LAPORANPRAKTIKUM PEMISAHAN DAN PENGUKURAN

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN KAFEINDENGAN TEKNIK HPLC

Diajukan untuk memenuhi mata kuliah Praktikum Pemisahan danPengukuran

Dosen Pengampu :Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si

Disusun oleh : Hesti Kusumaningtyas (1307031) Ida Khoerunnisah (1302021) Ikhlas Fathurohman (1301508)

Jurusan Pendidikan KimiaFakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIABANDUNG2014

Tanggal Praktikum : 17 Februari 2015

Judul Praktikum :

Penentuan Kadar Paracetamol dan Kafein dengan Menggunakan

Metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

1. Tujuan

1.1 Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC

1.2 Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat ,

serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC.

1.3 Dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dan

kafein dalam sampel obat.

2. Tinjauan Pustaka

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan

tipe kromatografi elusi yang paling serbaguna dan digunakan

secara luas. Teknih ini digunakan oleh para kimiawan untuk

memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam berbagai bahan

atau senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun

material biologis. Pada kromatografi cair, fasa gerak

merupakan pelarut cair berisi sampel yang berupa campuran

dari bahan-bahan terlarut. Jenis-jenis kromatografi cair

1

kinerja tinggi (HPLC) biasanya dikelompokkan oleh mekanisme

pemisahannya ataupun jenis

fasa diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:

a) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair

b) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair

c) Penukar Ion atau Kromatografi Ion

d) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi

Ukuran)

e) Kromatografi Afinitas

f) Kromatografi Kiral

Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja

tinggi, yaitu elusi isokratis dan elusi gradien. Elusi yang

menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau

campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap

disebut elusi isokratik. Sedangkan pada elusi gradien,

digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu sistem

yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan.

Perbandingan dari kedua atau lebih pelarut ini divariasikan

melalui cara yang telah ditentukan dengan program saat

pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang

dilakukan secara terus-menerus dan kadang secara bertahap.

Elusi gradien seringkali meningkatkan efisiensi pemisahan,

seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC

modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan

sehingga dapat memasukkan cairan dari dua atau lebih

2

reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara

terus menerus.

(Skoog, 2004: 973-977)

Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa

gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi

pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven

yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat

umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah

(reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang

karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankandan

mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan

1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama

untuk KCKT/HPLC yang menggunakan pompa bolak

balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila

3

detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang

terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan

yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh

tidak dapat digunakan (the data may be useless).

Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila

menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara

(contoh :kolom berikatan dengan NH2).

(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)

Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:

Reservoir (wadah pelarut / cairan)

Pompa

Sistem injeksi sampel

Kolom, terdiri dari

1. Kolom Analitik / Kolom Utama

2. Kolom Guard

3. Termostat

Detektor

Komputer (Pengolah data)

4

Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan

yang akan digunakan dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut

berupa pelarut. Masing-masing reservoir dihubungkan kepada

katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur

cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.

Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang

menggunakan pompa. Pelarut dipompa dari reservoir sehingga

dapat membawa sampel menuju kolom. Pompa yang digunkan dalam

HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut:

1) Harus memiliki aliran terkontrol yang ‘reproducible’

2) Harus menghasilkan aliran yang ‘pulse-free’ (bebas

pulsa, tidak menghasilkan gelembung)

3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil

(R.P. Budhiraja, 2004: 172)

Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi,

mustahil sampel dapat diinjeksikan dengan cara yang sama

5

seperti pada kromatografi gas. Maka dari itu, sampel

dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat

diganti dan tersedia pada volume 0,5 mikroliter sampai 2

mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari

fasa gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Sebuah syringe

dengan kapasitas beberapa kali dari loop sampling digunakan

untuk menempatkan sampel kedalam loop.

Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari

stainless steel dengan diameter internal antara 2,1 mm dan

4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30 mm sampai 300

mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-

partikel silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau

spherical. Kolom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan

berlangsung.

Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik

berkurang masa hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat

fasa diam secara irreversibel menurunkan performa kolom

karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua,

material partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat

menyumbat kolom analitik. Maka dari itu, kolom guard

ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi

masalah-masalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi

material partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan

kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah.

Panjangnya 7,5 mm dan harganya satu persepuluh dari kolom

6

analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard digunakan sebagai

“tumbal” dan diganti secara berkala.

Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju

detektor. Detektor ini berfungsi untuk memberikan sinyal

sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor-

detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:

Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)

Detektor elektrokimia

Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran

pada perubahan index refraksi dari fasa gerak, namun kurang

berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-komponen fasa

gerak memiliki index refraksi yang mirip.

(Harvey David, 2000: 578-585)

Keuntungan KCKT/HPLC

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas

(KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan

untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila

derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat

yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat

yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah

pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT

menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih

besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga

7

menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan

untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya

digunakan.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan

kromatografi cair klasik, antara lain:

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak

analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk

analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis

kurang dari 5 menit bisa dicapai

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai

dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG,

gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;

pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa

diam dan fasa gerak

pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai

pemisahan yang diinginkan.

Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa

digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah

nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-

detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi

jumlah sampai picogram(10-12 gram). Detektor-detektor

seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri,

dll dapat juga digunakan dalam KCKT

8

Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom

kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali

(reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan

kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi,

kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal

untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat yang

tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah

, biasanya diderivatisasi untuk menganalisi spsesies ionik.

KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk

mengalissis zat –zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam

KCKT tidak menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen

sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel

tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati

detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan

ksecuali untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur

khusus.

(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)

Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-

cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan

maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan

teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak

analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area

standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan

data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh

9

karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan

teknik kurva kalibrasi.

Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama

sama dalam satu tablet obat yang memiliki sifat kepolaran

berbeda. Gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa

ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini

memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom

nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar campuran beberapa

pelarut.

(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)

Paracetamol

Paracetamol secara luas digunakan untuk obat yang diperuntukan sebagai penawar rasa sakit, demam(mengurangi temperature). Tindakan ini dikenal sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol murni berbentuk kristal padat yang meleleh pada suhu 167-171 . Daya larut dalam air dingin adalah 1,43 g/100 cm3,

tetapi jauh lebih larut dalam air panas yakni 5 g/100 cm3 dan dalam etanol kelarutannya 14 g/100 cm3.

(Frank Ellis dkk, 2002: 1)

Kafein

10

Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa

heterosiklik yang majemuk, yang merupakan kondensasi

antara lingkar imidazol dan lingkar pirimidin). Dengan

rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam biji-biji kopi

dan daun teh. Kristal kafein berbentuk jarum-jarum

berwarna putih, tidak berbau, dan berasa pahit. Kafein

yang tidak mengandung kristal mencair pada suhu 238 .

Kafein larut dalam larutan pirol dan tetrahidrofuran.

Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya asam-

asam organik.

(Damin Sumardjo, 2009: 447)

Asetonitril

Metil Sianida CH3CN, zat cair toksik, disediakan dari

asetilena dan amonia atau oleh dihidrasi asetamida,

digunakan untuk melarutkan senyawa organik ataupun

anorganik.

11

(Hadyana Pudjaatmaka, 2002: 76)

Isopropil Alkohol

Propil Alkohol mempunyai rumus CH3CH2CH2OH . Isopropil

alkohol merupakan isomer propil alkohol dengan rumus

(CH3)2CHOH. Banyak digunakan untuk membuat minyak wangi,

pelitur dan sebagai pelarut.

(Hadiat Moejadi,dkk, 2004: 179)

12

Alat dan Bahan Praktikum

2.1 Alat Praktikum

Perangkat HPLC 1 set

Spatula 1 buah

Labu ukur 50 mL 1 buah

Labu ukur 10 mL 6 buah

Neraca analitik terkalibrasi 1 set

Corong pendek 1 buah

Pipet tetes 2 buah

Gelas kimia 50 mL 3 buah

Ultrasonic vibrator 1 set

Pipet Ukur 1 ml 1 buah

Pipet Ukur 2 ml 1 buah

Pipet Ukur 3 ml 1 buah

Pipet Ukur 4 ml 1 buah

Pipet Ukur 5 ml 1 buah

Pipet Ukur 6 ml 1 buah

Ball Filler 1 buah

Filter Membran Selulosa Nitrat 1 set

Botol Vial 2 buah

2.2 Bahan Praktikum

Parasetamol p.a 25 mg

Kafein 12,5 mg

Asetonitril 30 ml

KH2PO4 420 ml

Iso propil alkohol 30 ml

13

Metanol secukupnya

Sampel obat Bodrex 4,1 mg

Aquades secukupnya

Aquabides secukupnya

Membran PTFE/selulosa nitrat buah

Kertas saring 1 buah

3. Prosedur Kerja Praktikum

3.1Pembuatan fasa gerak (Pelarut).

