalEnvironment in Japan. Applied and Environmental Microbiology.Vol. 69, No. 7. p3883–3891.

Kim, Y.B., Okuda, J., Matsumoto, C., Takahashi, N.,Hashimoto, S & Nishibuchi, M. 1999. Identification ofVibrio parahaemolyticus Strains at the Species Level by PCRTargeted to the toxR Gene. Journal Of Clinical Microbiology. 37 (4)1173-1177.

Laohaprertthisan, V., A. Chowdhury., U. Kongmuang.,S. Kalnauwakuli., M. Ishibashi., C. Matsumoto., & M.Nishibuchi. 2003. Prevalence and serodiversity of thepandemic clone among the clinical strains of Vibrioparahaemolyticus isolated in southern Thailand.Epidemiol.Infect. 130.395–406.

Lida,T., Kwon-Sam,P., Orasa,S., Junji,K.,Yoshiharu,Y., Koichiro,Y and Takeshi,H. 1998. Close

27

proximity of the tdh, trh and use genes on the chromosome ofVibrio parahaemolyticus. Department of Bacterial Infections, ResearchInstitute for Microbial Diseases, Osaka University, 3-1 Yamadaoka,Suita, Osaka 565, Japan.

Marlina. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrioparahaemolitycus Dengan Metoda Biolog dan Deteksi Gen ToxRnya Secara PCR. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, Vol. 13, No.1.

Marlina., Son Radu., C. Yoke Kqueen., Suhaimi,N.,Zunita,Z., Sahilah Abd Mutalib and Mitsuaki,N. 2007.Detection of tdh And trh Genes In Vibrio parahaemolyticusIsolated From Corbicula moltkiana Prime In West Sumatra,Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health, Vol 3, No. 2,Hal 349-355.

Mudaris, F. 2009. Isolasi dan Deteksi Vibrio parahaemolyticusPada Udang Putih (Penaeus merguensis) dan Udang Kelong (Penaeusindicus) Dengan Metoda PCR. Skripsi Fakultas farmasiUniversitas Andalas : Padang.

Nair, G. Balakrish., Thandavarayan,R., Sujit K,Bhattacharya., Basabjit,D., Yoshifumi,T., and David A,Sack. 2007. Global Dissemination of Vibrio parahaemolyticusSerotype O3:K6 and Its Serovariants. Clinical MicrobiologyReviews, Vol. 20, No. 1.

Okuda, J., Masanori,I., S. L. Abbott., M. Janda.,and M. Nishibuchi. 1997. Analysis of the ThermostableDirect Hemolysin (tdh) Gene and the tdh-Related Hemolysin(trh) Genes in Urease-Positive Strains of Vibrioparahaemolyticus Isolated on the West Coast of the UnitedStates. Journal of Clinical Microbiology, p. 1965–1971, Vol. 35, No.8.

Provenzano,D., Darren .A, Schuhmacher., Justin. L,Barker and Karl. E, Klose. 2000. The Virulence RegulatoryProtein ToxR Mediates Enhanced Bile Resistance in Vibrio

28

cholerae and Other Pathogenic Vibrio Species. Infection andImmunity, p. 1491–1497,Vol 68, No. 3.

Sambrook J. & Russel D.W. 2001. Molecular Cloning ALaboratory Manual. Volume 1. Third edition. CSHL Press. NewYork.

Sujeewa.A.K.W, Norrakiah, A. S. and Laina, M. 2009.Prevalence of toxic genes of Vibrio parahaemolyticus inshrimps (Penaeus monodon) and culture environment.International Food Research Journal 16: 89-95.

Tada , J. et al. 1992. Detection of the thermostabledirect hemolysin gene (tdh) and the thermostable directhemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrioparahaemolyticus by polymerase chain reaction. Molecular andCellular probes. 6.477-487.

Wong, Hin-Chung. 2003. Detecting and MolecularTyping of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Food and Drug Analysis,Vol. 11, No. 2, Pages.

Wong, Hin-Chung., Shu-Hui Liu., Lee-Wen Ku., I-YingLee., Tien-Kuei Wang., Yeong-Sheng Lee., Chih-Lung Lee.,Li-Ping Kuo and D. Yang-Chih Shih. 1999. Characterizationof Vibrio parahaemolyticus isolates obtained from FoodPoisoning Outbreaks during 1992-1995 in Taiwan. Departmentof Microbiology, Soochow University, Taipei, Taiwan 111,Republic of China.

