ANTECEDENTES

Algunos de los residuos generados por las actividades de laindustria petrolera son depositados en tambores, patios y fosasrústicas, previo a su tratamiento y disposición final en sitiosautorizados. De acuerdo a la información de PEMEX, dos de loslugares más contaminados por hidrocarburos a nivel nacional son larefinería "Lázaro Cárdenas" y el Pantano de Santa Alejandrina,ambos ubicados en el sureste de México (Veracruz y Tabasco),algunos de estos suelos contaminados, contienen concentraciones dehidrocarburos hasta de 450,000 mg/kg (Centro Nacional deInvestigación y Capacitación Ambiental, CENICA 2002).

NOM-021-SEMARNAT-2000, Que establece las especificaciones de

fertilidad, salinidad y clasificación de suelos, nos indica que

los niveles para hidrocarburos son los siguientes:

Límites máximos permisibles para hidrocarburos específicos en

suelo

HIDROCARBUROS

ESPECÍFICOS

USO DE SUELO PREDOMINANTE

(mg/kg BASE SECA)MÉTODO ANALÍTICO

Agrícola,

forestal,

pecuario y

de

conservaci

ón

Residenci

al y

recreativ

o

Industr

ial y

comerci

al

Benceno 6 6 15 NMX-AA-141-SCFI-2007

Tolueno 40 40 100 NMX-AA-141-SCFI-2007

Etilbenceno 10 10 25 NMX-AA-141-SCFI-2007

Xilenos (suma de 40 40 100 NMX-AA-141-SCFI-2007

isómeros)

Benzo[a]pireno 2 2 10 NMX-AA-146-SCFI-2008

Dibenzo[a,h ]antr

aceno

2 2 10 NMX-AA-146-SCFI-2008

Benzo[ a ]antrace

no

2 2 10 NMX-AA-146-SCFI-2008

Benzo[b]fluorante

no

2 2 10 NMX-AA-146-SCFI-2008

Benzo[k]fluorante

no

8 8 80 NMX-AA-146-SCFI-2008

Indeno (1,2,3-

cd)pireno

2 2 10 NMX-AA-146-SCFI-2008

Para usos de suelo mixto deberá aplicarse el límite máximopermisible más estricto, para los usos de suelo involucrados.Los tipos de intervención en la aplicación de la tecnología de labiorremediación pueden ser “in situ”, cuando el tratamiento delsuelo se realiza sin excavar, y “ex situ” cuando se lleva a cabola excavación del suelo. Cuando este suelo excavado se trata en elmismo emplazamiento le llamaríamos “onsite” y si se lleva a unaplanta de tratamiento “off site”.

Las tecnologías existentes se agrupan en dos modalidades: labiorremediación intrínseca o atenuación natural monitorizada y labiorremediación dirigida. La primera modalidad, está basada en losprocesos físicos, químicos y biológicos que conducen a ladisminución de la concentración de los contaminantes presentes deforma natural sin ninguna intervención exterior. En este caso sellevará a cabo un seguimiento del proceso que permita constatarque se está produciendo una disminución de la contaminación. Labiorremediación dirigida consiste en provocar una bioestimulaciónde las poblaciones microbianas indígenas. ¿Pero a qué nosreferimos cuando hablamos de bioestimulación. Aquí debemos

recordar lo enunciado anteriormente en relación a los factores quecondicionan la biodegradación microbiana de los hidrocarburos.Suministro de oxígeno, mantenimiento de la humedad óptima,garantizar la presencia de las cantidades necesarias de N y P yque los contaminantes estén mayoritariamente biodisponibles, seránlas principales acciones que podemos llevar a cabo en función delos resultados obtenidos en los ensayos de tratabilidad.

Sin embargo, en algunos emplazamientos con contaminación recientelas poblaciones presentes en el emplazamiento o no estáncapacitadas para metabolizar el contaminante o están en unaproporción tan baja que no responden a los bioestimulantes. Enestos casos, se hace necesario la inoculación o siembra demicroorganismos que haremos crecer en el laboratorio. Cuando seutiliza esta estrategia, hablamos de biorrefuerzo. Estos inóculos,pueden estar formados por cepas puras o cultivos mixtos demicroorganismos (consorcios) que pueden ser de diseño o naturales.Sin embargo, tal como hemos mencionado anteriormente, en el casode la contaminación por hidrocarburos, dada la presenciamayoritaria de microorganismos degradadores de hidrocarburos, lainoculación de microorganismos de laboratorio no suele mejorar labiodegradación alcanzada por los microorganismos del propioemplazamiento (Sabaté et al., 2004; Viñas et al., 2005). Existen distintas tecnologías de biorremediación para la zona nosaturada de un suelo. Cuando no se lleva a cabo la excavación delsuelo se aplica la estrategia denominada de bioventeo (bioventing)basado en el suministro de aire u oxígeno acompañado o no delsuministro de nutrientes u otros agentes bioestimulantes mediantepozos y rasas. Cuando se lleva a cabo la excavación del suelo, latecnología es la biopila, la cual puede ser estática o dinámicasegún sea la tecnología empleada para suministrar el oxígeno. Encuanto a estrategias microbiológicas se puede optar por un procesode degradación aeróbico mesófilo o por el compostaje. Parapequeñas cantidades de suelo se puede optar por el sueloresuspendido en medio líquido en biorreactores.

PLANTAMIENTO DEL PROBLEMA

Este proyecto tiene como finalidad reducir los niveles de bencenoy otros contaminantes que se encuentran en suelos contaminados porderrames de petróleo y/o sus derivados, ubicado a los alrededoresde la petroquímica cangrejera ya que afectan de manera directa ala población cercana provocando daños a la salud y a la sociedaden general.

La reducción de este hidrocarburo se efectuara por medio detécnicas de biorremediación y utilizando bacterias degradadorasaisladas del suelo.

Se propondrán medidas preventivas para evitar una futuracontaminación por benceno ya que de ese modo se evitaríanaccidentes y daños al medio ambiente.

HIPOTESIS

La aplicación de técnicas de Biorremediación logra reducirnotablemente la contaminación en suelos.

La aplicación de bacterias es la óptima para tratamiento desuelos.

Las bacterias del género Pseudomonas son las más eficientesdegradando hidrocarburos.

JUSTIFICACION

Actualmente la contaminación que hay en el ambiente, yprincipalmente en el suelo es muy elevada. Poe esa razón se estáhaciendo todo lo posible no solo a nivel nacional, sino también anivel mundial para que se disminuya la concentración dehidrocarburos y sus derivados en el ambiente.

La contaminación se debe principalmente a que se está dando unasobre-explotación de la materia prima, los constantes descuidos delas empresas respecto al manejo de sus productos ya que existenmuchas tomas clandestinas, en las cuales personas que no prevén

las consecuencias derraman estos productos sobre el suelo haciendoque este pierda sus características y se eliminen todo los seresvivos presentes.

La solución a estos problemas de contaminación será de altoimpacto a nivel ambiental, ya que se rescataran muchas zonasdañadas a lo largo del país y se evitara en todo momento lapérdida de más áreas ecológicas.

Nos enfocamos en el sur de Veracruz, donde la contaminación porhidrocarburoses de gran consideración ya que en esta zona seencuentran cinco petroquímicas, y dentro de ellas se encuentra lade Cangrejera ubicada en la carretera Coatzacoalcos-Nuevo Teapa-Villahermosa, junto al complejo industrial de Pajaritos.

La producción de este complejo se basa primordialmente enaromáticos y derivados dentro de los cuales se encuentra elbenceno. El benceno se degrada más lentamente en el agua y elsuelo, es poco soluble en agua y puede pasar a través del suelohacia el agua subterránea. El benceno puede entrar al cuerpo através de los pulmones, el tubo digestivo y la piel. La ingestiónde alimentos o bebidas que contienen niveles altos de bencenopuede producir vómitos, irritación del estómago, mareo,somnolencia, convulsiones, aceleración del latido del corazón,coma y la muerte. Los efectos del consumo de alimentos o líquidosque contienen niveles bajos de benceno no se conocen. Si sederrama benceno sobre la piel, puede sufrir enrojecimiento yulceración. El contacto de benceno con los ojos puede causarirritación y daño de la córnea.

OBJETIVO GENERAL

Reducción del benceno en los suelos cercanos al complejopetroquímico cangrejera por medio de técnicas de biorremediación.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Aislamiento de las bacterias del suelo contaminado en estaárea.

Identificación y selección de la mejor bacteria degradadorade hidrocarburos.

Determinación de la mejor técnica para la biorremediación.

MARCO TEORICO

El acelerado incremento en la población mundial, ha dado comoresultado la demanda de mayores cantidades de combustibles fósiles(hidrocarburos). Aunque muchos de estos compuestos se utilizanpara generar energía, un alto porcentaje se libera al ambiente,por cuestiones de extracción, refinado, transporte yalmacenamiento, lo cual representa un riesgo potencial para losecosistemas (Semple y col., 2001). Aunado a lo anterior, durantelos años 50s y 60s, se instalaron a nivel mundial cientos de milesde tanques para el almacenamiento de productos del petróleo yquímicos peligrosos. Muchos de ellos, se abandonaron o excedieronsu vida útil, por lo que hoy en día representan una fuente decontaminación de suelos, acuíferos, ríos, lagos y mares (Fan yKrishnamurthy, 1995). En México existen extensas áreascontaminadas con hidrocarburos del petróleo (HTPs), por lo cualhoy en día una de las mayores preocupaciones de las autoridadesambientales es encontrar y/o desarrollar tecnologías que permitanla eliminación de este tipo de contaminantes.

En diferentes países del mundo, la contaminación de suelosgeneralmente se ha tratado de solucionar con el uso de procesosfisicoquímicos, que son altamente eficientes para eliminar altasconcentraciones de contaminantes. Sin embargo, cuando se tratanbajas concentraciones de contaminantes, estos procesos son pocofactibles debido a sus costos de operación (Riser-Roberts, 1998).