Sebanyak 420 mL KH2PO4- 0,01 M, ditambahkan metanol 20

mL, ditambahkan asetonitril 30 mL, ditambahkan

isopropil alkohol 30 mL, disaring menggunakan membran

whatman filter PTFE 0,2 μm, disonikasi selama 30 menit.

(Larutan Fasa Gerak sudah tersedia)

3.2 Pembuatan larutan induk parasetamol

Ditimbang seksama sejumlah 25 mg Parasetamol p.a

dan 12,5 mg kafein p.a dimasukkan kedalam labu 50

mL

Tambahkan pelarut sebanyak 20 mL, disonikasi

selama 15 menit, diencerkan dengan pelarut hingga

garis tanda batas..

Hitunglah konsentrasi larutan induk untuk

parasetamol dan kafein

3.3 Pembuatan deret larutan standar parasetamol + kafein

14

Pipet larutan induk parasetamol dan kafein masing-

masing sebanyak 1 ; 2 ; 3 ; 4 ;5 dan 6 mL,

masukkan ke dalam labu ukur 10 mL.

Tambahkan pelarut(fasa gerak yang tersedia)hingga

tanda batas

Lakukan sonikasi selama 5 menit.

Dilakukan degassing apabila masih terdapat gelembung

dalam larutan

Injeksikan ke sistem HPLC dengan volume penyuntikan

20 μl

Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi

3.4 Pembuatan larutan sampel obat bodrex

Tentukan berat rerata tablet(10 tablet)

Menimbang 4,1 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10

mL, ditambahkan pelarut(aquabides) hingga setengah

volume labu ukur), disonikasi selama 5 menit,

Encerkan dengan pelarut(aquabides) hingga garis

tanda, dikocok lalu disaring menggunakan kertas

saring

Dipindahkan ke dalam botol vial

Kemudian proses melakukan penyaringan kedua

menggunakan membran whatman PTFE 0,2 μm (filtrat

pertama dibuang(digunaakan untuk membilas

filter/injektor, kemudian ditampung filtrat

selanjutnya).

Injeksikan sampel obat ke dalam HPLC.

15

3.5 Penyiapan Instrumen HPLC

Kondisi Analisis parasetamol dan kafein

Fasa gerak : KH2PO4 0,01 M 420mL, 20 ml

metanol, 30 asetonitril 30 mL

isopropil alkohol

Kolom (fasa diam) : C-18 (15 cm)

Panjang gelombang : 215 nm

Laju alir : 1 mL/menit

Volume injeksi : 20 µL

Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung

dengan benar.

Tekan tombol “ON” pada sakelar listrik.

Isi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan

kosongkan botol penampung.

Tekan tombol “ON” pada alat, berturut-turut untuk

power, detektor dan pompa.

Lakukan pemrograman alat dengan computer.Ikuti

langkahnya sesuai instruksi dalam komputer.

Pilihlah mode yang akan digunakan sesuai dengan

parameter kondisi instrumen.

Alirkan fasa gerak.

Apabila respon kromatogram tidak muncul lagi,

artinya alat telah menunjukkan base line yang

mendatar, maka instrumen siap digunakan.

16

Injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai

dari konsentrasi terendah), dan terakhir larutan

sampel

Cetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya.

Setelah selesai digunakan, matikan pompa dengan

menyoroti tanda pompa dalam computer.

Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.

Untuk mematikan, tekan tombol “Off” pada pompa,

detector dan power secara berurutan. Putuskan

sambungan listrik.

3.6 Perhitungan hasil analisis

Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva

kalibrasi. Bila kurva kalibrasi diperoleh dengan

koefisien regresi > 0,997 anda boleh melanjutkan

perhitungan kadar parasetamol dalam sampel. Hitunglah

kadarnya dalam satuan % b/b. Bila tidak diperoleh

kurva yang linier, maka lakukan diskusi untuk mencari

penyebabnya.

17

Hasil dan Analisis Data

Tabel Penimbangan 1 Tablet Obat Bodrex

No Berat Setiap 1

Tablet Obat Bodrex1. 0,8321 g2. 0,8530 g3. 0,8407 g4. 0,8326 g5. 0,8350 g6. 0,8315 g7. 0,8418 g8. 0,8568 g9. 0,8321 g10.0,8427 g

Rat

a-

rat

a

0,84016 g

18

Sampel Obat

Diduga zat yang

terkandung

Waktu Retensi

(menit)

Luas

Area

Paracetamol 2.38

117052

88

Kafein 3.62

216412

8

Deret Standar Paracetamol

Konsentrasi

(ppm)

Luas

Area

Waktu Retensi

(menit)

50

225210

6 2.38

100

423908

5 2.38

150

620825

3 2.38

200

797907

2 2.38

250

100930

86 2.39

300

122615

50 2.38

19

Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan

sampel yang diduga paracetamol (11705288), berada pada

rentang deret standar paracetamol (10093086-12261550).

Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan

persamaan garis

y = 39646 x + 234188

Sehingga,

y = 39646 x + 234188

11705288 = 39646 x + 234188

x =

x = 289,3381 ppm

mg paracetamol = ppm V (L)

= 289,3381 ppm 0,01 L

= 2,8934 mg

Bobot sampel = 4,1 mg

Berat Rata- rata penimbangan obat bodrex = 840,16 mg

20

Kadar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan

Deret Standar Kafein

Konsentrasi

(ppm)

Luas

Area

Waktu Retensi

(menit)

25

216441

6 3.64

50

425240

0 3.62

75

624219

6 3.6

100

798948

4 3.58

125

100335

48 3.59

150

120977

07 3.56

21

Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel

yang diduga kafein (2164128) berada di luar rentang deret

standar kafein ( < 2164416), sehingga kadar kafein dalam

sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan

sampel, yaitu konsentrasi dan luas areanya.

=

[Sampel] =

[Sampel] =

[Sampel] = 24,9967 ppm

Mg kafein = ppm V (L)

= 24,9967 ppm 0,01 L

= 0,2500 mg

Kadar mg Kafein dalam Hasil percobaan

22

Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar

paracetamol dan kafein dalam sampel obat menggunakan

instrumen HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi

komponen-komponen dalam sampel di antara dua fase, fase

gerak dan fase diam. Fase gerak yang digunakan berupa

campuran senyawa KH2PO4, methanol, asetonitril, dan

isopropyl alkohol dengan perbandingan 42 : 2 : 2 : 3.

Sedangkan fase diam yang digunakan adalah kolom C-18 yang

bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini

menggunakan metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak

yang digunakan bersifat polar sedangkan fase diamnya

bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya

selama analisis digunakan fase gerak dengan perbandingan

pelarut yang tetap.

Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian

dilarutkan menggunakan aquabidest. Digunakan aquabidest

karena dalam analisis menggunakan HPLC diperlukan pelarut

dengan kemurnian yang tinggi, sebab larutan sampel yang akan

dianalisis jumlahnya sangat sedikit (sekitar 20µl) sehingga

23

apabila digunakan pelarut dengan kemurnian kurang akan dapat

mengganggu hasil pemisahan. Sebelum pengenceran sampel

sampai 10 ml, dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua

komponen dalam sampel larut dan homogen. Setelah diencerkan

sampai 10 ml secara kuantitatif, larutan sampel disaring

sebanyak dua kali. Penyaringan pertama dilakukan menggunakan

kertas saring kasar. Hal tersebut dilakukan karena dalam

obat tidak hanya mengandung paracetamol dan kafein, namun

terdapat zat penyusun lain yang belum larut seluruhnya yang

masih berupa partikel-partikel padat dalam larutan.

Selanjutnya filtrate disaring kembali menggunakan membran

selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa

ada partikel-partikel pengganggu /pengotor yang dapat

mempengaruhi hasil pemisahan. Apabila langsung dilakukan

penyaringan menggunakan membran selulosa nitrat,

dikhawatirkan partikel-partikel yang tidak larut dalam

larutan sampel akan menyumbat pori-pori membran sehingga

penyaringan akan membutuhkan waktu yang lama. Sebelum

ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang

dimaksudkan untuk membilas membran agar dapat dipastikan

tidak ada zat kontaminan dari membran yang dapat ikut

tertampung.

Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis

kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan

dengan membandingkan waktu retensi komponen dalam sampel

dengan waktu reteensi standar. Puncak yang akan muncul pada

kromatogram adalah puncak komponen paracetamol terlebih

24

dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan berdasarkan struktur

kimia dari masing-masing komponen.

Gambar Struktur Paracetamol

Gambar Struktur Kafein

Dapat dilihat bahwa paracetamol memiliki gugus hidroksi (-

OH) yang dapat membentuk ikatan hidrogen dengan air sehingga

lebih mudah larut dalam air atau senyawa polar lainnya

sedangkan kafein memiliki struktur yang relatif lebih non

25

polar dibandingkan dengan paracetamol sehingga akan tertahan

lebih lama di kolom yang sifatnya non polar.

Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar

paracetamol dan kafein dalam sampel berdasarkan luas area

puncak menggunakan metode kurva kalibrasi larutan derat

standar yang dibuat dari pengenceran 1-6 ml larutan induk

paracetamol 500 ppm dan kafein 250 ppm dalam 10 ml larutan.

Kadar analit dapat ditentukan dengan menghitung konsentrasi

analit menggunakan persamaan garis y = mx + b yang diperoleh

dari kurva kalibrasi deret standar. Namun, apabila luas area

puncak analit tidak masuk dalam area deret standar maka

digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret

standar dengan sampel.

Sebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus

dikondisikan pada keadaan optimal agar hasil pemisahan yang

didapatkan baik. Kemudian baik sampel maupun deret standar,

sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan degassing

untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara

dapat terkumpul di kepala pompa ataupun detektor sehingga

akan mengganggu kondisi HPLC.

Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar

paracetamol dan kafein dalam sampel obat masing-masing

sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil

tersebut mendekati data kadar yang tercantum pada kemasan

obat yaitu paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein

sebanyak 50 mg/tablet.

26

Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama

analisis pada percobaan ini di antaranya, masih terdapat

sisa sampel yang telah ditimbang yang tidak ikut dilarutkan

sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat, masih terdapat

gelembung setelah dilakukan penginjeksian, atau

pengoperasian instrument yang kurang tepat sehingga

mempengaruhi hasil kromatogram yang akan didapat.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan,

diperoleh kadar paracetamol dan kafein dalam sampel obat

masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293

mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang tercantum

pada kemasan obat yaitu paracetamol sebanyak 600 mg/tablet

dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.

Daftar Pustaka

Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New

Age International (p) Ltd.

David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New

York: McGraw-Hill

De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi Dalam Bidang Farmasi Jurnal, hlm. 5-8.

Ellis, Frank dkk. (2002). Paracetamol-a curicullum resource.United Kingdom :

Royal Society of ChemistryMoejadi, Hadiat. (2004). K amus S ains . Jakarta : Balai

Pustaka

27

Pudjaatmaka, Hadyana. (2002). Kamus Kimia. Jakarta : Balai

Pustaka

Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry.

USA: Thomson Brooks/Cole

Sumardjo, Damin. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah

Mahasiswa Kedokteran. Jakarta : EGC

Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2015).

Instruksi Kerja Penentuan Kadar Parasetamol dan Kafein

dengan Teknik HPLC. Bandung: UPI

28

Lampiran

Langkah Kerja & Tabel Pengamatan

No Langkah Kerja Data Pengamatan1. -Fasa Gerak

Sudah

disediakan

-Fasa Gerak : Cairan Tidak Berwarna

29

Pembuatan Fasa Gerak -diambil 420 mL KH2PO4 0,01 M pada gelas kimia- ditambahkan Metanol 20 mL- ditambahkan Asetonitril 30 mL- ditambahkan Isopropil Alkohol 30 Ml- disaring menggunakan membran

Fasa Gerak (Pelarut)

Paracetamol

Kafein

2. Pembuatan Larutan Induk Paracetamol &

Kafein

-Paracetamol : Serbuk berwarna putih keruh

-Kafein : Serbukberwarna putih keruh

-Fasa Gerak : Cairan tidak berwarna-Disonifikasi agar larutan menjadi homogen

-Larutan Induk Paracetamol + kafein : Tidak berwarna

- Konsentrasi Paracetamol : 500 ppm- Konsentrasi Kafein : 250 ppm

30

- ditimbang sebanyak

- ditimbang sebanyak

Kafein + Paracetamol

- keduanya dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL- ditambahkan pelarut (fasa gerak)- disonifikasi selama +/- 5 menit

Larutan Induk Kafein +

- disonifikasi selama 5 menit- dihitung konsentrasi larutan induk paracetamol & kafein

Konsentrasi Larutan

3. Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein

& Paracetamol

-disonifikasi agar homogen- didegasing dengan membuka tutup labu ukur,agar gelembung yg adadapat hilang- deret larutan standar = tidak berwarna

31

Larutan Induk Kafein +

- dipipet sebanyak 1ml;2ml;3ml;4ml;5ml;6ml- dimasukkan masing-masing ke dalam labu ukur 10 ml- ditambahkan pelarut (fasa gerak) hingga tanda batas- disonifikasi selama 5 menit