29

Lampiran 1. Skema Isolasi Vibrio parahaemolyticus

Dihomogenkan diinkubasi pada suhu 37 oC

selama 24 jam

dilakukan pengenceran sbb :

30

10 g sampel ad 100 mlSPB

0,1ml 0,1ml 0,1ml

Larutan induk 0,9 ml SPB 0,9 ml SPB 0,9 ml SPB

(10-1) (10-2) (10-3)

0,1ml 0,1 ml 0,1 ml

CHROMAgar™ Vibrio

Gambar 1. Isolasi Vibrio parahaemolyticus pada Sampel ikan baledang (Trichiurus lepturus)

Lampiran 2. (lanjutan)

31

Semua Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 oC ± 24jam

Koloni ungu

Koloniungu

1 koloni tunggal

diinkubasi pada inkubator

shaker pada suhu 37oC, 24

jam,160 rpm

Gambar 2. Skema Pemurnian Kultur Bakteri V.

Parahaemolyticus yang ditanam pada media NA

32

ditanam pd LB Broth dalam botoluniversal

Kultur

1 ml dalam eppendorfuntuk ekstraksi DNA

ditanam dalamNA

Stok dalam

Lampiran 3. Skema Ekstraksi Template DNA dengan Metoda

Boil Cell Exstraction (BCE) & Pendeteksian Gen toxR, tdh, dan

trh Bakteri

V. parahaemolyticus

33

Kultur murni

diambil 1 ml disentrifuge 10.000 rpm

selama 5 menit

Endapan

dipindahkan ke dalam eppendorf baru

disentrifuge 14.000 rpm selama 3 menit

Suspensi DNA

Supernatan

Di + 1 ml NaCl 0,85 % steril, vortex

dipanaskan di atas air mendidih selama 5- 10 menit

didinginkan dalam lemari

EndapanSupernatan

Gambar 3. Skema Ekstraksi Template DNA dengan Metoda BoilCell Extraction (BCE)

Lampiran 4. (lanjutan)

34

Template DNA

Template DNA + Campuran komponen

PCR

Elektroforesa pada 100 Volt selama 30 menit

Penampakan pita-pita DNA

dimasukkan ke mesin

PCR

dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel

difoto dengan geldocumentation

Amplifikasi

DNA

direndami dengan 0,5 μg/mlEtidium bromida selama 20-30 menit

Gambar 4. Skema pendeteksian Gen toxR, tdh, trh BakteriV.parahaemolyticus pada sampel ikan baledang (T.

Lepturus)

Lampiran 5. Data Isolasi dan Deteksi gen toxR,tdh dan trh bakteri V.parahaemolyticus

Tabel 1. Data Isolasi dan Deteksi gen toxR, tdh dan trh bakteri V. parahaemolyticus bengan metoda PCR

NO SAMPLING KULTUR CHROMAgarTM Vibrio toxR tdh trh

35

Foto penampakan pita-pita DNA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

I

Vp 90

Vp 91

Vp 92

Vp 93

Vp 94

Vp 95

Vp 96

Vp 97

Vp 98

Vp 99

Vp 100

Vp 101

Vp 102

Vp 103

Vp 104

Vp 105

Vp 106

Vp 107

Vp 108

Vp 109

Vp 110

Vp 111

Vp 112

Vp 113

Vp 114

Vp 115

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

√

+

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

36

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

II

III

IV

Vp 116

Vp 117

Vp 118

Vp 119

Vp 1

Vp 2

Vp 3

Vp 4

Vp 5

Vp 6

Vp 7

Vp 8

Vp 5

Vp 6

Vp 7

Vp 8

Vp 9

√

√

√

√

-

-

-

-

-

√

√

√

√

√

√

√

√

-

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Keterangan :

√ : Koloni ungu pada media

ChromAgar™ Vibrio

Vpn : Kultur V. Parahaemolyticus

pada sampel ke –n

37

+ : Deteksi positif dengan metoda PCR

- : Deteksi negatif dengan metoda PCR

Sampling I : sampel diambil pada tanggal 6

Mei 2010

Sampling II : sampel diambil pada tanggal 2

Agustus 2010

Sampling III : sampel diambil pada tanggal 3

September 2010

Sampling IV : sampel diambil pada tanggal 4

September 2010

Lampiran 6. Dokumentasi Penelitian

38

Gambar 5. Foto sampel ikan baledang (T. Lepturus)

Lampiran 6. (lanjutan)

39

Gambat 6. Foto Pertumbuhan V. parahaemolyticus SampelT. lepturus pada Media CHROMAgarTM Vibrio

40

Lampiran 6, (Lanjutan)

Gambar 8. Foto elektroforesa

41