El uso de métodos biológicos (biorremediación) para el tratamientode sitios contaminados, es una tecnología que representa variasventajas con respecto a los métodos físicos y químicostradicionales. De acuerdo con estudios realizados en los EE.UU. yReino Unido, el mercado de la biorremediación de suelos se haincrementado debido a que los costos pueden reducirse entre 65 y80%, con respecto a los métodos fisicoquímicos (Zechendorf, 1999)

Benceno.

El benceno se aisló por primera vez en 1825 por Michael Faradaypor condensación de una mezcla aceitosa obtenida del gas delalumbrado. La fórmula empírica del nuevo compuesto era CH. Lasíntesis de este compuesto se consiguió en 1834 por EilhardMistscherlich al calentar ácido benzoico, aislado de la goma debenjuí, en presencia de cal. En inglés benjuí es benzoin y como elnuevo compuesto derivaba de la goma de benjuí, que es una resinabalsámica obtenida de varias especies de styrax, una especievegetal que se encuentra en la India, al nuevo compuesto se ledenominó en inglés benzene.

En la última parte del siglo XIX se descubrieron muchos otroscompuestos que parecían estar relacionados con el benceno. Puestenían bajas relaciones hidrógeno/carbono y aromas agradables,razón por la cual se denominó a este grupo de compuestos comohidrocarburos aromáticos. El término aromático se aplica en laactualidad a una serie de compuestos cuya estabilidad yreactividad es semejante a la del benceno, independientemente desu olor.

La estructura del benceno.

La primera estructura para el benceno fue propuesta por el químicoalemán Friedrich August Kekulé von Stradonitz (1829-1896) en 1865y consistía en una mezcla en equilibrio de dos ciclohexatrienos,formados con enlaces sencillos y dobles alternados.

En la estructura de Kekulé los enlaces sencillos serían más largos(1.47 Å) que los enlaces dobles (1.33 Å). Cuando se desarrollaronlos métodos físicos de determinación estructural y se pudo medirla distancia de enlace C-C del benceno se encontró que todas lasdistancias eran iguales y median 1.39 Å, que es un promedio entre

la distancia de un enlace doble (1.33 Å) y un enlace simple (1.47Å).

Aparte de las características físicas del benceno, que no resultanexplicadas porlas estructuras de 1,3,5-ciclohexatrieno, existenuna serie de propiedades químicas del benceno que tampoco resultanexplicadas por las estructuras de enlaces dobles alternados quepropuso Kekulé. Por ejemplo, el benceno no reacciona con halógenos(X2,X=Cl, Br, I) o con haluros de hidrógeno (HX, X=Cl, Br, I) comolo haría un compuesto poliénico (véase tema 8). Además, lahidrogenación del benceno es mucho más lenta quela de los alquenosy requiere condiciones muy drásticas: alta presión de hidrógeno yempleo de catalizadores muy activos.

El benceno es, en comparación con los alquenos y los polienos, uncompuesto más estable y la estructura del 1,3,5-ciclohexatrieno nopuede explicar esta estabilidad adicional.

La remarcable estabilidad del benceno se puede explicar si seadmite la deslocalización de la densidad electrónica asociada alos orbitales p. Las estructuras resonantes se diferencian en ladistribución de la densidad electrónica pero no en la posiciónrelativa de los átomos que las integran. En realidad el benceno esun híbrido de resonancia cuyos enlaces p están deslocalizados, conun orden de enlace de aproximadamente 1 ½ entre los átomos decarbono adyacentes. Esto explica que las longitudes de enlace C-Cen el benceno sean más cortas que las de los enlaces simples, peromás largas que las de los dobles enlaces. Como los enlaces p estándeslocalizados en el anillo a menudo se inscribe un círculo en elhexágono, en lugar detrazar los enlaces dobles localizados.

Biorremediación

El término biorremediación se utiliza para describir una variedadde sistemas que utilizan organismos vivos (plantas, hongos,bacterias, etc.) para degradar, transformar o remover compuestosorgánicos tóxicos a productos metabólicos inocuos o menos tóxicos.Esta estrategia biológica depende de las actividades catabólicasde los organismos, y por consiguiente de la utilización de loscontaminantes como fuente de alimento y energía. Para que estoocurra, es necesario favorecer las condiciones para el crecimientoy la biodegradación (Van Deuren y col., 1997).

La meta final de la biorremediación, es la mineralización delcontaminante. Es decir, la completa degradación de una moléculaorgánica hasta compuestos inorgánicos (CO2, agua y formasinorgánicas de N, P y S) y componentes celulares (Alexander, 1994;Eweis y col., 1998). Su aceptación como una estrategia de limpiezaviable, en muchos casos, depende de sus costos. Sin embargo,muchas de las estrategias de biorremediación son competitivas entérminos de costos y del impacto sobre la matriz contaminada(Semple y col., 2001).

Entre las ventajas que las tecnologías de biorremediación para eltratamiento de sitios contaminados presentan sobre los métodosfisicoquímicos tradicionales, se encuentran: (i) disminución encostos de operación; (ii) los contaminantes son destruidos otransformados; y (iii) normalmente no se requiere o se necesita unmínimo de tratamientos adicionales.

Aunque no todos los compuestos orgánicos son susceptibles a labiodegradación, los procesos de biorremediación se han usado conéxito para tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados conHTPs, solventes, explosivos, clorofenoles, pesticidas,conservadores de madera e hidrocarburos aromáticos policíclicos(HAPs) (Van Deuren y col., 1997; Semple y col., 2001).

Pseudomonas

Existen bacterias capaces de utilizar petróleo para su crecimientoy mantenimiento, conocidas como bacterias degradadoras dehidrocarburos, dentro de las cuales se encuentra el géneroPseudomonas, que por su versatilidad metabólica, son capaces deconvertir sustratos habitualmente no degradables, en metabolitosfácilmente asimilables o susceptibles de ser catalizados

enzimáticamente (24). El éxito la biorremediación consiste en laselección de microorganismos que puedan degradar materialescontaminados a diferentes temperaturas, pH, salinidad yconcentración de nutrientes. Muchos tipos de microorganismos hansido aislados para mejorar procesos de biorremediación deambientes contaminados con hidrocarburos de petróleo (28-30),porejemplo Bacillus sp, Rhodococcus, Mycobacterias, levaduras, Micromycetes yPseudomonas, las cuales utilizan como fuente de energía compuestosorgánicos simples y complejos y son productoras de enzimasextracelulares, incluyendo la lipasa (31). Por lo tanto, el númerode comunidades bacterianas en sitios contaminados suele ser menorque en sistemas no contaminados, aproximadamente el 0.1% de lapoblación microbiana total (27), y pueden variar de acuerdo almomento del muestreo o el grado de contaminación por hidrocarburos(32), las condiciones climáticas, el tipo de suelo, y laprofundidad de las aguas.

Tecnologías de biorremediación de suelos

La biorremediación de suelos puede llevarse a cabo in situ, obien, el material puede ser excavado y tratado ex situ. Laprincipal ventaja de los tratamientos in situ es que permitentratar el suelo sin necesidad de excavar ni transportar, dandocomo resultado una disminución en costos. Sin embargo, este tipode tratamientos generalmente requiere de periodos de tratamientolargos y es menos seguro en cuanto a la uniformidad deltratamiento debido a la heterogeneidad propia del suelo. Lastecnologías de biorremediación in situ, incluyen el bioventeo, labioaumentación, la bioestimulación, la biolabranza, la atenuaciónnatural y la fitorremediación (Van Deuren y col., 1997).

La principal ventaja de las tecnologías ex situ, es quegeneralmente requieren de periodos más cortos que los anteriores,son más seguros en cuanto a la uniformidad del tratamiento, ya queel sistema puede homogeneizarse y mezclarse continuamente. Otraventaja, es que los productos permanecen dentro de la unidad detratamiento hasta la obtención de productos no peligrosos. Sinembargo, los tratamientos ex situ requieren de la excavación delsuelo. Las tecnologías de biorremediación ex situ, incluyen

procesos de composteo (biopilas) y el uso de biorreactores (delodos y en fase sólida) (Van Deuren y col., 1997).

a) Composteo

El composteo es un proceso biológico controlado, por el cual loscontaminantes orgánicos pueden convertirse en subproductos inocuosestables. El material contaminado se mezcla en pilas, consustancias orgánicas sólidas biodegradables, como paja, aserrín,estiércol y desechos agrícolas. Estos materiales son adicionadoscomo agente de volumen, para mejorar el balance de nutrientes(C/N) para la actividad microbiana, y para asegurar la generacióndel calor necesario para el proceso. Los sistemas de composteoincluyen tambores rotatorios, tanques circulares, recipientesabiertos y biopilas (Alexander, 1994; Eweis y col., 1998; Semple ycol., 2001).

Los procesos de composteo pueden aplicarse para tratar suelos ysedimentos contaminados con compuestos orgánicos biodegradables.El composteo se ha usado con éxito, para la remediación de sueloscontaminados con clorofenoles, gasolina, HTPs, HAPs, y se hademostrado también una reducción en la concentración y toxicidadde explosivos hasta niveles aceptables (Van Deuren y col., 1997;Semple y col., 2001).

En la práctica y en general, una de las tecnologías de composteomás utilizada para el tratamiento de extensas áreas de sueloscontaminados, principalmente por HTPs, se lleva a cabo encondiciones aerobias y se conoce como biopilas, bioceldas, pilasde composteo o sistemas de co-composteo (Iturbe-Argüelles y col.,2002). Las biopilas, son una forma de composteo en el cual seforman pilas con el suelo contaminado y agentes de volumen. Elsistema, que puede ser abierto o cerrado, se adiciona connutrientes y agua y se coloca en áreas de tratamiento, queincluyen sistemas para colectar lixiviados y alguna forma deaireación (Eweis y col., 1998).

La elección del tipo de sistema de biopilas depende principalmentede las condiciones climáticas y de la composición de compuestosorgánicos volátiles presentes en el suelo contaminado.Generalmente las biopilas se diseñan como sistemas cerrados, yaque éstas permiten mantener la temperatura y evitar la saturación

de agua debido a lluvias, además de disminuir la evaporación deagua y de compuestos orgánicos volátiles (Eweis y col., 1998).