Deret Larutan Standar

- diinjeksikan larutan sebnayak 20 L

Kurva Kalibrasi

4. Pembuatan Larutan Sampel-Obat Bodrex : Serbuk Berwarna jingga- Data Sampel Obat pada kemasan mengandung paracetamol 800 mg dan kafein 50mg

-Rata-rata beratpenimbangan sampel obat = 0,84016 g-Berat Kertas Timbang = 0,1219 g- Hasil penimbangan Kertas Timbang +Sampel Obat = 0,1260 g- Massa Obat = 0,0041 g/ 0,41 mg- Pelarut = Aquabides

- Larutan sampelsaat penambahan hingga setengah volume labu ukur= berwarna jingga- Larutan sampelsaat ditanda bataskan = tidakberwarna

32

Serbuk Tablet Obat

- ditambahkan pelarut hingga setengah volume labu ukur- disonifikasi selama 5 menit- ditambahkan pelarut hingga tandabatas- dikocok

Labu Ukur 10 ml

- ditentukan berat rata-rata tablet obat- ditimbang sebanyak 4 mg

Hasil Filtrat

- ditampung dalam botol vial- disaring menggunakan membran selulosa nitrat- dimasukkan ke dalam ukur 10

Hasil Filtrat ke-2

- 1ml filtrat dibuang (digunakan untuk membilas injeksi, botol vial) - 1 ml berikutnya ditampung- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL

Sampel Siap untuk Diinjeksikan

5. Penyiapan Instrumen HPLC

Kondisi Analisis Paracetamol & Kafein

33

Fasa Gerak

- KH2PO4 0,01 M 420ml - 20 ml metanol- 30 ml asetonitril- 30 ml Iso Propil Alkohol

Kolom (Fasa Diam)- panjang 15 cm- C-18- panjang gelombang 215 nm- laju alir 1 ml/menit-Volume injeksi 20 L

Preparasi Sistem HPLC

- dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar- ditekan tombol “on” pada sakelarlistrik- diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan botol penampung- ditekan tombol on pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa-dilakukan pemrograman alat dengankomputer, ikuti langkahnya sesuai instruksi dalam komputer -dipilih mode yg akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumen- dialirkan fasa gerak- apabila respon kromatogram tidakmuncul lagi, artinya alat telah menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap digunakan

Analisis dilakukan oleh operator dan

Perhitungan

Pembuatan Larutan Induk

Larutan Induk

Larutan Deret Standar Paracetamol

a. 1 ml larutan induk

b. 2 ml larutan induk

c. 3 ml larutan induk

d. 4 ml larutan induk

e. 5 ml larutan induk

f. 6 ml larutan induk

34

Larutan Deret Standar Kafein

a. 1 ml larutan induk

b. 2 ml larutan induk

c. 3 ml larutan induk

d. 4 ml larutan induk

e. 5 ml larutan induk

f. 6 ml larutan induk

35

Lampiran Foto Selana Praktikum

1. Alat yang dibutuhkan

selama praktikum

2. Pelarut/ Fasa Gerak

3. Pelarut/ Aquabides

4. Instrumen HPLC

5. Instrumen HPLC tampak samping

6. Penimbangan Sampel untuk membuat larutan Induk dan Larutan sampel

7. Sampel Obat Bodrex

36

8. Data pnimbangan 10 tablet obat bodrex

9. Penambahan pelarut(aquabides/ fasa gerak)untuk membuat larutan induk,larutan sampel

10. Hasil pembuatan deret larutan standar 1 mL;2 mL; 3 mL;4 mL ;5 mL ; 6 mL

11. Hail penambahan pelarut (aquabides) pada sampel obat, hingga setengah volumeukuran labu ukur

12. Proses Sonifikasipada Ultrasonic Vibrator

37

13. Larutan Sampel Obat

14. Penyaringan Sampel Obat menggunakan kertas saring

15. Hasil Penyaringanmenggunakan kertas saring

16. Penyaringan keduamenggunakan membran selulosa nitrat

17. Hasil penyaringanmenggunakan membran selusosa nitrat

18. Penginkjeksian Deret larutan standar/Larutan sampel

19. Deret Larutan Standar/ Larutan sampel siap diinjeksikan, sudah tidak terdapat gelembung dalam syringe.

38

20. Proses Penginjeksian 21. Hasil Pemisahan

ditunjukan dalam bentuk kromatogram dalam komputer

39