Dos de los sistemas de biopilas más empleados para el tratamientode suelos contaminados, son las biopilas alargadas (Figura 1) ylas biopilas estáticas (Figura 2). La diferencia entre ambastecnologías radica en el método de aireación que se emplea paraproveer de oxígeno el proceso de composteo (Eweis y col., 1998).En los sistemas estáticos, el material a compostear se airea porinyección (sopladores) o extracción (bombas de vacío) a través detuberías perforadas, colocadas debajo de las pilas. En estossistemas, la aireación implica aireación forzada a través delsuelo por inyección o extracción a través de tuberías perforadas.En el caso de las biopilas alargadas, el material es mezcladoperiódicamente con el uso de un equipo móvil (tractores o máquinasdiseñadas especialmente para este fin), este tipo de biopilas seconsidera actualmente como la alternativa más económica decomposteo (Potter, 1997; Van Deuren y col., 1997).

b) Electroremediación

El tratamiento electroquímico es una tecnología emergente debiorremediación in situ, altamente efectiva en la remoción demetales pesados y compuestos orgánicos altamente solubles en agua(Ko y col., 1992). El tratamiento electroquímico de un suelocontaminado (electro-remediación), involucra la aplicación de unacorriente directa de bajo voltaje o de un gradiente de potencialbajo a través de un electrodo positivo (ánodo) y uno negativo(cátodo) que se insertan en el suelo (RiserRoberts, 1998).

Durante la aplicación de una corriente eléctrica se crea un campoeléctrico entre los dos electrodos, en donde las sustanciasaltamente solubles se orientan similarmente a las moléculas deagua y tienden a emigrar hacia uno de los dos electrodos deacuerdo a las cargas, polaridad y movilidad de los contaminantes.La migración de estos compuestos depende principalmente del efectodel campo eléctrico para remover especies químicas cargadas, pormedio de la electromigración (transporte de iones), electro-ósmosis (transporte del agua de solvatación de iones) y/oelectroforesis (arrastre mecánico de coloides y/o microorganismos)(Ko y col., 2000). El proceso dominante durante la electro-remediación es la electro-ósmosis, en la cual, la corriente

directa produce el flujo de agua a través del suelo (VanCauwenberghe, 1997; Paillat y col., 2000).

Dentro de los contaminantes que pueden tratarse por procesoselectroquímicos, se encuentran: metales pesados (Pb, Hg, Cd, Ni,Cu, Zn, Cr); especies radioactivas (137Cs, 90Sr, 60Co, Ur);aniones tóxicos (NO3-, SO4-); mezclas de contaminantesorgánicos/iónicos; hidrocarburos del petróleo (gasolina, diesel yaceites); hidrocarburos halogenados (PCBs); hidrocarburospoliaromáticos (HAPs); benceno, tolueno, etilibenceno y xilenos(BTEX); cianuros y explosivos (Van Cauwenberghe, 1997).

Fitorremediación.

Para limpiar suelos contaminados hay tecnologías costosas como laexcavación, la incineración, el lavado y la bioventilación. Lafitorremediación es una alternativa donde se usa plantas y laasociación microorganismo-raíz para remover o contenercontaminantes en el suelo (Cunningham etal.,1996). En suelosmoderadamente contaminados, la fitorremediación tiene bajo costoen comparación con técnicas físicas y químicas (Siciliano yGermida, 1998).

Se ha evaluado el efecto de las plantas y la asociaciónrizosférica en la degradación de hidrocarburos del petróleo (Ferroetal.,1994; Schwab y Banks,1994;Reilley etal.,1996). Lasleguminosas normalmente tienen un sistema radical poco ramificadopero profundo que les permite actuar sobre contaminantes en lascapas más profundas del suelo (Kirk etal. 2002). Su simbiosis confijadores de nitrógeno (N) del género Rhizobium las libera de lanecesidad de absorber N, por lo que son más competitivas en sueloscon baja fertilidad. Esta característica es importante, ya que lacontaminación con hidrocarburos incrementa la relación C/N,afectando la disponibilidad del N.

Comparadas con gramíneas, las leguminosas pueden incrementar hastadiez veces la población de bacterias en su rizósfera (Yateemetal.,1999). Sin embargo, para la fitorremediación dehidrocarburos es importante seleccionar especies de leguminosas

con adaptación a las condiciones de sitio y a la concentración delcontaminante. San Gabriel etal. (2006) reportaron tolerancia dePhaseoluscoccineusal combustóleo.

MATERIALES Y METODOS

BIORREMEDIACIÓN (PSEUDOMONAS) Medios de cultivo y reactivos.

Se utilizaron caldo nutritivo, agar nutritivo y agar-agarcomerciales marca Merck, y se prepararon según las instruccionesdel fabricante. El caldo de pre enriquecimiento se preparó con(NH4)H2PO4 (0.9mg/L) marca R.A. Chemicals, agregando ACPM al 1%comprado en una estación de gasolina. El caldo de enriquecimientofue preparado con sales grado reactivo marca Merck, K2HPO4:1.5g/L; KH2PO4: 0.5g/L; (NH4)2SO4: 0.5g/L; NaCl: 0.5g/L; MgSO :3.0g/L; FeSO : 0.002g/L; CaCl2: 0.002g/L, todos en 1.000Ml de aguadestilada, suplementados con crudo de petróleo al 1%, muestraobtenida por donación de una empresa petroquímica; el mediomineralizado sólido se obtuvo agregando agar-agar 15g/L con 1% decrudo de petróleo. Los medios fueron esterilizados en autoclavehorizontal por 15 minutos a 20 libras de presión y 121°C, paragarantizar completa esterilidad.

Toma de muestras.

El muestreo se hizo en forma radial en las inmediaciones devertimientos finales de una refinería de petróleo y susalrededores, donde se delimitaron cinco puntos diferentes demuestreo, por medio del sistema de geoposicionamiento (GPS). Encada uno de ellos, se tomó la muestra por duplicado. Lascoordenadas en las cuales fueron tomadas las diferentes muestrasse presentan en la Tabla 1. Los análisis fueron realizados apartir de cuatro hábitats de microorganismos reconocidos en elsistema marino: bio películas, sedimentos o lodos, neuston y aguasubsuperficial.

Bio película. Se tomó una muestra por raspado con espátulaestéril, cerca del desagüe de una industria petroquímica, la cualfue envasada en frascos estériles.

Sedimento. Las muestras de sedimento fueron tomadas por duplicadoutilizando una draga tipo Vanveen para muestreo de sedimento, ypasadas a su vez a frascos estériles de 250 ml.

Neuston. Estas muestras fueron tomadas por duplicado, dejandoentrar agua de la capa superficial ubicada en la interface agua-aire (Neuston) en una placa de vidrio de forma piramidal,construida por los autores, de 20 cm x 20 cm, cuya capacidad decarga es un volumen entre 11 y 15 ml, que de manera aleatoria setomaron, hasta llenar los frascos estériles.

Agua sub-superficial. Se recolectaron muestras por duplicado enfrascos estériles de 250 ml, sumergiéndolos a 30 cm de lasuperficie, abriéndolos y dejando pasar el agua hasta su llenado ytapado finales.

Fases de laboratorio.

Para la realización de las fases de pre–enriquecimiento y deenriquecimiento bacterianos, se realizaron algunas modificacionesa los procedimientos sugeridos por Gómez et al., 2006 (37);Narváez et al., 2008 (38); Mohajeri et al., 2010 (26); Bacosa etal., 2010 (4); y Zhengzhi Zhang et al., 2011 (6).

Pre–enriquecimiento.

Biopelícula. Se tomó 1gr de biopelícula y se agregó a 9mL de caldode pre–enriquecimiento (NH4H2PO4) con ACPM al 1%.

Sedimento. Se diluyeron 50gr de sedimento en 450mL de agua de marestéril, con agitación por 15 minutos. 1mL de la dilución anteriorse agregó en 9 ml de caldo de pre – enriquecimiento (NH4H2PO4) conACPM al 1%.

Neuston y agua subsuperficial. Se tomó 1mL de la muestra y seagregó a 9 ml de caldo de pre – enriquecimiento (NH4H2PO4) conACPM al 1%. Los caldos de pre-enriquecimiento sembrados seincubaron a 35°C con agitación permanente durante 7 días.

Tinción de Gram y repique en agar nutritivo. Se realizócoloración de Gram a cada uno de los tubos de caldo de pre-enriquecimiento. Posteriormente, Se tomaron 10 µl de cada tubo decaldo de pre- enriquecimiento y se realizó siembra por agotamientoen Agar nutritivo con 1% de ACPM como única fuente de carbono yenergía, con el fin de aislar colonias de cada muestra cultivadapor 7 días. Los cultivos fueron incubados por 24 horas a 35°C.

Enriquecimiento. La fase de enriquecimiento constó de un procesode tres semanas. Inicialmente, pasados 7 días de incubación de lasmuestras pre– enriquecidas, se tomó 1 ml de estas y se sembraroncada uno en tubos con caldo de enriquecimiento (caldo mineralizado+ 1% de petróleo crudo). Se incubaron a 37°C por 7 días conagitación continua. Este mismo procedimiento se realizó a los 14y a los 21 días. El petróleo se observó como una sustancia negrainmiscible localizada en la parte superior del tubo.

Selección de cepas competitivas en la degradación de petróleo(selección horizontal). Para la selección horizontal de las cepasestas fueron reactivadas en caldo nutritivo e incubado a 35ºC por24 horas. Posteriormente se realizaron siembras masivas en agarmineralizado 1% de crudo de petróleo a 30°C por 7 días con 3repiques semanales.

Identificación bioquímica. Todos los tubos fueron repicados enagar nutritivo y las cepas caracterizadas bioquímicamenteutilizando el sistema BD BBL Crystal Identification SystemsEntric/ nonfermenter ID Kit. El procedimiento se hizo de acuerdo

con las especificaciones técnicas de la casa comercial, generandocódigo que al buscarlo en una base de datos permite tener elgénero y la especie de la bacteria estudiada.

COMPOSTEO Y BIOPILAS.

Obtención de suelo contaminado con hidrocarburos.

El suelo intemperizado contaminado con hidrocarburos, se obtuvo dela rizósfera de una planta nativa en el pantano de “SantaAlejandrina” en Minatitlán, Veracruz. El suelo se tomó de larizósfera con el objeto de obtener poblaciones microbianasadaptadas a altas concentraciones de hidrocarburos, y de estamanera aumentar la eficiencia del proceso de biorremediación.

Pretratamientos fisicoquímicos

Los pretratamientos fisicoquímicos propuestos en este trabajoexperimental, se seleccionaron en base a los resultados obtenidosdurante la fase experimental del proyecto multidisciplinarioEstudios de tratabilidad para la remediación de suelosintemperizados contaminados con hidrocarburos”, apoyado por laUniversidad Autónoma Metropolitana (UAM-I, 2001); además deinformación obtenida a partir de publicaciones de revistas deinvestigación. El objetivo principal de cada pretratamiento fue elde desorber del suelo intemperizado los hidrocarburoscontaminantes.

Pretratamiento con surfactante.

El surfactante utilizado fue Tween 80 (grado reactivo, HYCEL),elegido debido a que su CMC (12 g/L) es baja con respecto a otrossurfactantes (Tabla 2). Esta baja CMC, permite la formación demicelas a bajas concentraciones de surfactante. De acuerdo con losresultados presentados por Ghosh (1997), este surfactante puedeser adsorbido por el suelo y degradado por los microorganismoshasta en un 99.6%, durante los primeros 10 días de un tratamientode biorremediación.

La concentración de Tween 80 adicionada al suelo fue de 2.5 g/Ldisuelto en agua (0.833 g Tween/kg suelo), hasta una humedad de30%. El suelo se mezcló con la solución y se dejó reposar por unperiodo de 24 h. Posteriormente, el suelo se dejó secar atemperatura ambiente durante 48 h.

Pretratamiento con benceno.

El suelo seco se adicionó con 0.5% (v/p) de benceno (4.33 gbenceno/kg suelo), se homogeneizó y se colocó en bolsas deplástico, las cuales se cerraron herméticamente. El procedimientose realizó 24 horas antes de iniciar el tratamiento debiorremediación por composteo (UAM-I, 2001).

Pretratamiento electroquímico.

Este pretratamiento se utilizó con el objetivo de favorecer ladesorción de los HTP del suelo, a través de una diferencia depotencial eléctrico (Figura 5). Se utilizó una celda modeloconstruida con placas de vidrio, con una malla de acero inoxidablecomo cátodo y una de fieltro de grafito como ánodo. Loscompartimentos catódico y anódico se mantuvieron al mismo nivelpara evitar que el fluido se desplazara por una diferencia depresión hidráulica. Las soluciones usadas fueron: (NH4)2SO4 0.1 Men el lado anódico y NaOH 0.1 M en el lado catódico. La corrientese impuso a un valor constante de 1.75 mA/cm2 durante 6 horas.Posteriormente, el suelo se secó a temperatura ambiente.

Caracterización y preparación del suelo.

Antes de su utilización, las muestras de suelo se tamizaron conmalla No. 10, recolectando la porción de suelo con tamaño departícula menor a 2 mm. Esta porción de suelo se almacenó atemperatura ambiente en botes de plástico hasta su utilización.Una fracción del suelo se caracterizó para obtener informaciónacerca de la salinidad (conductímetro), pH (EPA 9045C),hidrocarburos totales del petróleo (EPA 3540C) y carbono soluble(EPA 9060).

Con el objetivo de mejorar las propiedades físicas del sistema(porosidad y capacidad de retención de agua), así como parafavorecer el balance de nutrientes necesarios para el crecimientode microorganismos, se le adicionó al suelo una mezcla decompuestos orgánicos de fácil degradación como agentes de volumen:(i) bagazo de caña; (ii) bagazo de zanahoria; (iii) estiércol decaballo y (iv) composta madura. Estos agentes se seleccionaron conel criterio de que fueran residuos biodegradables sin valoragregado y con facilidad para su obtención. Cada uno, se adicionóal suelo en proporción tal que, de acuerdo al contenido de C, N, Py K de cada uno (Tabla 3), se obtuviera un balance de nutrientesapropiado (C/N= 30, C/P=100 y C/K=200) (Von Fahnestock y col.,1998).

El bagazo de caña se seleccionó por su contenido de C y P, ademásde ser un excelente agente de volumen; el bagazo de zanahoria seadicionó por su alto contenido de N y azúcares solubles, además deser un material fácilmente biodegradable. El estiércol de caballose utilizó principalmente para aumentar el contenido de K y porser un material que puede incrementar la microflora del sistema,además de ser un buen agente de volumen. Con la finalidad defavorecer aún más la microflora en las biopilas, se adicionócomposta madura proveniente de un sistema que posee un consorciomicrobiano adaptado a la presencia de compuestos como solventes ehidrocarburos (UAMI, 2001). La Tabla 3 muestra la composiciónquímica aproximada (C, N, P y K) teórica de los agentes de volumeny del suelo estudiado, así como el contenido de humedad real decada componente.

De acuerdo con la Tabla 3, el peso teórico total de cada biopila(suelo más aditivos), en base húmeda fue de 28.2 Kg y la densidadfue de 0.570 kg/L. Para determinar las relaciones carbono-nitrógeno, fósforo y -potasio (C/N, C/P y C/K), se dividió lacantidad total de carbón contenida en el suelo y aditivos (2,521g) entre las cantidades totales de cada elemento (89.6, 34.1 y51.8 g) respectivamente. La adición de azúcar en la composta, serealizó para ajustar la relación C/N a un valor de 28. Por otraparte, comparando el balance de nutrientes teórico y elrecomendado, se puede observar que existe una diferencia

significativa entre la relación C/K, la cual se debe al altocontenido de potasio presente en el estiércol de caballo.

Condiciones de cultivo a nivel semi-piloto (biopilas).

Cada biopila se preparó con 9 kg (peso seco) de suelo pretratado,adicionado con 1.125 kg (peso seco) de cada agente de volumen(Tabla 3). Se prepararon 3 biopilas diferentes, con el fin deevaluar el efecto de cada pretratamiento, más una biopila controlcon suelo sin tratar.

Una vez que se mezcló el suelo con los agentes de volumen, y elazúcar (sacarosa) necesaria para ajustar la relación C/N a 28, elmaterial de cada biopila se colocó en recipientes de plástico(capacidad para 50 kg) y se adicionó agua suficiente para obteneruna humedad cercana al 50%. Las biopilas se identificaron comosigue: (i) control (suelo sin tratar); (ii) electroquímico(tratamiento electroquímico); (iii) surfactante (tratamiento consurfactante); (iv) tolueno (tratamiento con tolueno).

El peso total final para cada biopila fue de alrededor de 30 kg(peso húmedo). Todas las unidades experimentales (recipientes conel material a compostear) se mantuvieron a temperatura ambiente(en un invernadero) durante siete meses. Por otra parte, cadaunidad experimental fue periódicamente (cada 30 días) adicionadacon bagazo de zanahoria (5% del peso de la pila), con la finalidadde mantener un cierto contenido de materia orgánica de fácilasimilación y de esta forma asegurar la actividad y diversidad dela población microbiana.

Métodos analíticos.

A continuación se describen los métodos analíticos que se llevarona cabo a lo largo del presente estudio. Todas las variables, conexcepción del consumo de oxígeno, fueron analizadas por triplicadoa partir de tres muestras independientes tomadas de cada biopila,para cada tiempo de muestreo. Las pruebas respirométricas serealizaron por duplicado durante 120 días. Los muestreos de cadabiopila se llevaron a cabo al arranque del estudio (tiempo cero),y después de 20, 35, 52, 70, 90, 124, 136, 167 y 206 días. Todoslos datos presentados corresponden al promedio de tres medicionesindependientes. Los análisis de varianza se realizaron con el uso

del programa estadístico SAS, con una de 0.05, utilizando laprueba de Duncan.

Respirometría. Durante los cuatro primeros meses de lainvestigación, se determinó la actividad microbiana en tiempo realdel proceso de composteo, mediante la medición del consumo deoxígeno en un respirómetro (Comput-Ox 244, N-CON).

Hidrocarburos totales del petróleo (HTPs). El contenido total deHTP en las muestras de suelo, se determinó gravimétricamentemediante el método EPA 3540C con diclorometano como agente deextracción. La determinación de HTP se realizó de acuerdo a lasiguiente ecuación.

pH. Se utilizó el método EPA 9045C, que consiste en mezclar elsuelo con agua destilada por 5 min., con la finalidad desolubilizar los compuestos que dan la característica ácida obásica del suelo. La relación suelo:agua que se empleó paradeterminar el pH, fue de 1:5 (2 g suelo:10 mL agua).

Carbono orgánico total en fase acuosa (TOC). Se empleó el métodoEPA 9060, a partir del mismo extracto utilizado para ladeterminación de pH. Mediante este método, se determina el carbonoorgánico soluble en agua, contenido en el suelo.

Conductividad eléctrica (CE). Se determinó por conductimetría, conel extracto obtenido de acuerdo al método EPA 9045C. La CE es unapropiedad que se cuantifica por medio de la conductancia(resistencia-1) determinada en una sección transversal a travésdel cual pasa una corriente eléctrica.

Esta variable cuantificada en un suelo, generalmente se utilizacomo una medida de su salinidad. Humedad (%H). Se cuantificógravimétricamente por la diferencia de peso entre las muestrashúmedas y secas. El secado de las muestras se realizó en unaestufa a 60 °C, durante 24 horas.

Actividad de agua (Aw). Es una medida de la disponibilidad de aguautilizable por los microorganismos.

La Aw, es la razón entre la presión de vapor del aire enequilibrio con una sustancia o solución y la presión de vapor delagua a la misma temperatura (Madigan 1998). Los valores puedenvariar entre 0 (suelo seco) y 1 (agua pura). Se determinódirectamente en las muestras tomadas de las biopilas, con el usode un equipo digital (Aqualab CX-2).

Cenizas y materia orgánica volátil. Las cenizas se cuantificaronpor diferencia de peso, después de someter una muestra seca (2.5g) a calcinación en una mufla (800 °C, 24 horas). La diferenciaentre el peso inicial de la muestra y sus cenizas, se consideracomo materia orgánica volátil presente en las muestras. Elcontenido de cenizas de las muestras fue utilizado además como unfactor de corrección para obtener la cantidad real de materiaorgánica degradada, además de la degradación de HTP.

Mineralización (CO2 producido). La mineralización de HTP y de lamateria orgánica contenida en las biopilas, se determinó por lapérdida de materia orgánica (MO) durante el tiempo deltratamiento, empleando la siguiente ecuación:

Es importante aclarar que para realizar esta determinación, separte de la consideración de que la materia orgánica que se pierdedurante el proceso en forma gaseosa, es principalmente CO2.

Cuenta microbiana (unidades formadoras de colonias). La cuentamicrobiana (cuenta en placa) se refiere al número de célulasviables o fragmentos miceliares en una muestra, que son capaces decrecer sobre un medio de cultivo determinado. En este método, elnúmero de microorganismos se reporta como unidades formadoras decolonias (UFC) por gramo de muestra (base seca). En este caso, se

utilizó un medio de cultivo que favorece el crecimiento debacterias (agar soya tripticaseína, AST); y uno que favorece elcrecimiento de hongos (agar papa dextrosa, PDA), al cual se leadicionó cloramfenicol para evitar el crecimiento bacteriano. Lascondiciones de la prueba fueron las siguientes:

Muestra de suelo: 3 g Diluciones: 1:10 (volumen: 30 mL) Repeticiones por dilución: 3 Tiempo de incubación: AST 2 días; PDA 5 días Temperatura: 30 °C Criterio para el conteo de colonias: 20-200 por caja

El número de UFC/g de suelo (peso seco) se obtuvo de la siguientemanera:

UFC/mL = (No. de colonias / 0.1 mL de inóculo) x factor dedilución

UFC/g = (UFC/mL) x (27 mL) / peso de la muestra (g)

FITORREMEDIACIÓN

Se usó suelo contaminado (SC) con combustóleo (50 000 mg kg−1) dela localidad de Frijol Colorado, Veracruz, 19° 35’ 16” N y 97° 21’06” O, y 2410 m de altitud. El área afectada por el derrame fueaproximadamente 100 m2. El suelo presentó pH 6.6, 0.1% N, 25 μgg−1 P Olsen, 2.1% materia orgánica (MO), y textura franca. Setomaron siete muestras de el suelo de la zona contaminada (20-30cm profundidad) que se homogeneizaron para obtener una muestracompuesta de 35 kg. Cerca de la área muestreada se tomaronmuestras de suelo no contaminado (SNC), cultivado con maíz, consimilares características en textura y pH (Sangabriel et al.,2006). El método de muestreo fue en zig-zag (Paetz y Wilke, 2005).

Establecimiento del experimento

Se estableció en invernadero el experimento de fitorremediación;la temperatura máxima/mínima y humedad relativa promedio fueron23.5/11.9 °C y 63/71%. Las unidades experimentales fueronrecipientes de cristal ámbar rellenados con suelo (250 g porunidad). Se usó SC con combustóleo y SNC que se prepararon así: lamuestra compuesta se dividió en tres partes, en una parte seaplicó 5% MO (FOrg; vermicomposta de café); en otra parte seaplicó solución nutritiva completa de Long Ashton (Hewitt, 1966)que fue el tratamiento con fertilización inorgánica (FInor); elsuelo restante se mantuvo sin fertilización (NoF). Se usó P.coccineus L. (Pcocc) como la especie a evaluar. En cada unidadexperimental se sembraron dos semillas de Pcocc. Se hicieronriegos controlados con agua destilada para mantener el suelo acapacidad de campo. Hubo dos tratamientos más (SC y SNC sinplanta) para evaluar la posible atenuación natural delcombustóleo. Pero no se fertilizó, por lo que los datos depoblación microbiana, se analizaron por separado del experimentocon Pcocc.

Variables

1) En las plantas se determinó la altura semanalmente empezando7 días después de la emergencia. A los 90 días se midió el volumenradical y la materia seca (MS) producida.

2) La población de bacterias y hongos rizosféricos totales ydegradadores de hidrocarburos se determinó a los 90 días usando elmétodo de dilución y cuenta viable de unidades formadoras de colo-nias (UFC) crecidas en su medio de cultivo en caja de Petri(Ingra-ham e Ingraham, 1998). Para bacterias totales se usó agarnutritivo (Baker®) y para hongos totales papa-dextrosa agar (PDA,Baker®). Para las poblaciones de bacterias y hongos tolerantes apetróleo se usó medio mineral (por L: 0.8 g K2HPO4; 0.2 g KH2PO4;0.2 g MgSO4·7H2O; 0.06 g CaCl2; 0.1 g NaCl2; 0.025 Na2MoO4·2H2O;0.28 NaFe-EDTA; 5 μg biotina y 10 μg ácido p-amino benzoico; pH 7)con petróleo crudo como fuente de carbono. El petróleo se aplicóen papel filtro embebido y adherido en el interior de lacontratapa de la caja de Petri. Las cajas se incubaron 24-72 h a25 °C, dependiendo del crecimiento microbiano. Los conteos setransformaron a unidades logarítmicas para su análisis estadísticoy presentación de resultados.

3) La degradación de combustóleo se determinó a los 90 días,mediante extracción y cuantificación de hidrocarburos de dosmuestras compuestas de suelo de cada tratamiento. La extracción sehizo con diclorometano mediante agitación mecánica (Schwab et al.,1999) usando el método modificado EPA 8270B SW-846 (USEPA 1986;Louchouarn et al., 2000). Los extractos se concentraron porevaporación del solvente, recolectando una alícuota final de 1 mLpara su análisis cualitativo con GC-MS en un cromatógrafo de ga-ses Hewlett-Packard GCD PLUS G1800-B y una columna capilar HP-5(5%-fenil)-metilpolisiloxano (30 m; 0.25 mm i.d.; 0.25 μm espesorde película). Cada componente se identificó con base en su tiempode retención y por la búsqueda y comparación de su espectro demasas (70 eV) en la biblioteca del HP-Chemstation-NIST MS, versiónA.00.00-1995. El análisis cualitativo de los compuestos delcombustóleo se presenta en los cromatogramas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

PSEUDOMONAS.

Pre–enriquecimiento

En esta etapa, se inició una adaptación de los microorganismos enlos diferentes hábitats muestreados con diesel o ACPM como fuentede carbono y energía. La coloración de Gram permitió apreciarbacilos gram negativos, cocobacilos gram negativos, bacilos grampositivos, cocos gram positivos, algas y protozoos. La tendenciaen los cuatro hábitats fue la prevalencia de bacilos ycocobacilos gram negativos, siendo marcada la gran diversidad enel hábitat de biopelícula. Al finalizar los 7 días de incubaciónse realizaron cultivos sobre agar nutritivo, evidenciandocrecimientos entre moderados y abundantes, de veintiocho coloniascon morfologías diversas. Así mismo, en algunos cultivossepresentó pigmentación de color verdoso, pensando en posiblesbacterias del género Pseudomonas, como se observa en la Figura 2 y3. En esta etapa, fue evidente en la muestra de Neuston y de aguasubsuperficial la formación de natas blanquecinas transparentes y

de sustancia con característica jabonosa en la superficie deltubo, la cual fue más abundante al cuarto día de incubación,mientras que las muestras de sedimento y biopelícula presentaronabundante turbidez, nata en la parte superior y formación desedimento, el cual se hizo mucho más abundante el día quinto.

Enriquecimiento

En esta etapa, la adaptación se fortalece al hacer repiquessemanales por 21 días utilizando crudo de petróleo como fuente decarbono y energía. Este hecho, permitió seleccionar bacilos ycocobacilos Gram negativos en los cuatro hábitats estudiados. Loscultivos sobre agar nutritivo de los tubos a los 21 díasdeincubación presentaron abundante crecimiento con morfologías decolonias grandes y algunas pequeñas, irregulares, cremosas,convexas y coloración amarilla, con una característica común detinción verdosa en todos los cultivos, permitiendo seleccionarhasta ese momento 12 morfo tipos Figura 4 y 5.

Al hacer un seguimiento de los cambios en los tubos en la tercerasemana de enriquecimiento, se evidenció turbidez y cambios en laspropiedades del crudo de petróleo, al disgregarse y sedimentarse,hasta la desaparición de aproximadamente el 90% toda la mancha decoloración oscura, con formación de un sobrenadante amarillento,Figura 4 y 5.

Selección de cepas competitivas

Las 12 colonias seleccionadas fueron sembradas en agarmineralizado con 1% de crudo, tal como se presenta en otrasinvestigaciones recientes (33). Los resultados presentaroncrecimiento en la totalidadde las cajas, evidenciando elcrecimiento de colonias negras puntiformes y generandodesaparición parcial de la coloración oscura del crudo depetróleo, como se observa en la Figura 6.

Identificación bioquímica.

De las 12 colonias seleccionadas en agar mineralizado con crudode petróleo al 1%, se escogieron nueve colonias para sucaracterización bioquímica. Los resultados de estacaracterización, permitieron demostrar la presencia dePseudomonaaeruginosa en las nueve colonias escogidas de los cuatrotipos de hábitats muestreados, Figura 7. Los resultados demuestranla alta selectividad de esta bacteria, su tolerancia y adaptación,

lo que confirma su capacidad de degradar una amplia gama desubstratos, incluido el crudo de petróleo. Así mismo el uso deesta bacteria puede ser aplicado en posteriores estudios debiorremediación de aguas marinas, pasando de pruebas delaboratorio a pruebas de microcosmos, debido a que muchos factores

ambientales podrían afectar la habilidad deestos microorganismos

de degradar hidrocarburos en ecosistemas contaminados.

El éxito de la biorremediación en derrames de petróleo depende dela disponibilidad de los microorganismos adecuados, los factoresambientales y la composición del aceite derramado (26).

En relación con la metodología empleada en el estudio, variosautores coinciden en que la selección de microorganismos a travésde pruebas sucesivas de crecimiento poblacional en cultivos purosenriquecidos con petróleo, es considerada como una estrategiaeficiente para evaluar la adaptación y supervivencia de cepastolerantes a elevadas concentraciones de petróleo (24).

Así mismo, los resultados de esta investigación representanimportancia al considerar que se asemejan a lo expuesto porRuberto et al., 2003(39) y Narváez 2006 (38), quienes así mismoreportaron que el grupo predominante en los aislamientos fueronlos bacilos Gram negativos. Estos, tienen una ventajaamplia frentea las bacterias Gram positivas, debido a que son consideradosimportantes degradadores de hidrocarburos por la presencia delipopolisacaridos en su membrana, que facilitan la formación yestabilización de emulsiones de hidrocarburos en sistemas acuososy contribuyen al incremento en la superficie de ataque delcontaminante (40).

Pérez et al., 2008 (24), sustenta que las comunidades microbianasen áreas contaminadas son dominadas por los organismos capaces deutilizar o sobrevivir a compuestos tóxicos, como los ambientescontaminados con hidrocarburos, tal es el caso del géneroPseudomona.

La Pseudomonaaeruginosa ha sido identificada como un génerodestacado en diversos procesos de degradación (31, 41-45) y es laque con mayor frecuencia se aísla de ambientes contaminados conhidrocarburos.Sin embargo, otras especies de Pseudomonas han sidoaisladas de sedimentos de otras costas como Pseudomonasoleovorans,Pseudomonassynxatha,Pseudomonasreactans (46) y Pseudomonasputida(47).Otras investigaciones han demostrado que especies deAcinetobacter involucradas en la biorremediación de hidrocarburosaromáticos, así como en la producción de heteropolisacáridos de

alto peso molecular que actúan como emulsionantes de gran alcance(48).

COMPOSTEO Y BIOPILAS.

Caracterización de la muestra original y después de lospretratamientos.

En la Tabla 4, se muestran algunos de los parámetros analizados enel suelo original contaminado con hidrocarburos (control), asícomo en los suelos después de los pretratamientos con surfactante,tolueno y electroquímico.

Además de las variables que se presentan en la Tabla 4, secuantificó el contenido de HTP y la densidad inicial del suelo.Sin embargo, estos datos no se muestran debido a que solo secuantificaron en el suelo control, ya que ninguno de lospretratamientos modifica dichos parámetros. La densidad inicialdel suelo original fue de 1.41 kg/L (± 0.01 g/mL) y el contenidode HTP fue de 52,319 mg/kg de suelo seco (± 4,991 mg/kg).

Como se puede observar, el pH del suelo se incrementó alrededor deuna unidad después de realizar los tres pretratamientos.Otra variable que presentó cambios significativosposteriores al pretratamiento fue la CE, observándose el mayorincremento (1.19 mS/cm2) para el suelo tratadoelectroquímicamente. La CE es una medida de las sales presentesen el medio, lo que sugiere que por las condiciones del

tratamiento electroquímico, así como por su mismo efecto sobrelos iones presentes, el contenido de sales disponibles (disueltas)es mayor que para el resto de los suelos.

Con respecto a la cuenta microbiana, se observó que en general lacuenta bacteriana fue entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor quela cuenta de hongos, y que la cuenta microbiana total aumentósignificativamente en el suelo tratado con surfactante conrespecto al control sin tratar. La mayor cuenta de bacterias conrespecto a la de hongos, puede deberse al aporte de un altocontenido de las mismas por la adición del estiércol.

Pruebas de biorremediación

En las siguientes Secciones se presentan los resultados obtenidosdurante 210 días de tratamiento biológico (composteo) en el suelocontaminado por hidrocarburos.

Humedad y actividad de agua (Aw)

La humedad es una de las variables más importantes para favorecerla degradación de contaminantes orgánicos por los microorganismos.El rango de humedad recomendado para sistemas de composteoaplicados en la remediación de suelos contaminados porhidrocarburos es de 40 a 60%. Un valor de humedad por arriba deeste rango puede provocar condiciones de anaerobiosis, y conello una degradación más lenta de los contaminantes y laproducción de malos olores, mientras que valores por debajo deeste rango pueden inhibir la actividad microbiana (VonFahnestock y col., 1998; Madigan, 1998).

Por otra parte, los valores de Aw indican la cantidad de aguadisponible para que los microorganismos puedan desarrollar susfunciones metabólicas, la mayoría de ellos requiere valoresmayores a 0.9 para su crecimiento, es decir, si un microorganismose encuentra en un substrato con una Aw menor a la requerida, sucrecimiento se inhibe. El valor mínimo de Aw parabacterias es de 0.90, para levaduras de 0.85 y para hongosfilamentosos de 0.80 (Madigan 1998).

Al inicio del tratamiento biológico, la humedad en las biopilasfue ajustado a valores entre 40 y 60% (Figura 5), lo que dio comores ultado valores de actividad de agua (Aw) en un rango de 0.90 a0.99 (Figura 6). Tanto los niveles de humedad como lo valores deAw para todas las biopilas, se mantuvieron en los nivelesaceptables y recomendados para sistemas de composteoeficientes, durante todo el tiempo del estudio: humedad superior a40% y Aw cercana a 1.

El mantenimiento de la humedad por arriba de 40% durante 210días del tratamiento se consiguió debido a la adición periódicade agua, con la finalidad de compensar la evaporación durante laetapa termofílica del composteo (temperaturas mayores a 40 ºC) y/oa las altas temperaturas registradas en el invernadero (hasta 45°Cdurante el verano) en donde se mantuvieron las biopilas.

La baja humedad registrada en las biopilas entre los 90y 120 días, puede atribuirse a la alta evaporación que sepresentó durante el periodo de verano. Sin embargo, es importanteresaltar que la Aw en este mismo periodo se mantuvo en los

niveles adecuados para favorecer la actividadmicrobiana detodas las especies presentes.

pH

Al iniciar el tratamiento de composteo, después de la adición delos agentes de volumen, el pH inicial en todas las biopilas fuecercano a 7.5 (Figura 7). Sin embargo, a los 20 días detratamiento, se detectó un aumento significativo (~ 1.5unidades) en el pH de todas las biopilas. El rango de pHrecomendado para que se lleve a cabo una buena degradaciónde hidrocarburos en suelos se encuentra entre 5 y 9, con unóptimo en 7 (Dragun, 1988; Von Fahnestock y col., 1998). En base alo anterior, a partir de los 23 días de tratamiento se procedió areducir el pH de las biopilas mediante la adición por aspersión,de una solución de ácido fosfórico al 5% cada tercer día. Esteprocedimiento se suspendió a los 52 días de tratamiento, una vezque se obtuvieron valores de pH cercanos a 8. Posteriormente, losvalores de pH se mantuvieron entre 6.5 y 7.5 hasta los 210 díasdel tratamiento.

El incremento de pH observado puede atribuirse a una intensaactividad microbiana, lo que a su vez pudo provocar un ineficienteintercambio gaseoso y por consiguiente una baja cantidad de

oxígeno en el interior de las biopilas durante los primeros díasdel tratamiento. Esto pudo conducir a condiciones anaerobias enlas biopilas, favoreciéndose reacciones de desnitrificación(reducción de nitratos a amonio/amoniaco e incluso a nitrógenomolecular), las cuales tienden a incrementar el pH en unsistema.

Conductividad eléctrica (CE)

La conductividad eléctrica es uno de los parámetros másutilizados para estimar la salinidad en suelos. Paradistinguir suelos salinos de no salinos, se han sugeridovarios límites arbitrarios de salinidad en función de los efectosque pueda tener en las plantas. En investigaciones realizadas concultivos de tomate en Israel, se observó que el rendimiento delcultivo disminuye en un 10%, cuando se siembra en un suelo pocosalino (CE = 2 mS/cm ), mientras que en un suelo altamente salino(CE =9.5 mS/cm), el rendimiento del cultivo puede verse afectadohasta en un 50% (Miller y Donahue,1995). En la mayoría de losestudios, se reporta que las plantas se ven afectadas de maneraadversa cuando la CE es mayor de 4 mS/cm (Madigan, 1998).

En la Figura 8 se muestran los valores de CE obtenidos para lascuatro biopilas durante 210 días de tratamiento biológico. Puedeobservarse que inicialmente la CE de las biopilas aumentó (entre 2y 6 veces) con respecto a la CE del suelo original pretratado,esto debido a la adición de materiales con un cierto contenido desales solubles, como el estiércol de caballo.

La CE en las biopilas con suelo pretratado se mantuvo durante todoel tiempo del tratamiento por arriba de la CE de la biopilacontrol. Pudo observarse que en todos los casos, la CE disminuyósignificativamente (hasta 2 unidades) con respecto al valordetectado inicialmente para cada biopila. El ligero aumento en laCE observado después de los 120 días en las tresbiopilaspretratadas, puede atribuirse a una nueva desorción decontaminantes debido a una nueva aplicación de cada uno de lospretratamientos al material composteado.

Los resultados obtenidos para la CE, como una medida de compuestossolubles, indican que el tratamiento biológico en las condicionesestudiadas, fue eficiente para disminuir la cantidad de este tipode contaminantes. Si bien la CE no puede identificar uncontaminante en particular, es una medición de gran utilidad paradeterminar la distribución y la concentración de contaminantescomo sales, ácidos o bases en un suelo.

Consumo de O2

Cuando la velocidad de degradación de un compuesto esrelativamente lenta, como en el caso de los hidrocarburos, elproceso puede seguirse continuamente por la cuantificación del CO2producido y/o el O2 consumido (respirometría). La cantidad de CO2producido en un medio con hidrocarburos como única fuente decarbono, es una medida directa de su mineralización (Starnecker yMenner, 1996). Por otra parte, los pasos iniciales durante labiodegradación de hidrocarburos dependen del oxígeno molecular(O2), debido a que las principales rutas degradativas parahidrocarburos alifáticos y aromáticos involucran enzimasoxigenasas.

En la Figura 9 se muestra el consumo de oxígeno para lasdiferentes biopilas. Se observó que durante los primeros 100 díasdel tratamiento, las biopilas que presentaron mayor consumo de O2fueron la biopila control y la tratada con tolueno, a diferenciade la tratada electroquímicamente, endonde se observó el menorconsumo después de 100 días (Tabla 5).

Por otra parte, se observó una diferencia entre la velocidad inicial de consumo de O2(2 días) de la biopila control con respecto al material de las biopilaspretratadas (Tabla 5). Estas diferencias, junto con el menor consumo total de O2 en la biopila tratada electroquímicamente, pueden relacionarse con una mayor desorción de hidrocarburos del suelo por la aplicación de los pretratamientos, especialmente el electroquímico.

De acuerdo con los resultados obtenidos, es posible que laconcentración inicial de HTP desorbidos haya sidomayor en lasbiopilas con suelo tratado que en la biopila control. Puedesuponerse que este efecto en la respiración se deba a un aumentoen la concentración inicial de hidrocarburos, ya quedesde elinicio de la etapa de incubación se presentó esta disminución enla respiración en todas las biopilas tratadas. Se ha reportadoque condiciones extremas (shock químico, pH y temperaturasextremos, presencia de toxinas) y altas concentraciones decontaminantes o sus productos pueden inactivar o alterarmetabólicamente las células microbianas (Fan y Krishnamurthy,2000).

Es importante aclarar que la cantidad total de O2 consumidono tiene una relación directa con la degradación de HTP, ya quelas biopilas contenían además otros compuestos orgánicosfácilmente biodegradables. Sin embargo, es un parámetroimportante para estimar la actividad microbiana, así como paraevaluar el posible efecto de la desorción de HTP y de losdiferentes pretratamientos sobre los microorganismos presentes enlas biopilas.

Biodegradación de hidrocarburos

A partir del vigésimo día de tratamiento biológico hasta los 210días, se observaron diferencias significativas en labiodegradación de hidrocarburos, por efecto de los diferentespretratamientos fisicoquímicos del suelo contaminado (Figura 10).En todos los casos, la biodegradación de hidrocarburos después de210 días de composteo fue mayor de 35% (Tabla 6). Este resultadoindica que el proceso de biorremediación empleado, junto con losagentes de volumen seleccionados y las condiciones utilizadasfueron favorables, aún para el caso del suelo sin pretratar,considerando quelas biopilas fueron formadas con un suelointemperizado.

Las diferencias observadas en los niveles de biodegradación(Figura 10 y Tabla 6) entre las biopilas con los suelospretratados y el suelo control (3 a 12 unidades) indican quelos pretratamientos utilizados para la desorción de hidrocarburosfavorecieron su biodegradación.

En general, el empleo de pretratamientos para la desorción decontaminantes en un suelo, favorece la biorremediación. Sinembargo, una aplicación inadecuada del pretratamiento puedeafectar negativamente el proceso. Stelmack y col. (1999), señalanque el empleo de ciertos surfactantes no biodegradables puedereducir la adhesión de las bacterias en la superficie hidrofóbica,dando como consecuencia bajos niveles de biodegradación. Laha ycol. (1992), indican que el empleo de altas concentraciones desurfactante, puede resultar tóxico para los microorganismos.

En el caso de este estudio, los pretratamientos utilizadostuvieron un efecto positivo tanto en la biodegradación total dehidrocarburos como en la velocidad de degradación, con respecto alcontrol sin pretratar (Figura 11). La mayor velocidad inicial (20días) de consumo de hidrocarburos se obtuvo en la biopila tratadacon surfactante, y esta fue significativamente mayor (entre 1.2 y3.8 veces) que la velocidad en el resto de las biopilas (Tabla 6).Este resultado puede atribuirse a que el surfactante utilizado esuna fuente de carbono fácilmente biodegradable (Ghosh, 1997), quepor sus propiedades fisicoquímicas, inicialmente es cuantificadocomo materia orgánica y como parte de los compuestos solubles endiclorometano (Tabla 6), y por lo tanto la máxima velocidad debiodegradación de estos compuestos se detecta en los primeros díasdel tratamiento. Por otra parte, se ha demostrado que lossurfactantes que incrementan la solubilidad de los hidrocarburos,pueden acelerar su biodegradación debido al incremento en subiodisponibilidad (Bardi y col., 2000).

La mayor biodegradación de hidrocarburos (48%), así como lamayor velocidad de consumo de hidrocarburos (100.2 mg/kg•día)después de 210 días, se obtuvo en la biopila tratadaelectroquímica- mente (Tabla 6). De acuerdo con Pack (1997) yHarbottle y col. (2002), un tratamiento electrocinético aplicado asuelos contaminados puede mejorar significativamente subiorremediación, debido al movimiento tanto de los contaminantescomo de los microorganismos, incrementando el contacto entreambos y así la biodisponibilidad, ya que se favorece la remoción

de los compuestos sorbidos en las partículas del suelo hasta zonasen donde la degradación puede ocurrir.

Como se mencionó anteriormente, de acuerdo con los resultadosobtenidos, puede afirmarse que el tratamiento de biorremediaciónaplicado fue efectivo, aún para la biopila con suelo sinpretratar. Chaineau y col. (1995), encontraron unadegradación de hidrocarburos de 75% en un suelo contaminadocon HTP (2190 mg/kg), después de 270 días de incubación con lamicroflora nativa del suelo. Más tarde, Thouand y col. (1999),estudiaron la degradación de petróleo crudo (1,000 mg/kg) pordiferentes inóculos (naturales y comerciales) durante 28 días,encontrando niveles de degradación de 0.1 a 25% (peso).

Por otra parte, se reporta que las velocidades dedegradación de hidrocarburos en suelos que contienen entre0.5% y 1% (w/w) de HTP, pueden variar de 0.08 a 1.38 mg/cm3•día(Bossert y Bartha,1984). Atlas (1981) indica que concomunidades microbianas adaptadas a la presencia dehidrocarburos, la velocidad de degradación puede variar de 0.0005a 0.05 mg HTP/cm3•día.

Aunque los valores de las velocidades de biodegradación de HTPpueden variar en un amplio rango dependiendo de una serie defactores, en el presente estudio se obtuvieron altasvelocidades de consumo y significativamente mayores que las dealgunos reportes, lo que confirma que el empleo de esta tecnologíapuede resultar muy efectiva, como una alternativa para laremediación de suelos intemperizados.

De acuerdo con los resultados presentados, puede decirseque un factor limitante que incide directamente en lavelocidad de biodegradación de hidrocarburos en un suelointemperizado, es precisamente su biodisponibilidad. De acuerdocon Bardi y col. (2000), la biodegradación de hidrocarburosalifáticos y aromáticos no clorados generalmente está influenciadapor su biodisponibilidad. Se reporta que un tratamiento debiorremediación in situ o ex situ puede manejarse eficientemente,solamente cuando las velocidades de biodegradación sonconocidas. Por ejemplo, la adición denutrientes y/o aceptoresde electrones no es eficiente si la velocidad de degradación estálimitada porla biodisponibilidad del contaminante (De Jonge ycol., 1997). En general, la biorremediación por composteo, deun suelo contaminado con hidrocarburos puede llegar a sermuy eficiente si se mantienen algunos parámetros fisicoquímicosen condiciones óptimas (Von Fahnestock y col., 1998).

Los resultados aquí obtenidos confirman que la biodegradaciónde hidrocarburos en este tipo de suelos se encuentra limitada porla biodisponibilidad. Puede verse que en la biopila control,tanto la biodegradación, como las velocidades de biodegradación dehidrocarburos, fueron significativamente menores que en lasbiopilas tratadas para desorber los contaminantes. Además de labiodisponibilidad, la velocidad de degradación depende de otrosfactores como son: (i) presencia de microorganismos con capacidadmetabólica para degradar los contaminantes; (ii) recalcitranciade los compuestos presentes en la mezcla de hidrocarburos, (iii)concentración inicial de hidrocarburos, (iv) tipo de suelo, y (v)crecimiento microbiano y factores ambientales como pH,temperatura, nutrientes y aceptores de electrones (De Jonge ycol., 1997).

De acuerdo con lo anterior, la biodegradación de HTP en lasbiopilas no estuvo limitada por la presencia de microorganismos,ya que las cuentas microbianas (UFC) a lo largo de los 210 días seincrementaron, con respecto a la cuenta inicial (Tabla 4).Esto indica también que los factores ambientales durante estetiempo fueron adecuados para mantener la microflora activa en las

biopilas. La recalcitrancia de los compuestos presentes en lamezcla de hidrocarburos puede ser otro factor que se encuentrelimitando la biodegradación, ya que desde el inicio hastael tiempo final demuestreo (210 días) se encontró un elevadocontenido de asfaltenos (mayor a 30 %) en las cuatrounidadesexperimentales. Estos compuestos son hidrocarburos conestructuras moleculares sumamente complejas, conformados pordiferentes proporciones de nitrógeno, azufre y oxígeno; se hademostrado que su biodegradación es un proceso que ocurre enproporciones muy bajas, e incluso se reporta que no sonsusceptibles a la degradación microbiana (Pineda-Flores yMesta- Howard, 2001).

FITORREMEDIACION.

La presencia del combustóleo en el suelo redujosignificativamente el crecimiento y desarrollo de Pcocc, mientrasque la fertilización (tratamiento FInor y Forg) estimulósignificativamente (p≤0.001) la altura de las plantas desde los 70d, con respecto a plantas testigo (NoF) en SC (Figura 1). Estosefectos se mantuvieron hasta los 90 d, cuando la FInor en SCprodujo alturas semejantes a la de plantas en SNC (Cuadro 1).

La fertilización en SC, particularmente con FInor, tuvo efectossignificativos (p≤0.05) en todas las variables de crecimiento,excepto para el peso seco de la parte aérea (Cuadro 1). Lasplantas en SC presentaron menor altura y MS comparado con plantasen SNC. La interacción condición del suelo×fertilización tuvoefectos significativos (p≤0.05) en todas las variables decrecimiento (Cuadro 1). Las plantas expuestas a SC tuvieron menorpeso seco total, el cual fue estimulado con FInor y comparable alde plantas en SNC (Figura2).

El combustóleo redujo 56% el peso seco total de Pcocc a los 90 d,lo cual corrobora el efecto negativo de los hidrocarburos delpetróleo en el crecimiento de las plantas reportado por Baker

(1970), Adam y Duncan (2003) y Quiñones-Aguilar et al. (2003).

Al aplicar FInor y FOrg, la MS de las plantas aumentó 150% y 90%,con respecto al testigo en SC. Así se muestra el efecto benéficode la fertilización en el crecimiento de plantas establecidas ensuelos contaminados, como se reportó para gramíneas (Hutchinson etal., 2001; Anderson et al., 2002). Sin embargo, pocos estudios hanevaluado leguminosas con importancia agrícola en fitorremediación(Wiltse et al., 1998;Robson et al., 2003; Merkl et al., 2005). Elpresente estudio es uno de los primeros reportes sobre laadaptación de Pcocc en SC y respuesta positiva a la FOrg o FInor.

Con respecto al análisis microbiológico de la rizósfera, lacondición del suelo, fertilización y la interacción de ambosfactores no tuvieron efectos significativos en la población debacterias y hongos filamentosos totales (Cuadro 2). Para lasbacterias de vida libre-fijadoras de N atmosférico (BFN), lacondición de suelo y la interacción condición desuelo×fertilización tuvieron efectos significativos (p≤0.05).Para bacterias tolerantes a hidrocarburos, el factor

fertilización (p≤0.01) y la interacción condición delsuelo×fertilización (p≤0.05) fueron significativos. La poblaciónde hongos tolerantes fue afecta- da significativamente por lainteracción condición de suelo×fertilización (p≤0.05).

Al comparar las poblaciones microbianas de la rizósfera con lasdel suelo sin planta, sólo la población de hongos tolerantes fuemayor en presencia de Pcocc (Cuadros 2 y 3). La población de BFNfue menor en presencia de Pcocc comparado con el suelo sin planta(Cuadros 2 y 3). No hubo diferencias significativas en laspoblaciones microbianas entre el SNC y el SC sin planta (Cuadro3).

Típicamente, los hidrocarburos estimulan la población microbianaen el suelo (Atlas, 1995; Van Hamme et al., 2003), y ésta aumentasignificativamente en la rizósfera (Kim et al., 2005). Lo anteriores contrario a lo observado en el presente estudio para bacteriasy hongos totales, cuya población no presentó diferenciassignificativas entre tratamientos, excepto la población de BFNque fue mayor en la rizósfera de SC con FOrg.

Además, la población de microorganismos rizosféricos fue similar ala observada en SC sin planta. Este efecto puede estar relacionado

con la estimulación de la población microbiana cuando loshidrocarburos son recién derramados en el suelo (Atlas,1995),misma que se atenúa al aumentar el tiempo de exposición alcontaminante. Dicha reducción en la estimulación microbianapuede relacionarse con el aumento de la relación C:N, causandoque el N sea limitante para plantas y microorganismos (Adam yDuncan, 2003).

La proliferación de bacterias que fijan N atmosférico puede serimportante en la dinámica del N en el suelo durante lafitorremediación (Adam y Duncan,2003). En el presente estudiola población de BFN fue estimulada principalmente por larizósfera. Pero ni en SC ni en SNC se detectaron nódulosradicales de Rhizobium, indicando que las rizobias compatibles aPcocc están limitadas en el suelo muestreado.

La degradación del combustóleo en la rizósfera fue estimulada alaplicar FOrg o FInor (Figura 3C-D). El beneficio de lafertilización en SC se relaciona con la estimulación delcrecimiento de plantas y microorganismosrizosféricos,contribuyendo en la degradación del contaminante (Anderson et al.,1993; Ferrera-Ce- rrato y Alarcón, 2004; Pilon-Smits, 2005).La sola presencia de Pcocc no influyó en la degradación delcombustóleo (Figura 3A-B) en comparación con los tratamientosfertilizados (Figura 3C-D). Esto denota la importancia deaplicar fertilizantes en plantas como Pocc, cuya capacidad detolerar la contaminación por hidrocarburos se había evaluado(Sangabriel et al. 2006), para facilitar la degradación de loscompuestos contaminantes en su rizósfera, como se mostró en esteestudio.

El combustóleo está constituido por una mezcla compleja dehidrocarburos: parafinas (n-alcanos, al- canos ramificados,cicloalcanos), compuestos alquilmonoaromáticos (tolueno,etilbenceno), poliaromáticos (PAH; fenantreno, pireno, naftaleno,etcétera); y compuestos con N y azufre (Yender et al.,2002). Los PAH son muy insolubles, poco degradables y por tanto

muy persistentes en el ambiente, y presentan gran afinidadpor los tejidos grasos lo que favorece su bioacumulación ypermanencia por muchos años (Neff et al., 2000).

Mediante análisis de GC-MS se ha identificado la presenciade compuestos orgánicos derivados del combustóleo en SC,destacando los hidrocarburos monoaromáticos (3,4-dimetiltiofeno) ypoliaromáticos (naftaleno y sus derivados), descritos porSangabriel et al. (2006).

En el presente estudio la biodegradación del combustóleo fueestimulada por la FOrg y FInor lo cual contribuyó a disminuir laproporción de los hidrocarburos aromáticos en el suelocontaminado. La pro- porción de los hidrocarburos 3,4-dimetiltiofeno, 1,2- dihidro-1-fenilnaftaleno, 1-fenilnaftaleno,y 1-metil-2- fenil-1H-indol, reportados inicialmente en elmismo SC (Sangabriel et al., 2006), disminuyó después deltratamiento.

No todos los hidrocarburos se degradan con la misma facilidadporque la tasa de biodegradación disminuye con el aumento del pesomolecular y la complejidad de los hidrocarburos, y esinversamente proporcional al número de anillos y de sustituciones.Los más volátiles son los hidrocarburos monoaromáticos y sudisminución es notable en el proceso de degradación natural,llegando incluso a desaparecer (Wang y Fingas, 1994).

La planta Pocc se cultiva en la zona donde se produjo el derrameaccidental, por lo que puede con- tribuir a largo plazo en ladesaparición del contaminante. No obstante, la fertilizaciónpuede estimular la rápida desaparición del combustóleo. Ennuestro entendimiento, este estudio es uno de los primerosreportes de fitorremediación utilizando Pcocc.

CONCLUSION (PSEUDOMONAS)

El éxito de la biorremediación en derrames de petróleo depende dela disponibilidad de los microorganismos adecuados, los factoresambientales y la composición del aceite derramado.

En relación con la metodología empleada en el estudio, variosautores coinciden en que la selección de microorganismos a travésde pruebas sucesivas de crecimiento poblacional en cultivos purosenriquecidos con petróleo, es considerada como una estrategiaeficiente para evaluar la adaptación y supervivencia de cepastolerantes a elevadas concentraciones de petróleo.

Así mismo, los resultados de esta investigación representanimportancia al considerar que se asemejan a lo expuesto porRuberto et al., 2003 y Narváez 2006 , quienes así mismo reportaronque el grupo predominante en los aislamientos fueron los bacilosGram negativos. Estos, tienen una ventaja amplia frente a lasbacterias Gram positivas, debido a que son consideradosimportantes degradadores de hidrocarburos por la presencia delipopolisacaridos en su membrana, que facilitan la formación yestabilización de emulsiones de hidrocarburos en sistemas acuososy contribuyen al incremento en la superficie de ataque delcontaminante.

Las comunidades microbianas en áreas contaminadas son dominadaspor los organismos capaces de utilizar o sobrevivir a compuestostóxicos, como los ambientes contaminados con hidrocarburos, tal esel caso del género Pseudomona.

La Pseudomona aeruginosa ha sido identificada como un génerodestacado en diversos procesos de degradación y es la que conmayor frecuencia se aísla de ambientes contaminados conhidrocarburos.

CONCLUSION. (COMPOSTEO)

• En el presente estudio se demostró que el empleo de tratamientosque favorecen la desorción de hidrocarburos, incrementansignificativamente la biodegradación. Todos los pretratamientosfisicoquímicos utilizados, favorecieron la biodegradación dehidrocarburos del petróleo e incrementaron las velocidades dedegradación en comparación con un suelo sin pretratamiento.

• El incremento en la biodegradación de hidrocarburos en lasbiopilas pretratadas fisicoquímicamente puede atribuirse a unincremento en la biodisponibilidad de los contaminantesinicialmente sorbidos en el suelo. La menor degradación dehidrocarburos obtenida para la biopila sin pretratar, puedeatribuirse a una baja biodisponibilidad de los contaminantes.

• Con base en la biodegradación de los hidrocarburos, lospretratamientos más eficientes después de 7 meses de composteo,fueron el electroquímico y el adicionado con surfactante,obteniéndose niveles de degradación de 48 y 46%, respectivamente.

CONCLUSION. FITORREMEDIACION.

Phaseolus coccineus tiene potencial de uso en la fitorremediación desuelos contaminados; además, la fertilización orgánica einorgánica contribuyó en la reducción de los hidrocarburos en larizósfera. El efecto negativo del hidrocarburo en el crecimientode Pcocc fue compensado con la FInor y la FOrg, mientras que lapoblación microbiana de la rizósfera contaminada fue parcialmenteestimulada por la planta o por la fertilización.

CONCLUSION GENERAL.

En base a los resultados obtenidos, de las tres técnicas el másefectivo fue el tratamiento por composteo, ya que en ella sepudieron obtener degradaciones muchos mayores frente a las otrastécnicas, y esto se demuestra en base a las gráficas y el análisisque se hizo por cada una de las técnicas. Aunque también tenemosque reconocer que las otras dos técnicas son bastantes buenas yaque se aisló y se identificó una especia de bacteria Pseudomonaaeruginosa que tiene como características de utilizar o sobrevivir acompuestos tóxicos, como los ambientes contaminados conhidrocarburos.

BIBLIOGRAFIA

c) Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental,CENICA 2002

d) http://www.dof.gob.mx/nota_detalle.php? codigo=5313544&fecha=10/09/2013

e) http://congress.cimne.com/zns09/admin/files/filepaper/ p422.pdf

f) http://www.diariozonasur.com/noticia/Incide-Refineria-en- Altos-Indices-de-Mortalidad.htm

g) http://www.inecc.gob.mx/calaire-informacion-basica/554- calaire-lluvia-acida

h) http://www.dof.gob.mx/nota_detalle.php? codigo=5313544&fecha=10/09/2013

i) http://congress.cimne.com/zns09/admin/files/filepaper/ p422.pdf